Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số 36A, 2018 PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ DẠ DÀY BÒ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG XỬ LÝ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP GIÀU CELLULOSE LÊ HỒNG THÍA, NGUYỄN VĂN ĐỐN, CHÂU THỊ THẢO MY, LÂM TRÚC PHƯƠNG Viện Khoa học Công nghệ Quản lý Môi trường, Trường đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh lehongthia@iuh.edu.vn Tóm tắt Hệ vi sinh vật dày bị phong phú, có vai trị việc tiêu hóa loại thức ăn giàu cellulose Nhằm tuyển chọn chủng vi sinh vật có tiềm ứng dụng để phân hủy phế phẩm nông nghiệp giàu cellulose, 37 chủng vi khuẩn chủng nấm phân lập từ dày bò kiểm tra đặc tính sinh lý đặc điểm khuẩn lạc Trong số đó, 18 chủng vi khuẩn chủng vi nấm có hoạt tính phân giải cellulose enzyme ngoại bào kiểm tra môi trường chứa carbomethyl cellulose (CMC) Năm chủng vi khuẩn chủng nấm có hoạt tính phân giải cellulose mạnh nhất, với số D/d>2.5 (đường kính vịng phân giải/đường kính khuẩn lạc) vi khuẩn D/d>1.5 nấm mốc lựa chọn định giải trình tự vùng gen 16S rRNA ITS, theo thứ tự Kết phân tích cho thấy, chủng K9, Db1, T8, Db7, N1 N2 Bacillus flexus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Acinetobacter calcoaceticus, Aspergillus versicolor Aspergillus terreus với mức độ tin cậy trung bình cao, có tiềm ứng dụng để sản xuất chế phẩm vi sinh vật phân giải phế phẩm nông nghiệp giàu cellulose Từ khố 16S rRNA, cellulase, dày bị, ITS, vi sinh vật phân giải cellulose ISOLATION AND IDENTIFICATION OF RUMEN CELLULOLYTIC BACTERIA FOR AGRICULTURAL BYPRODUCT BIO-DEGRADATION Abstract Cow rumen microbes play an important role in cellulose digestion in animal nourishment To select potential microorganisms for cellulose bio-degradation in agricultural byproducts, thirty-seven bacteria strains and four mold strains which were isolated from the cow rumen were identified and described charateristics and physiology of colony and cells Among them, eighty bacteria strains and three mold strains showed cellulose-degrading activities on carbomethyl cellulose (CMC) medium Five bacteria strains and two mold strains with highest of cellulose-degrading activities, due to hydrolyzed CMC halos diameters/colony diameter >2.5 for bacteria and >1.5 for molds, were selected for identify by 16S rRNA or ITS, respectively, gene sequencing The results indicated that K9, Db1, T8, Db7, N1 and N2 strains were Bacillus flexus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Acinetobacter calcoaceticus, Aspergillus versicolor Aspergillus terreus, respectively, with similarity index at medium and high level Keywords 16S rRNA, cellulase, cellulolytic bacteria, cow rumen, ITS GIỚI THIỆU Việt Nam quốc gia có nơng nghiệp phát triển Cùng với xu hướng phát triển, năm lượng phế phẩm từ trình chế biến sản phẩm nông sản, thực phẩm lớn, phế phẩm giàu cellulose, với khoảng gần 900 triệu [1, 2] Lượng chất thải gây khó khăn cho việc xử lý, đe dọa ô nhiễm môi trường với địa phương mạnh sản xuất nơng nghiệp [3] Bên cạnh đó, số thói quen xử lý chất thải giàu cellulose đốt, chôn lấp thường gây hậu nghiêm trọng tới mơi trường