kl le thanh tuan 072636s

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ACID AMINE VÀ POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHƠI VƠ TÍNH CÂY CỌC RÀO (JATROPHA CURCAS L.) NI CẤY IN VITRO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Ngành: Cơng Nghệ Sinh Học Chuyên ngành: Nông Nghiệp SVTH: LÊ THANH TUẤN MSSV: 072636S GVHD: TH.S ĐỖ ĐĂNG GIÁP TH.S TRẦN TRỌNG TUẤN TP HỒ CHÍ MINH – 2012 LỜI CẢM ƠN Trước tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Thạc sỹ Đỗ Đăng Giáp, Thạc sỹ Trần Trọng Tuấn, người tận tình hướng dẫn, góp ý, động viên, giúp đỡ em suốt trình thực khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại Học Tôn Đức Thắng, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học ứng dụng môn Công nghệ sinh học, tất thầy cô truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học trường, kiến thức nhận hành trang giúp em vững bước tương lai Em xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sinh Học Nhiệt Đới tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Kim Loan hướng dẫn tận tình, giúp đỡ, động viên em lúc em khó khăn, truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm, kỹ suốt q trình em thực khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn chị Huyền Trang, chị Phòng, bạn Thiên Tứ, bạn Thoan, bạn Ngọc Anh, bạn Hiền Trang, bạn Trường, bạn Hà, bạn Thư anh chị bạn phịng Thí nghiệm trọng điểm phía nam Công nghệ Tế bào thực vật – Viện Sinh học nhiệt đới tận tình bảo, giúp đỡ em suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Xin cảm ơn bạn Quốc Vinh, Như Vinh, Đức Tâm, Nguyễn Thuận, Chí Ty, Văn Trình, Long Vương bạn tập thể lớp 07SH2D chia sẻ vui buồn, khó khăn hết lịng giúp đỡ, hỗ trợ suốt trình học tập trình thực khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến ba, mẹ, anh, chị bên con, thương yêu con, động viên lúc khó khăn, chỗ dựa tinh thần cho con, tạo điều kiện tốt cho i TÓM TẮT Khảo sát ảnh hưởng acid amine polyamine đến khả phát sinh phôi vô tính Cọc rào từ mơ sẹo trình bày nghiên cứu Các mơ sẹo có khả phát sinh phơi vơ tính cấy chuyền vào mơi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung riêng lẻ acid amine polyamine nồng độ sau: proline (0,25 adenine sulphate (50 200 mg/l), tyrosine (50 1,00 g/l), glutamine (50 200 mg/l), 200 mg/l) spermidine (0,2 0,8 mM) Sau tuần nuôi cấy, ảnh hưởng acid amine polyamine cụ thể sau: Nồng độ proline 0,75 g/l cho hiệu tốt lên phát sinh phơi vơ tính với tần suất đạt 86,66%; nồng độ glutamine 150 mg/l cho tần suất phát sinh phôi cao với 83,33%; tần suất phát sinh phôi cao môi trường bổ sung adenine sulphate 76,67% với nồng độ 150 mg/l; nồng độ spermidine 0,4 mM cho hiệu phát sinh phôi cao với tần suất 100%; môi trường có bổ sung tyrosine khơng có hiệu phát sinh phôi Các phôi sau tái sinh từ mô sẹo tiếp tục khảo sát ảnh hưởng mơi trường khống (1/2 MS, MS, B5, White, WPM) đến khả tái sinh Môi trường B5 (Gamborg, 1968) cho kết tốt ưu với 100% tỷ lệ mẫu tái sinh sau tuần nuôi cấy Khảo sát ảnh hưởng NAA (0,5 2,0 mg/l) IBA (0,5 2,0 mg/l) bổ sung riêng lẻ vào môi trường nuôi cấy lên khả tái sinh từ phơi vơ tính Cọc rào ni cấy in vitro Kết thu cho thấy IBA nồng độ 1,5 mg/l bổ sung vào môi trường B5 cho hiệu cao với tần suất tái sinh đạt 100% sau tuần nuôi cấy ii MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách bảng vii Danh sách hinh viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa đề tài 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu Chương TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu Cọc rào 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Nguồn