Nghiên cứu thành phần lipid một số đối tượng thân mềm hai mảnh vỏ và định hướng tạo chế phẩm có giá trị.Nghiên cứu thành phần lipid một số đối tượng thân mềm hai mảnh vỏ và định hướng tạo chế phẩm có giá trị.Nghiên cứu thành phần lipid một số đối tượng thân mềm hai mảnh vỏ và định hướng tạo chế phẩm có giá trị.Nghiên cứu thành phần lipid một số đối tượng thân mềm hai mảnh vỏ và định hướng tạo chế phẩm có giá trị.Nghiên cứu thành phần lipid một số đối tượng thân mềm hai mảnh vỏ và định hướng tạo chế phẩm có giá trị.Nghiên cứu thành phần lipid một số đối tượng thân mềm hai mảnh vỏ và định hướng tạo chế phẩm có giá trị.Nghiên cứu thành phần lipid một số đối tượng thân mềm hai mảnh vỏ và định hướng tạo chế phẩm có giá trị.Nghiên cứu thành phần lipid một số đối tượng thân mềm hai mảnh vỏ và định hướng tạo chế phẩm có giá trị.Nghiên cứu thành phần lipid một số đối tượng thân mềm hai mảnh vỏ và định hướng tạo chế phẩm có giá trị.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Thị Thanh Trà NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LIPID MỘT SỐ ĐỐI TƢỢNG THÂN MỀM HAI MẢNH VỎ VÀ ĐỊNH HƢỚNG TẠO CHẾ PHẨM CÓ GIÁ TRỊ LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT HÓA HỌC Hà Nội – 2022 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Thị Thanh Trà NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LIPID MỘT SỐ ĐỐI TƢỢNG THÂN MỀM HAI MẢNH VỎ VÀ ĐỊNH HƢỚNG TẠO CHẾ PHẨM CĨ GIÁ TRỊ Chun ngành: Kỹ thuật hóa học Mã sỗ: 52 03 01 LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Ngô Đại Quang GS TS Phạm Quốc Long Hà Nội – 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn GS TS Phạm Quốc Long PGS TS Ngô Đại Quang Các số liệu kết luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Một số số liệu đăng tạp chí khoa học chuyên ngành trong: “Danh mục cơng trình tác giả” đồng ý cho phép sử dụng số liệu đồng tác giả Việc tham khảo nguồn tài liệu thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo theo yêu cầu Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Tác giả Lê Thị Thanh Trà ii LỜI CẢM ƠN Luận án hoàn thành Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trong thời gian thực nghiên cứu nhận nhiều giúp đỡ, đóng góp ý kiến bảo tận tình thầy cơ, anh, chị, em, bạn đồng nghiệp Trước hết xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới GS TS Phạm Quốc Long, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên PSG TS Ngơ Đại Quang, tập đồn hóa chất Việt Nam tận tình hướng dẫn định hướng cho tơi suốt q trình nghiên cứu để hồn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn quan tâm giúp đỡ Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Cơng nghệ, Viện Hóa học Hợp chất Thiên nhiên tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn tập thể phịng hóa sinh hữu cơ, phịng phân tích hóa học, trung tâm phát triển công nghệ vật liệu, trung tâm nghiên cứu phát triển sản phẩm thiên nhiên, trung tâm Hóa thực vật Cơng nghệ Nano Y Sinh Viện hóa học hợp chất thiên nhiên tạo điều kiện sở vật chất giúp tơi hồn thành nghiên cứu Tơi xin cảm ơn tới PGS TS Trần Quốc Toàn, PGS TS Đoàn Lan Phương, PGS TS Trần Thị Thu Thủy, TS Trịnh Thị Thu Hương, TS Đặng Thị Phương Ly, TS Hồng Thị Bích, TS Đỗ Tiến Lâm, TS Phạm Minh