đất, khơng khí, hệ vi sinh vật, trồng [4, 5] Dạ dày động vật nhai lại khơng có tuyến tiêu hố có vai trị quan trọng, khơng nơi chứa thức ăn mà xảy nhiều trình phân giải phản ứng hố học giúp cho việc tiêu hố chất xơ q trình lên men, phân giải chất hữu cơ, tổng hợp hấp thu chất dinh dưỡng [6, 7] Khác với động vật có dày đơn lợn, ngựa, dày bị có cấu tạo phức tạp gồm túi: cỏ, tổ ong, sách múi khế Dạ cỏ trâu bò trưởng thành chiếm tới 80-90% dung tích tồn dày 70-75% dung tích quan tiêu hố Lơng nhung thành cỏ phát triển làm tăng bề măt tiếp xúc © 2018 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ DẠ DÀY BÒ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG XỬ LÝ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP GIÀU CELLULOSE 87 với thức ăn lên nhiều lần Trong cỏ trâu bị có lượng lớn vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, vi nấm, protozoa [8] Từ năm 1941 nay, cơng trình nghiên cứu cho thấy có tới 200 lồi vi khuẩn cỏ mô tả [9] Tổng số vi khuẩn có cỏ thường vào khoảng 109-1010 tế bào/g chất chứa cỏ Trong cỏ vi khuẩn thể tự chiếm khoảng 25-30%, số lại bám vào mẩu thức ăn, trú ngụ nếp gấp biểu mô bám vào protozoa [8] Nhờ hoạt động hệ vi sinh vật này, thức ăn giàu cellulose tiêu hoá tạo thành chất dinh dưỡng acid béo, acid amin, vitamin [10] Hệ vi sinh vật dạy dày động vật nhai lại đánh giá có tiềm ứng dụng lớn việc xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp giàu cellulose [11] Nghiên cứu thực nhằm tuyển chọn chủng vi sinh vật có hiệu phân giải cellulose cao phù hợp cho định hướng ứng dụng sản xuất chế phẩm xử lý chất thải nông nghiệp giàu cellulose VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Các mẫu dày bò thu nhận từ Trại giết mổ tập trung tỉnh Đồng Nai Mẫu dày bảo quản 4oC thùng giữ lạnh với túi đá khơ suốt q trình vận chuyển Các mẫu đưa phịng thí nghiệm bảo quản tủ lạnh 4oC sử dụng để phân lập vi sinh vật không bảo quản 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phân lập vi sinh vật phân giải cellulose Các chủng vi sinh vật dịch dày bị phân lập mơi trường chứa nguồn carbon carboxymethyl cellulose (CMC), với thành phần bao gồm: 1g (NH4)2SO4; 1.31g K2HPO4.3H2O; 0.5g MgSO4.7H2O; 0.001g NaCl; 10g CMC; 15g agar; nước đến đủ lít Mơi trường điều chỉnh đến pH để phân lập vi khuẩn pH 5.5 để phân lập vi nấm Dịch thu nhận từ bề mặt dày pha loãng nước muối sinh lý vô trùng cấy trải đĩa Petri chứa môi trường phân lập Các đĩa phân lập vi sinh vật đặt tối điều kiện 30oC để phân lập nấm mốc 37oC để phân lập vi khuẩn Điều kiện thiếu khí trì bình kín (McIntosh & Filde’s jar) với túi hấp thu oxy AnaeroPackAnaero (Mitsubishi, Nhật Bản) Khảo sát khả phân giải cellulose chủng vi sinh vật phân lập Khả phân giải cellulose enzyme cellulase ngoại bào chủng vi sinh vật phân lập thực mơi trường có nguồn carbon CMC với thành phần tương tự Các chủng vi sinh vật nuôi cấy ngày 37oC vi khuẩn 30oC nấm mốc Hiệu phân giải CMC xác định cách đo vịng phân giải đĩa Petri chứa mơi trường ni cấy với thuốc thử lugol Xác định đặc tính chủng vi sinh vật Đặc tính di động chủng vi khuẩn thực phương pháp cấy thẳng đứng vào môi trường thạch sâu cao thịt peptone, ống thạch ủ 37oC Sự