gốc phân bố 2.1.3 Đặc điểm sinh học 2.1.3.1 Đặc điểm hình thái 2.1.3.2 Đặc điểm sinh thái, sinh trường phát triển 2.1.4 Thành phân hóa học Cọc rào 2.1.5 Công dụng Cọc rào 2.1.5.1 Trong điều trị bệnh 2.1.5.2 Cọc rào nhiên liệu sinh học 2.1.5.3 Bảo vệ môi trường 10 2.1.5.4 Sử dụng làm phân bón thức ăn gia súc 10 2.1.6 Nhân giống 11 2.1.6.1 Phương pháp nhân giống truyền thống 11 2.1.6.2 Phương pháp nhân giống đại 12 iii 2.2 Giới thiệu phơi vơ tính 17 2.2.1 Khái niệm phơi vơ tính 17 2.2.2 Q trình phát sinh phơi vơ tính 18 2.2.2.1 Giả định hình thành phơi vơ tính 18 2.2.2.2 Bước đầu nuôi cấy cảm ứng tạo phơi vơ tính 19 2.2.2.3 Sự phát triển phơi vơ tính 21 2.2.2.4 Sự phát triển thành từ phơi vơ tính 22 2.3 Sự ảnh hưởng polyamine, acid amine nuôi cấy mô 22 2.3.1 Polyamine 22 2.3.2 Acid amine 26 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 29 3.1.1 Thời gian nghiên cứu 29 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 29 3.2 Vật liệu, nội dung phương pháp thực 29 3.2.1 Vật liệu 29 3.2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 29 3.2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 29 3.2.1.3 Môi trường nuôi cấy 30 3.2.1.4 Điều kiện nuôi cấy 30 3.2.2 Nội dung nghiên cứu 30 3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng proline lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 30 3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng glutamine lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 31 3.2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng adenine sulphate lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 31 3.2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng tyrosine lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 32 3.2.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng spermidine lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 32 iv 3.2.2.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng mơi trường khống lên hình thành tái sinh từ phơi vơ tính Cọc rào nuôi cấy in vitro 33 3.2.2.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ IBA, NAA lên hình thành từ phơi vơ tính Cọc rào ni cấy in vitro 33 3.3 Chỉ tiêu theo dõi 34 3.4 Phân tích xử lý số liệu 34 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng proline lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 35 4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng glutamine lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào ni cấy in vitro 39 4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng adenine sulphate lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào ni cấy in vitro 42 4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng tyrosine lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào ni cấy in vitro 45 4.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng spermidine lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào ni cấy in vitro 48 4.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng mơi trường khống lên hình thành từ phơi vơ tính Cọc rào ni cấy in vitro 51 4.