ảnh hưởng pH nhiệt độ sinh trưởng chủng vi sinh vật phân lập thực mơi trường CMC có pH 5.5, 7.0 9.0 Sau ngày tiến hành so sánh sinh trưởng chủng vi sinh vật Hoạt tính enzyme catalase vi sinh vật xác định thử khả phân giải dung dịch H2O2 Đặc tính Gram vi khuẩn xác định phương pháp nhuộm Gram Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số chủng mốc tách chiết theo phương pháp CTAB cải tiến Doyle and Doyle (1987) [12] Sinh khối tơ nấm (200 mg) nghiền 1000 µl dung dịch đệm tách chiết (NaCl 1.5M, TrisHCl (pH 8.0) 100 mM; EDTA (pH 8.0) 20 mM, CTAB 4%) ủ 60ºC 15 phút Hỗn hợp bổ sung 800 µl chloroform : isoamyl alcohol (tỉ lệ 24 : 1), ly tâm tốc độ 13000 rpm 10 phút 4ºC Dịch thu nhận bổ sung 800 µl isopropanol lạnh để tủa DNA Tủa DNA tiếp tục hoà tan vào 800 µl ethanol 70% ly tâm 13000 rpm 10 phút 4ºC Tủa DNA thu nhận hồ vào 50 µl dung dịch TE trước bảo quản -20ºC DNA tổng số chủng vi khuẩn thu nhận theo phương pháp mô tả Maniatis et al (1982) [13] với sinh khối vi khuẩn ly giải © 2018 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 88 PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ DẠ DÀY BÒ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG XỬ LÝ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP GIÀU CELLULOSE đệm ly giải chứa 10% SDS 20 mg ml-1 proteinase K 37oC Các bước tủa thu nhận DNA thực tương tự mô tả Khuếch đại vùng gen 16S rRNA vi khuẩn ITS nấm mốc Vùng gen 16S rRNA vi khuẩn vùng gen ITS nấm mốc khuếch đại kỹ thuật PCR với cặp mồi liệt kê Bảng Thành phần phản ứng thể tích phản ứng 25µl bao gồm: 15µl Go Taq Green Master Mix (Promega, Mỹ), 5µl mồi xi ngược có nồng độ 10 µM, 5µl nước khử ion 5µl mẫu DNA Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR thực máy Mastercycler (Eppendorf, Đức) gồm bước: phút 94°C; lặp lại 33 chu kỳ bước biến tính mạch khuôn (30 giây 94°C), bắt cặp mồi (30 giây 50-55°C) tổng hợp mạch (1 phút 72°C); phản ứng hoàn thiệt 72°C 10 phút Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% để kiểm tra kết Sản phẩm khuếch đại giải trình tự Cơng ty Nam Khoa Biotek (Tp Hồ Chí Minh) Bảng 1: Trình tự nucleotide cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR Loại mồi Mồi xuôi Mồi ngược Mồi xuôi Mồi ngược Tên gen 16S rRNA ITS Trình tự nucleotide 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’ 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ Xây dựng phát sinh lồi Trình tự vùng gen 16S rRNA vi khuẩn vùng gen ITS nấm mốc kiểm tra độ xác phần mềm Finch TV hiệu chỉnh phần mềm Seaview Các chủng tham chiếu lấy từ ngân hàng liệu NCBI dóng phần mềm ClusatlX2.1 Cây phát sinh lồi chủng phân tích chủng tham chiếu xây dựng phần mềm MrBayes phiên 3.2.6 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập vi khuẩn phân giải cellulose từ dày bò Từ dịch dày thu nhận vị trí cỏ, tổ ong, sách, khế phân lập 37 chủng vi khuẩn chủng nấm mốc (Hình 1) Vi khuẩn phân lập nhiều cỏ với 11 chủng, khế với chủng, tổ ong sách có chủng Có chủng vi khuẩn tồn tất vị trí phân lập dày bị A B D C Hình 1: Một số chủng vi sinh vật phân lập từ dày bỏ môi trường CMC (A) chủng K9, (B) chủng T8, (C) chủng N1, (D) củng N2 © 2018 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ DẠ DÀY BÒ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG XỬ LÝ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP GIÀU CELLULOSE 89 Các chủng vi khuẩn nhuộm Gram xác định số đặc tính sinh lý Kết mơ tả Bảng Đa số chủng vi khuẩn phát triển tốt mơi trường có pH trung tính kiềm nhẹ Chỉ số chủng phát triển yếu mơi trường có pH acid yếu Ngược lại, chủng nấm mốc phát triển thuận lợi môi trường có pH yếu Điều phù hợp với điều kiện đặc trưng dày bị có pH khoảng 6.5 [10] điều kiện lý tưởng cho hoạt động vi khuẩn nấm mốc Phần lớn chủng vi khuẩn có khả di động có hoạt tính enzyme catalase (đặc trưng vi sinh vật hiếu khí hiếu khí tùy nghi) Bảng 2: Đặc tính chủng vi sinh vật Ký hiệu chủng Tính di động Hoạt tính catalase 5.5 Vi khuẩn X1 + - + +++ X2 + + + X3 X4 + + X5 + + K1 + K2 + K3 K4 pH Gram Đặc điểm khuẩn lạc +++ G+ +++ +++ G- + ++ +++ +++ +++ GG+ - ++ ++ G+ + ++ ++ G+ + + ++ +++ G- + + + + - +++ ++ ++ ++ GG- K5 + + - +++ ++ G+ K6 + + - ++ ++ G+ K7 K8 K9 R1 + + + + + + + + - ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ GG+ G+ G+ R2 + + - ++ ++ G+ R3 R4 R5 Da1 + + + + + + + - + + ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ GGG+ G+ Da2 + - + +++ ++ G- Da3 + + - ++ +++ G- Hình trịn, màu trắng đục, nhày, mặt bên nhơ Hình trịn, màu trắng, mép trắng đục nhạt hơn, nhày, sát mặt thạch Hình trịn, màu vàng nhạt, nhày Hình trịn, màu trắng, mép trắng đục ngồi nhạt hơn, nhày, sát mặt thạch Dạng bất định, trắng đục, mép phân thùy, nhày Trịn, bên có tia tỉa ra, trăng đục, nhày Hình trịn, màu trắng, mép ngồi trắng trong, mép đậm hơn, nhày Hình trịn, trắng đục, nhày nhiều Hình trịn, màu trắng, có ria, mép ngồi trắng trong, có ria Mép trắng đục Trịn, hình trịn đồng mức, trắng trong, nhày Trịn, bên có tia đốm, vàng nhạt, nhày Bất định, màu trắng đục, nhày Bất định, màu trắng đục, nhày nhiều Bát định, trắng đục, mép hơi, nhày Trịn, trắng đục, nhày nhiều, mặt bên nhơ Bất định, trắng đục, mép có ria, nhày Bất định, màu trắng, mép phân thùy Tròn, trắng đục, mặt bên nhơ, nhày Hình hoa cúc, vàng nhạt, nhày Trịn, vàng nhạt, mép ngồi nhạt mép trong, nhày Trịn, trắng đục, nhày nhiều, măt bên nhơ Bất định, trắng, mép phân thùy, nhày © 2018 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ DẠ DÀY BÒ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG XỬ LÝ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP GIÀU CELLULOSE 90 Da4 + + - ++ ++ G- Db1 + + - +++ +++ G+ Db2 + + - +++ +++ G- Db3 + + - ++ ++ G+ Db4 + + - ++ ++ G+ Db5 + + - ++ +++ G- Db6 + + - +++ ++ G- Db7 - + + +++ +++ G- T1 + + - ++ ++ G- T3 + + + ++ ++ G- T4 + + - +++ ++ G+ T5 + + - + ++ G+ T6 + + - ++ ++ G+ T7 - + + +++ ++ G+ T8 + + - +++ +++ G+ Nấm mốc N1 +++ + - N2 +++ + - N3 +++ + - Trong, trắng trong, có ria, mặt thạch Trịn, bên có chấm vàng, trắng đục, nhơ, nhày Trịn, trắng trong, có ria, mép ngồi nhạt mép Bất định, trắng, mép phân thùy, mặt thạch Trịn, trắng đục, mặt bên nhơ, nhày nhiều Trịn, vàng nhạt, hình hoa cúc, mép ngồi vàng nhạt mép đậm Hình hoa cúc, mép ngồi trắng trong, mép vàng đậm, nhày Màu trắng đục, sát mặt thạch, khơng ngày Trịn, vàng nhạt, có ria,ít nhày, măt thạch Hình hoa cúc, mép ngồi vàng