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng IBA NAA lên hình thành rễ tái sinh từ phơi vơ tính Cọc rào ni cấy in vitro 53 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57 5.1 Kết luận 57 5.2 Đề nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 63 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ½ MS : Mơi trường MS với khống đa lượng giảm ½ vi lượng giữ ngun 2,4 D : 2,4 dichlorophenoxyacetic acid ABA : Abcisic acid B5 : Môi trường Gamborg cộng (1968) BA : benzynadenine BAP : N6 benzylaminopurine CW : Coconut water (nước dừa) DCHA : Dicyclohexylammordum sulfate DFMA : α-difluoromethylarginine FW : Fresh weight GA3 : Gibberellic acid IAA : Indole acetic acid IBA : Indole butyric acid IEDC : Induced embryogenic determined cell MGBG : Methylglyoxal bis guanylhydrazone MS : Môi trường Murashige Skoog (1962) NAA : α naphthaleneacetic acid PEDC : Pre embryogenic determined cell PEM : Proembryogenic mass TDZ : Thidiazuron (N phenyl N’ 1,2,3 thidiazol ylurea) White : Môi trường White (1962) WPM : Môi trường Woody Plant Medium (Lloyd Mc Cown, 1980) vi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng proline 31 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng glutamine 31 Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng adenine sulphate 32 Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tyrosine 32 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng spermidine 33 Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng loại mơi trường nuôi cấy 33 Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ IBA 34 Bảng 4.1 Ảnh hưởng proline lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 35 Bảng 4.2 Ảnh hưởng glutamine lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 39 Bảng 4.3 Ảnh hưởng adenine sulphate lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 43 Bảng 4.4 Ảnh hưởng tyrosine lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 46 Bảng 4.5 Ảnh hưởng spermidine lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 48 Bảng 4.6 Ảnh hưởng mơi trường khống khác lên hình thành từ phơi vơ tính Cọc rào nuôi cấy in vitro 52 Bảng 4.7 Ảnh hưởng IBA NAA lên hình thành rễ tái sinh từ phơi vơ tính Cọc rào nuôi cấy in vitro 54 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH Trang Hình 2.1 Cây Cọc rào (Jatropha curcas L.) Hình 2.2 Một số hình ảnh Jatropha Curcas L Hình 4.1 Ảnh hưởng proline lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 36 Hình 4.2 Ảnh hưởng glutamine lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 41 Hình 4.3 Ảnh hưởng adenine sulphate lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 44 Hình 4.4 Ảnh hưởng tyrosine lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 47 Hình 4.5 Ảnh hưởng spermidine lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào 50 Hình 4.6 Ảnh hưởng mơi trường khống, IBA NAA lên hình thành rễ tái sinh từ phơi vơ tính Cọc rào 56 viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong tình hình khủng hoảng lượng nay, nước giới tìm nguồn lượng có khả tái tạo để thay phân nguyên liệu từ dầu mỏ Mỹ, Trung Quốc với nhu cầu khổng lồ lượng dầu mỏ, nước đứng đầu giới đầu tư nghiên cứu sản xuất lượng khơng truyền thống có nhiên liệu sinh học Dựa điều kiện tự nhiên xã hội mình, nước phát triển loại nhiên liệu khác như: Đỗ tương, Dầu cọ, Hướng dương, Cải dầu,… Khoảng 10 năm trở lại đây, nhiều nước giới có nước khu vực châu Á, đặc biệt Việt Nam nước quan tâm nghiên cứu phát triển Cọc rào để sản xuất biodiesel Trồng Cọc rào chống sa mạc hóa, mang lại việc làm cho người nghèo Cây Cọc rào có ý nghĩa kinh tế môi trường xã hội cao Bản thân Cọc rào tự nhiên sinh trưởng mạnh, nhân giống hạt giâm cành dễ Nhưng nhân giống in vitro lại gặp nhiều khó khăn mà lại khâu quan trọng công tác giống để góp phân nâng cao suất hạt Tuy nhiên, nhân giống in vitro Cọc rào đạt số kết định Hiện dừng mức nhận hoàn chỉnh từ chồi ngọn, chồi nách tái sinh nuôi cấy từ lớp mỏng tế bào số Cọc rào đầu dịng Phơi vơ tính xem kỹ thuật mang lại nhiều hiệu cao nhân giống trồng, cho phép tái sinh từ tế bào đơn ban đầu, trì tính đồng dòng tế