nhạt mép đậm hơn, nhày nhiều Trịn, hình trịn đồng mức, trắng trong, nhày Hình trịn, màu vàng, cưa, đậm ngồi, nhày Vàng đậm có viền trắng trong, mép trịn, nhày Vàng đậm có viền trắng trong, nhơ có cưa, nhày Khuẩn lạc trịn, hình trịn đồng mức, nhày, màu vàng Màu xanh đậm, khuẩn lạc tròn xung quanh có vịng sợi tơ màu trắng Cơ quản sinh sản dạng hoa cúc Màu vàng đậm xung quanh có nhiều tơ trắng dạng sợi Cơ quản sinh sản dạng hoa cúc Màu đen, dạng sợi Cơ quản sinh sản dạng hoa cúc 3.2 Khả phân giải cellulose chủng vi sinh vật Trên môi trường CMC, chủng vi sinh vật phân lập có khả phân giải cellulose thể vòng phân giải cellulose xung quanh khuẩn lạc thử thuốc thử logol (Hình 2) Một số chủng vi khuẩn có khả phân giải mạnh K9, Db1, Db7, T7, T8, vịng phân giải có đường kính gấp 2.5 lần đường kính khuẩn lạc (Bảng 4) Trong số chủng nấm mốc, chủng N1 N2 có hiệu phân giải tốt nhất, với đường kính vịng phân giải lớn 1.5 lần so với đường kính khuẩn lạc Bảng 4: Khả phân giải cellulose enzyme cellulase ngoại bào chủng vi sinh vật phân lập Ký hiệu chủng X1 Đường kính vịng phân giải (D) 0.65±0.02 © 2018 Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Đường kính khuẩn lạc (d) 0.28±0.01 D/d 2.27bc PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ DẠ DÀY BÒ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG XỬ LÝ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP GIÀU CELLULOSE X2 X3 X4 K1 K2 K8 K9 R4 Da2 Db1 Db2 Db7 T4 T5 T6 T7 T8 N1 N2 N3 0.42±0.01 0.57±0.05 0.5±0.04 0.47±0.04 1.45±0.13 0.7±0.11 1.06±0.23 0.58±0.03 0.65±0.02 0.78±0.05 0.7±0.07 0.65±0.01 1.13±0.05 0.78±0.03 1.06±0.06 0.88±0.06 1.65±0.15 0.8±0.03 1.9±0.21 2.15±0.09 0.35±0.02 0.48±0.01 0.42±0.03 0.42±0.02 0.75±0.04 0.4±0.03 0.38±0.05 0.3±0.05 0.45±0.03 0.28±0.04 0.33 ±0.02 0.23±0.01 0.98±0.09 0.46±0.03 0.45±0.02 0.33±0.02 0.38±0.03 0.4±0.01 1.1±0.08 2.1±0.12 91 1.2d 1.2d 1.2d 1.12d 1.93c 1.82cd 2.81b 1.84cd 1.4d 2.86b 2.12c 2.78b 1.37d 1.82cd 2.38bc 2.74b 4.65a 2.0c 1.73cd 1.02d Các chữ khác kèm theo số biểu thị khác biệt có ý nghĩa mức p85%) Trong số chủng vi sinh khuẩn định danh, có bốn chủng thuộc chi Bacillus chủng thuộc chi Acinetobacter Điều phù hợp với nghiên cứu trước Võ Văn Song Toàn cộng (2017) [14], Nguyễn Hoàng Anh cộng (2017) [15], Zhang et al (2018) [16], loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus chiếm ưu dày bò Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có vai trị quan trọng việc tiết enzyme ngoại bào hỗ trợ tiêu hoá cellulose có thức ăn bị [15] Sự tồn chủng vi khuẩn thuộc chi Acinetobacter dày bò xác định nghiên cứu Chang et al (2015) [17] Trong số chủng vi khuẩn phân lập được, thấy tồn chủng gây bệnh vật nuôi chủng T7 Kết phân lập định danh xác định chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus từ dạy dày bò Sự diện chi nấm mốc ghi nhận nghiên cứu Aihemaiti et al (2013) [8] Oyeleke and Okusanmi (2008) [6] Như vậy, tiêu hoá thức ăn giàu cellulose dày bị có hoạt động phối hợp nhiều chủng vi sinh vật khác So với nghiên cứu trước thực tác giả nước [6, 8, 14, 15, 16, 17], nghiên cứu © 2018 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ DẠ DÀY BÒ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG XỬ LÝ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP GIÀU CELLULOSE 93 định danh chi tiết đến loài kỹ thuật giải trình tự gen số vi sinh vật phân lập từ dày bò Đây sở quan trọng để ứng dụng vi sinh vật vào sản xuất chế phẩm để xử lý môi trường, phân hủy chất thải giàu cellulose A B Hình Cây phát sinh lồi chủng vi khuẩn (A) nấm mốc (B) phân lập từ dày bò Chủng ngoại cho phát sinh loài vi khuẩn Escherichia coli nấm mốc Penicillium chrysogenum © 2018 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 94 PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ DẠ DÀY BÒ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG XỬ LÝ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP GIÀU CELLULOSE KẾT LUẬN Dạ dày bị có diện số lượng lớn chủng vi khuẩn lượng nhỏ chủng nấm mốc Đa số chủng vi sinh vật có khả phân giải cellulose enzyme cellulase ngoại bào Dựa vào phương pháp định danh giải trình tự vùng gen 16S rRNA ITS, chủng vi sinh vật có tiềm ứng dụng để sản xuất chế phẩm vi sinh vật hữu ích phân giải phế phụ phẩm nơng nghiệp giàu cellulose, bao gồm K9, Db1, T8, Db7, N1 N2 Bacillus flexus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Acinetobacter calcoaceticus, Aspergillus versicolor Aspergillus terreus với mức độ tin cậy trung bình cao LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu thực hỗ trợ kinh phí Trường Đại học Cơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh theo đề tài nghiên cứu sở năm 2018 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đặng Minh Hằng, Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase số chủng vi sinh vật để xử lý rác, Báo cáo Khoa học - Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, trang 333 – 339, 1999 [2] Nguyễn Ngọc Trúc Ngân, Phạm Thị Ngọc Lan, Tìm hiểu khả phân giải cellulose vi sinh vật phân lập từ chất thải rắn nhà máy Fococev Thừa Thiên Huế, Tạp chí Khoa học Công Nghệ Trường Đại học Khoa Học Huế, tập 1, 135 – 142, 2014 [3] Nguyễn Thị Thu Thủy, Trần Thị Xuân Phương, Cao Thị Dung, Lê Thị Hương Xuân, Trương Thị Hồng Hải, Phân lập, tuyển chọn số chủng vi sinh vật có khả phân giải cellulose bước đầu ứng dụng xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp làm phân hữu vi sinh, Tạp chí Khoa học & Cơng Nghệ Nơng Nghiệp, tập 1, số 1, trang 159 – 167, 2017 [4] Hà Thanh Toàn, Mai Thu Thảo, Nguyễn Thu Phướng, Trần Lê Kim Ngân, Bùi Thế Vinh, Cao Ngọc Điệp, Phân lập vi khuẩn phân giải cellulose, tinh bột protein nước rỉ từ bãi rác thành phố Cần Thơ, Tạp chí Khoa học Trường đại học Cần Thơ, tập 10, trang 195 – 2002, 2008 [5] Hà Thanh Toàn, Lê Phương Trầm, Nguyễn Thị Mỹ Diện, Cao Ngọc Điệp, Phân hủy rác thải hữu phương pháp sinh học: Thí nghiệm thùng lên men 10-L, Tạp chí Khoa học Trường đại học Cần Thơ, tập 15b, 197 – 205, 2010 [6] S.B Oyeleke and T.A Okusanmi, Isolation and characterization of cellulose hydrolyzing microorganism from the rumen of ruminants, Academic Journals, vol 10, pp.1503-1504, 2008 [7] Võ Văn Phước Quệ Cao Ngọc Điệp, Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose, Tạp chí Khoa học Trường đại học Cần Thơ, tập 18a, trang 177 – 184, 2011 [8] M Aihemaiti, F Zhen, Y