bào tránh tượng biến dị di truyền Hơn 200 loài nhân giống phơi vơ tính Thơng thường phơi vơ tính phát sinh mơi trường bổ sung chất điều hịa sinh trưởng Gần đây, ứng dụng số chất oligosaccharide, jasmonate, polyamine, acid amine brassinosteroid cho thấy lợi ích phát sinh phôi từ số loại thực vật Chính vậy, chúng tơi thực đề tài “Khảo sát ảnh hưởng số acid amine polyamine lên hình thành phơi vơ tính Cọc rào (Jatropha curcas L.) ni cấy in vitro” nhằm hình thành hướng mới, tạo nguồn phơi vơ tính để phục vụ cho nghiên cứu xa công tác cải tạo giống loài Bảng 4.6 Ảnh hưởng mơi trường khống khác lên hình thành từ phơi vơ tính Cọc rào ni cấy in vitro MT khống 1/2MS MS B5 WHITE WPM Tỷ lệ hình thành rễ (%) 80,00a 93,33a 100,00a 86,67a 93,33a Số lượng rễ Chiều dài rễ (cm) Trọng lượng rễ (g) Chiều cao (cm) 1,00c 3,33b 4,07a 2,87b 3,07b 0,54d 1,57b 2,02a 1,28c 1,44bc 0,0028d 0,0132b 0,0175a 0,0104c 0,0117bc 1,29c 2,13ab 2,38a 2,11ab 1,93b Kết từ bảng 4.6 cho thấy mơi trường khống khác có hình thành rễ khác Ở tất môi trường nuôi cấy, tỷ lệ hình thành rễ từ phơi vơ tính đạt tương đối cao từ 80% đến 100%, nhiên khơng có khác biệt ý nghĩa thống kê nghiệm thức Trên môi trường B5, có hình thành rễ phát triển tốt hẳn so với mơi trường khống khác với số lượng rễ, chiều dài rễ, lượng rễ chiều cao đạt cao Môi trường MS WPM cho thấy có hiệu việc thúc đẩy hình thành rễ phát triển con, nhiên rễ hình thành mơi trường ngắn bị yếu so với rễ hình thành mơi trường B5 Như vậy, mơi trường khống B5 mơi trường khống thích hợp cho hình thành rễ phát triển từ phơi vơ tính Cọc rào ni cấy in vitro Đã có nhiều báo cáo cho thấy hiệu thành phần mơi trường khống lên tái sinh loài thực vật khác (Kai cộng sự, 2008; Haliliglu cộng sự, 2006; Pretto Santarem, 2000; Don Palmer Keller, 2011) Môi trường MS, B5 WPM loại mơi trường khống thơng dụng dụng rộng rãi nuôi cấy tái sinh nhiều loài thực vật, đặc biệt lồi thân gỗ Trong thí nghiệm này, môi trường B5, MS WPM cho tỷ lệ hình thành rễ phát triển đạt cao Kết tương tự công bố Hojat Moradkhani (2012), Zhang cộng (2004) hai đối tượng Melissa officinalis L Isatis indigotica nuôi cấy môi trường MS, B5 WPM cho tỷ lệ tái sinh cao Khi so sánh mơi trường khống MS, B5 WPM, hàm lượng photpho canxi tương đồng hàm lượng nitơ lại có khác biệt Hàm 52 lượng nitơ tổng WPM (14,7 μM) thấp B5 (27,03 μM) MS (60,03 μM) (Shi cộng sự, 2000) Điều cho thấy hàm lượng nitơ tổng yêu tố quan trọng có ảnh hưởng đến tái sinh Knittel cộng (1991) hàm lượng nitơ bổ sung đóng vai trị định tái sinh chồi từ nuôi cấy mầm hoa Hướng dương Trong thí nghiệm này, mơi trường tái sinh từ phơi vơ tính Cọc rào mơi trường khống B5, điều cho thấy nhu cầu hàm lượng nitơ tổng Cọc rào khơng địi hỏi cao mơi trường MS không thấp môi trường WPM Kết hoàn toàn phù hợp với báo cáo Warakagoda Subasinghe (2009) đối tượng Cọc rào cho môi trường B5 môi trường tối ưu cho nảy mẩm sớm tăng trưởng tốt hạt Cọc rào mơi trường MS, B5 WPM 4.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng IBA NAA lên hình thành rễ tái sinh từ phơi vơ tính Cọc rào nuôi cấy in vitro Auxin chất điều hòa sinh trưởng thực vật thiết yếu trình hình thành rễ bất định (Wiesmal cộng sự, 1998) trình phát sinh rễ thực vật có thay đổi nồng độ auxin nội sinh (Heloir cộng sự, 1996) Nồng độ auxin nội sinh cao có liên quan đến tỷ lệ hình thành rễ cao bắt đầu trình hình thành rễ (Blazkova cộng sự, 1997; Caboni cộng sự, 1997) Auxin chất có ảnh hưởng lên hình thành rễ bất định số loại thực vật thân gỗ (de Klerk cộng sự, 1999; Diaz sala cộng sự, 1996; Goldfarb cộng sự, 1998; Selby cộng sự, 1992) Auxin ethylene thường biết đến chất hoạt hóa hình thành rễ, cytokinine gibberellins lại kìm hãm trình Sự hình thành rễ bất định bước cần thiết phương pháp nhân nhanh thực vật nhiều loại thực vật thân gỗ, điều có liên quan đến có mặt auxin mơi trường ni cấy (Kim cộng sự, 1998; McClelland cộng sự, 1990) Phơi vơ tính Cọc rào ni cấy in vitro cấy chuyền vào mơi trường có bổ sung NAA IBA theo nồng độ khác Sau tuần ni cấy, phơi vơ tính bắt đầu hình thành rễ dần phát triển thành hoàn chỉnh Các tiêu ghi nhận lại bảng 4.7 53 Bảng 4.7 Ảnh hưởng IBA NAA lên hình thành rễ tái sinh từ phơi vơ tính Cọc rào ni cấy in vitro Nghiệm thức Tỷ lệ hình thành rễ (%) Số lượng rễ Chiều dài rễ (cm) Trọng lượng rễ (g) Chiều cao (cm) R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 86,67b 93,33ab 100,00a 100,00a 100,00a 93,33ab 100,00a 100,00a 100,00a 3,47c 3,73bc 3,93bc 4,20ab 4,13ab 3,67bc 4,00abc 4,53a 4,00abc 1,62g 1,83fg 2,13de 2,58b 2,37bcd 1,99ef 2,32cd 3,02a 2,45bc 0,014g 0,016fg 0,019de 0,023bc 0,021cd 0,017ef 0,021cd 0,027a 0,024b 2,31f 2,36f 2,56de 3,03b 2,77c 2,45ef 2,62cd 3,23a 2,96b Theo bảng 4.7 ta nhận thấy rằng, phơi vơ tính cấy vào mơi trường có bổ sung NAA IBA cho tỷ lệ hình thành rễ đạt cao từ 93,33 100% Sự hình thành rễ phát triển mơi trường có bổ sung NAA, tiêu khơng có khác biệt nghiệm thức Trên mơi trường có bổ sung IBA số lượng rễ, chiều dài rễ, trọng lượng tươi trung bình rễ, chiều cao trung bình đạt cao nồng độ 1,5 mg/l có khác biệt có ý nghĩa với nồng độ có tiêu thấp 2,0 mg/l 1,0 mg/l Như môi trường nuôi cấy bổ sung IBA nồng độ 1,5 mg/l mơi trường thích hợp cho hình thành rễ phát triển từ phơi vơ tính Cọc rào ni cấy in vitro IAA auxin sử dụng để kích thích hình thành rễ (Copper, 1935) Khơng lâu sau đó, IBA phát auxin có hiệu tích cực lên phát sinh rễ thực vật (Zilmerman Wilcoxon, 1935) Ngày nay, IBA sử dụng rộng rãi cho hình thành rễ thực vật có hiệu IAA (Epstein Ludwig Muller, 2003) Những nghiên cứu trước tái sinh nuôi cấy Cọc rào Jha cộng (2007) sử dụng môi trường nuôi cấy bổ sung adenine sulphate, kinetine IBA để thành thục hóa phơi vơ tính, nhiên tỷ lệ phôi thành thục đạt 50% tái sinh từ phơi vơ tính đạt 20% sau tuần ni cấy Cịn báo cáo Shang cộng (2012) đối tượng Cọc rào, tỷ lệ phơi thành thục đạt cao 77,8% tỷ lệ tái 54 sinh từ phơi vơ tính 35,6% mơi trường ni cấy bổ sung IBA, thời gian nuôi cấy tuần Cũng đối tượng Cọc rào, Rajore cộng (2007) báo cáo môi trường bổ sung IBA môi trường tối ưu cho kích thích hình thành rễ Trong thí nghiệm này, bổ sung IBA vào môi trường nuôi cấy nồng độ 1,5 mg/l cho kết tái sinh cao báo cáo trước 100% thời gian nuôi cấy tuần Kết tương tự với kết Pandey cộng (2011) tối tượng Ginkgo biloba L bổ sung IBA vào môi trường nuôi cấy cho tỷ lệ hình thành rễ đạt 100% 55 Hình 4.6 Ảnh hưởng mơi trường khống, IBA NAA lên hình thành rễ Cọc rào a1.Mơi trường ½ MS; a2 Môi trường MS; a3 Môi trường B5; a4.Môi trường White; a5 Môi trường WPM; b1 Nồng độ NAA 0,0 mg/l; b2 Nồng độ NAA 0,5 mg/l; b3 Nồng độ NAA 1,0 mg/l; b4 Nồng độ NAA 1,5 mg/l; b5 Nồng độ NAA 2,0 mg/l; c1 Nồng độ IBA 0,0 mg/l; c2 Nồng độ IBA 0,5 mg/l; c3 Nồng độ IBA 1,0 mg/l; c4 Nồng độ IBA 1,5 mg/l; c5 Nồng độ IBA 2,0 mg/l 56 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Nội dung nghiên cứu đề tài khảo sát ảnh hưởng nồng độ số acid amine polyamine lên phát sinh phôi vơ tính Cọc rào Khảo sát mơi trường nồng độ chất điêu hòa sinh trưởng cho tái sinh từ mẫu phơi vơ tính thu Thu kết cụ thể sau đây: Nồng độ thích hợp proline bổ sung vào mơi trường ni cấy cảm ứng phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo 0,75 