Li, G Aibaidoula and W Yimit, Isolation and identification of rumen bacteria for cellulolytic enzyme production, Acta microbiologica Sinica, vol 53, no 4, pp 470-477, 2013 [9] M.K Theodorou and J France, Rumen microorganisms and their interactions, In: Quantitative aspects of ruminant digestion and metabolism (Ed: J.M Forbes and J France), CAB International, pp 145-162, 1993 [10] Trần Cừ, Sinh lý hóa sinh tiêu hóa động vật nhai lại Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 1979 © 2018 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ DẠ DÀY BÒ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG XỬ LÝ RÁC THẢI NƠNG NGHIỆP GIÀU CELLULOSE 95 [11] Hồng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, Nguyễn Duy Long, Khả sinh tổng hợp đặc điểm cellulase Aspergillus niger RNNL – 363, Báo cáo Khoa học - Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, trang 304 – 307, 2003 [12] J Doyle and J Doyle, A rapid procedure for DNA purification from small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull, vol 9, pp 11–15, 1987 [13] T Maniatis, E.F Fritsch, and J Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor – New York, 1982 [14] Võ Văn Song Toàn, Đỗ Thị Cẩm Hường, Hồ Quảng Đồ, Trần Nhân Dũng, Phân lập, tuyển chọn định danh vi khuẩn cỏ bò để phân giải bột bã mía điều kiện in vitro, Tạp chı́ Khoa học Trường Đaị học Cần Thơ, tập 48b, trang 71-80, 2017 [15] Nguyễn Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Vĩnh Hoàng, Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp từ cỏ bị có khả sinh enzyme β-glucanase bước đầu xác định đặc tính enzyme, Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, tập 15, số 1, trang 85-91, 2017 [16] Y Zhang, Z Zhang, L Dai, Y Liu, M Cheng, and L Chen, Isolation and characterization of a novel gossypoldegrading bacteria Bacillus subtilis strain rumen Bacillus subtilis, Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, vol 31, no 1, pp 63-70, 2018 [17] D H Chang, M S Rhee, H Jeong, S Kim, and B C Kim, Draft Genome Sequence of Acinetobacter sp HR7, Isolated from Hanwoo, Korean Native Cattle, Genome Announc, vol 3, no 1, pp e01358-14, 2015 Ngày gửi bài:21/11/2018 Ngày chấp nhận đăng:01/03/2019 © 2018 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ... Hồ Chí Minh PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ DẠ DÀY BÒ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG XỬ LÝ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP GIÀU CELLULOSE 93 định danh chi tiết đến lồi kỹ thuật giải trình tự gen số vi sinh vật phân lập từ... PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ DẠ DÀY BÒ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG XỬ LÝ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP GIÀU CELLULOSE 3.3 Kết định danh chủng vi sinh vật phương pháp giải trình tự Dựa vào khả phân giải cellulose, chủng... [13] với sinh khối vi khuẩn ly giải © 2018 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 88 PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ DẠ DÀY BÒ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG XỬ LÝ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP GIÀU CELLULOSE