g/l Nồng độ glutamine thích hợp bổ sung vào môi trường cảm ứng phát sinh phôi từ mẫu mô sẹo 150 m/l Nồng độ adenine sulphate bổ sung vào môi trường nuôi cấy cảm ứng phát sinh phơi vơ tính từ mẫu mơ sẹo thích hợp nồng độ 150 mg/l Trong thí nghiệm khảo sát tyrosine mơi trường có bổ sung tyrosine khơng có hiệu việc hình thành phơi vơ tính từ ni cấy mơ sẹo Nồng độ spermidine thích hợp bổ sung vào mơi trường ni cấy 0,4 mM  Trong acid amine polyamine khảo sát nghiên cứu này, spermidine nồng độ 0,4 mM thích hợp cho ni cấy phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo Cọc rào ni cấy in vitro Mơi trường khống B5 có bổ sung IBA nồng độ 1,5 mg/l mơi trường khống thích hợp cho hình thành rễ phát triển từ phôi vô tính 5.2 ĐỀ NGHỊ Do điều kiện thời gian nghiên cứu hạn chế, nên kết dừng lại khảo sát ảnh hưởng loại acid amine polyamine bổ sung riêng lẻ Cần có nghiên cứu sâu vai trị acid amine polyamine khác để tìm loại acid amine hay polyamine có hiệu tốt lên nuôi cấy cảm ứng phát sinh phơi vơ tính từ mẫu cấy mơ sẹo Cần tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng acid amine polyamine kếp hợp nồng độ khác bổ sung vào môi trường nuôi cấy cảm ứng phát sinh phơi vơ tính 57 Từ kết đạt đối tượng Cọc rào, ứng dụng để nghiên cứu đối tượng thực vật khác Tiếp tục nghiên cứu tỷ lệ phát triển sau tái sinh từ phơi vơ tính điều kiện ex vitro, từ đánh giá suất, hiệu Cọc rào tái sinh từ phôi vơ tính so với trồng theo phương pháp truyền thống Nghiên cứu chuyển gen cải tạo giống Cọc rào cho suất cao, phẩm chất tốt phục vụ sản xuất 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Văn Thế Vinh, Chu Thị Bích Phượng, Đỗ Đăng Giáp, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt, 2011 Tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu cấy dầu mè (jatropha curcas L.) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 9(1): 1-7 Đỗ Vũ Tuyết Trinh, 2009 Nghiên cứu số biến đổi hình thái phát sinh quan từ mẫu cấy lát mỏng tế bào Dầu mè (Jatropha curcas L.) Luận văn thạc sĩ Sinh học, chuyên ngành Sinh lý thực vật, trường ĐH Khoa học tự nhiên Dương Tấn Nhựt, 2007 Công nghệ sinh học thực vật Tập NXB Nông Nghiệp, TP.Hồ Chí Minh, 103 130 Dương Tấn Nhựt, 2009 Công nghệ sinh học thực vật Tập NXB Nông Nghiệp, TP.Hồ Chí Minh, 57 Dương Tấn Nhựt, 2011 Công nghệ sinh học thực vật Tập NXB Nơng Nghiệp, TP.Hồ Chí Minh, 63 100 Thái Xn Du Nguyễn Văn Uyển, 2006 Triển vọng sản xuất dầu diesel từ Cọc rào (Jatropha curcas L.) Việt Nam Hội thảo: Nhiên liệu sinh học Việt Nam, tiềm hội phát triển, NXB Khoa học kỹ thuật, 88 94 Võ Văn Chi, 1999 Từ điển thuốc Việt Nam NXB Y học, 363 Tiếng nước Abdul Bakrudeen Ali Ahmed, Adhikarla Suryanarayana Rao, Mandali Venkateswara Rao, 2009 Somatic Embryogenesis and Plant Regeneration from Cell Suspension Culture of Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Roemer & Schultes KMITL Sci Tech J Vol No 1: 18 26 Armiyanti, Mihdzar Abdul Kadir, Saleh Kadzimin and Syaiful Bahri Panjaitan, 2010 Plant regeneration of Michelia champaca L., through somatic embryogenesis African Journal of Biotechnology Vol 9(18): 2640 2647 10 B S Aliyu and Y Mustapha, 2007 Effect of different media on the in vitro growth of cactus (Opuntia ficus indica) explants African Journal of Biotechnology Vol (11): 1330 1331 59 11 Boonyuen Kijwijan, Jaruwan Nokmai, and Nooduan Muangsan, 2008 Effects of tyrosine and plant growth regulators on growth and development of Gloriosa superba Linn In vitro Khon kaen agr j 36: 144 152 12 Evans D.A., Sharp W.R and Flick C.E., 1981 Growth and behaviour of cell cultures Embryogenesis and organogenesis In: Thorpe T A (ed) Plant Tissue Culture: methods and applications in agriculture Kluwer Academic Publishers, 45 13 Gupta R.C., 1985 Pharmacognostic studies on ‘Dravanti’ (part I), Jatropha curcas Linn Proc Indian Acad Sci (Plant Sci.), 94(1): 65 – 82 14 Heller J., 1996 Physic nut, Jatropha curcas L International Plant Genetic Resource Institute, – 66 15 Innaka Ageng Rineksane, Mihdzar Abdul Kadir, Saleh Kadzimin and Faridah Qamaruz Zaman, 2012 In vitro development of embryogenic calli and embryogenic stages in suspension cultures of mangosteen (Garcinia mangostana L.) Journal of Medicinal Plants Research Vol 6(13): 2549 2559 16 Jérémy Tinga Ouédraogo, Claude André St Pierre, Jean Collin, Sylvie Rioux & André Comeau, 1998 Effect of amino acids, growth regulators and genotype on androgenesis in barley Plant Cell, Tissue and Organ Culture 53: 59–66 Kluwer Academic Publishers, Netherlands 17 Jha T.B., Mukherjee P and Datta M.M., 2007 Somatic embryogenesis in Jatropha curcas Linn., an important biofuel plant Plant Biotech Rep 1: 135 – 140 18 Joubert P.H., Brown J.M.M., Hay I.T and Sebata P.D.B., 1984 Acute poisoning with Jatropha curcas purging nut tree in children S Afr Med J, 65(18): 729 – 730 19 Kalimuthu K., Paulsamy S., Senthilkumar R and Sathya M., 2007 In vitro propagation of the Biodiesel Plant Jatropha curcas L Plant Tis Cult Biotech, 17(2): 137 – 147 20 M Sujatha, T.P Reddy, M.J Mahasi, 2008 Role of biotechnological interventions in the improvement of castor (Ricinus communis L.) and Jatropha curcas L Biotechnology Advances 26: 424–435 60 21 M.A Santos, T Camara, P Rodriguez, I Claparols & J.M Torné, 1996 Influence of exogenous proline on embryogenic and organogenic maize callus subjected to salt stress Plant Cell, tissue and Organ Culture 47: 59 65 Kluwer Academic Publishers, Netherlands 22 Michael R Davey and Paul Anthony, 2010 Plant Cell Culture Essential Methods John Wiley & Sons, Ltd Oxford, UK, 39 59 23 Mohammad Gerdakaneh, Ali Akbar Mozafari, Ahmad Khalighi and Adel Sioseh Mardah, 2010 The effects of exogenous proline and osmotic stress on morpho biochemical parameters of strawberry callus African Journal of Biotechnology Vol 9(25): 3775 3779 24 Nhut, D T., Vinh, B V T., Hien, T T., Huy, N P., Nam, N B and Chien, H X., 2012 Effects of spermidine, proline and carbohydrate sources on somatic embryogenesis from main root transverse thin cell layers of Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) African Journal of Biotechnology Vol 11(5): 1084 1091 25 Nor Azlina Hasbullah, Azani Saleh and Rosna Mat Taha, 2011 Establishment of somatic embryogenesis from Gerbera jamesonii Bolus EX Hook F through suspension culture African Journal of Biotechnology Vol 10(63): 13762 13768 26 R Indira Iyer, G Jayaraman and A Ramesh, 2009 Direct somatic embryogenesis in Myristica malabarica Lam., an endemic, threatened medicinal species of Southern India and detection of phytochemicals of potential medicinal value Indian Journal of Science and Technology Vol.2 No 7: 11 17 27 Ravindra B Malabadi and Johannes Van Staden, 2005 Role of antioxidants and amino acids on somatic embryogenesis of Pinus patula In Vitro Cell Dev Biol.—Plant 41:181–186 28 S Varisai Mohamed, C S Wang, M Thiruvengadam, and N Jayabalan, 2004 In vitro plant regeneration via somatic embryogenesis through cell suspension cultures of horsegram [macrotyloma uniflorum (lam.) verdc.] In Vitro Cell Dev Biol.—Plant 40: 284–289 61 29 S.S Bhojwani, M.K Razdan, 1996 Plant Tissue Culture: Theory and Practice, a Revised Edition Elsevier Science B.V Amsterdam, The Netherlands, 125 166 30 Sara Ageel and Khaled Elmeer, 2011 Effects of Casein Hydrolysates and Glutamine on Callus and Somatic Embryogenesis of Date Palm (Phoenix dactylifera L.) New York Science Journal 4(7): 121 125 31 Siwaporn Homhuana, Boonyuen Kijwijana, Preeya Wangsomnuka, Kitti Bodhipadmab, DavidW.M Leungc,2008 Variation of plants derived from indirect somatic embryogenesis in cotyledon explants of papaya ScienceAsia 34: 347–352 32 Stirpe F., Pession Brizzi A., Lorenzoni E., Strocchi P., Montanaro L and Sperti S., 1976 Studies on the proteins from the seeds of Croton tiglium and of Jatropha curcas Toxin properties and inhibition of protein synthesis in vitro Biochem J, 156(1): – 33 Sujatha M and Mukta N., 1996 Morphogenesis and plant regeneration from tissue cultures of Jatropha curcas Plant Cell Tis Org Cult, 44: 135 – 141 34 Tee Chong Siang, Siow Then Soong and Adeline Ting Su Yien, 2012 Plant regeneration studies of Jatropha curcas using induced embryogenic callus from cotyledon explants African Journal of Biotechnology Vol 11(31): 8022 8031 35 Tiberia I Pop, Doru Pamfil, Catherine Bellini, 2011 Auxin Control in the Formation of Adventitious Roots Not Bot Hort Agrobot Cluj 39(1):307 316 36 Yong Qin Chen, Fei Yi, Min Cai and Jian Xin Luo, 2003 Effects of amino acids, nitrate, and ammonium on the growth and taxol production in cell cultures of Taxus yunnanensis Plant Growth Regulation 41: 265–268, Kluwer Academic Publishers, Netherlands 62 PHỤ LỤC Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) Khoáng vi lượng Nồng độ (mg/l) CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 FeNaEDTA 36,70 H3BO3 6,02 KI 0,83 MnSO4.2H20 16,90 Na2MoO4.2H2O 0,25 ZnSO4.7H2O 8,06 Khoáng đa lượng CaCl2 332,02 KH2PO4 170,00 KNO3 1900,00 MgSO4 180,54 NH4NO3 1650,00 Vitamin Glycine 2,00 Myo-Inositol 100,00 Nicotinic acid 0,50 Pyridoxin HCl 0,50 Thiamine HCl 0,10 63 Mơi trường B5 (Gamborg, 1968) Khống vi lượng Nồng độ (mg/l) CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 FeNaEDTA 36,70 H3BO3 3,00 KI 0,75 MnSO4.H2O 10,00 Na2MoO4.2H2O 0,25 ZnSO4.7H2O 2,00 Khoáng đa lượng CaCl2 113,23 KNO3 2500,00 MgSO4 121,56 NaH2PO4 130,44 (NH4)2SO4 134,00 Vitamin myo-Inositol 100,00 Nicotinic Acid 1,00 Pyridoxine HCL 1,00 Thiamine HCL 10,00 64 Môi trường WPM (Woody Plant Medium) (Lloyd Mc Cown, 1980) Khoáng vi lượng Nồng độ (mg/l) CuSO4.5H2O 0,25 FeNaEDTA 36,70 H3BO3 6,20 MnSO4.H2O 22,30 Na2MoO4.2H2O 0,25 ZnSO4.7H2O 8,60 Khoáng đa lượng CaCl2 72,50 Ca(NO3)2.2H2O 471,26 KH2PO4 170,00 K2SO4 990,00 MgSO4 180,54 NH4NO3 400,00 Vitamin Glycine 2,00 Myo-Inositol 100,00 Nicotinic acid 0,50 Pyridoxin HCl 0,50 Thiamine HCl 65 Môi trường White (White, 1963) Khoáng vi lượng Nồng độ CuSO4.5H2O 0,001 FeSO4.7H2O 3,47 H3BO3 1,50 KI 0,75 MnSO4.H2O 5,31 MoO3 0,0001 Na2SO4 200,00 ZnSO4.7H2O 2,67 Khoáng đa lượng Ca(NO3)2 anhydrous 208,47 KCl 65,00 KNO3 80,00 MgSO4 351,60 NaH2PO4.anhdrous 16,80 66 ... (Lạc Thủy, Hương Sơn, Lương Sơn), tỉnh Lạng Sơn (Chi Lăng, Lộc Bình, Mẫu Sơn, Tân Thanh) Vùng Bắc Trung bộ: tỉnh Thanh Hóa (Cẩm Thủy, Sao Vàng, Bá Thước, Thạch Thành), tỉnh Quảng Trị (Hưng Hóa)... N6 benzylaminopurine CW : Coconut water (nước dừa) DCHA : Dicyclohexylammordum sulfate DFMA : α-difluoromethylarginine FW : Fresh weight GA3 : Gibberellic acid IAA : Indole acetic acid IBA :... năm 2012 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu Phịng thí nghiệm trọng điểm phía Nam cơng nghệ tế bào thực vật - Viện Sinh học Nhiệt đới 3.2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 3.2.1 Vật liệu 3.2.1.1