Quân, TS Đinh Thị Thu Thủy hướng dẫn, góp ý giúp đỡ cho tơi nhiều q trình học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn đề tài nghiên cứu mã số KC.09.23/16-20 tạo điều kiện nguyên liệu, hóa chất trang thiết bị giúp tơi hồn thành nghiên cứu Đồng thời, gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo trường Đại học Thủy lợi, khoa Hóa Mơi trường, mơn Kỹ thuật Hóa học anh, chị, em đồng nghiệp tạo điều kiện tốt cho học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến gia đình tơi, người ln tạo điều kiện, động viên tinh thần cho thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Tác giả Lê Thị Thanh Trà iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ viii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT xiii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Khái quát thành phần lipid phospholipid 1.1.1 Lipid 1.1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.1.2 Chức vai trò 1.1.1.3 Tình hình nghiên cứu 1.1.2 Phospholipid 1.1.2.1 Cấu tạo 1.1.2.2 Chức vai trò 10 1.1.2.3 Hoạt tính sinh học 11 1.1.2.4 Ứng dụng 12 1.1.2.5 Tình hình nghiên cứu 14 1.2 Khái quát đối tƣợng nghiên cứu 16 1.2.1 Thân mềm hai mảnh vỏ 16 1.2.2 Vai trò giá trị kinh tế 17 1.2.3 Giới thiệu số loài Ngao, Hàu, Vẹm 18 1.2.3.1 Ngao trắng (Meretrix lyrata) 18 1.2.3.2 Vẹm xanh (Perna viridis) 20 1.2.3.3 Một số loài Hàu 21 1.3 Một số qui trình chế biến nguyên liệu 23 1.3.1 Qui trình thủy phân protein 23 iv 1.3.1.1 Protein, peptit axit amin 24 1.3.1.2 Enzyme protease 29 1.3.1.3 Ứng dụng kỹ thuật siêu âm thủy phân protein enzyme 31 1.3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân 33 1.3.1.5 Các nghiên cứu nước 34 1.3.2 Qui trình phân lập lecithin - phospholipid tự nhiên 35 1.3.2.1 Phân lập lecithin thô 36 1.3.2.2 Phân lập lecithin tách dầu 36 1.3.2.3 Phân lập lecithin tinh khiết cao chứa 70 - 96 % phosphatidylcholine 37 1.3.3 Kỹ thuật cơng nghệ tích hợp làm giàu phospholipid 39 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 41 2.1 Nguyên liệu 41 2.2 Phƣơng pháp 42 2.2.1 Phương pháp phân tích thành phần hóa học 42 2.2.1.1 Phương pháp xác định hàm lượng thành phần lipid, phospholipid 42 2.2.1.2 Phương pháp xác định thành phần hàm lượng axit béo 42 2.2.1.3 Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan 42 2.2.1.4 Phương pháp phân tích hàm lượng axit amin 43 2.2.2 Các phương pháp công nghệ 43 2.2.2.1 Phương pháp thủy phân enzyme kết hợp sóng siêu âm 43 2.2.2.2 Phương pháp trích ly lipid từ bã rắn sau thủy phân 43 2.2.2.3 Phương pháp phân lập phospholipid 43 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học 44 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 44 2.2.4.1 Thử nghiệm in vitro 44 2.2.4.2 Thử nghiệm in vivo 44 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu qui hoạch thực nghiệm 45 2.2.5.1 Phương pháp tính tốn kết thủy phân 45 2.2.5.2 Phương pháp xử lý thống kê 45 2.2.5.3 Phương pháp kế hoạch hóa thực nghiệm bậc trực giao Box-Wilson 46 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 47 v 3.1 Phân tích thành phần hàm lƣợng lipid, phospholipid 48 3.1.1 Xác định thành phần hàm lượng lớp chất lipid phospholipid 49 3.1.1.1 Trích ly lipid tổng 49 3.1.1.2 Xác định thành phần lớp chất lipid 49 3.1.1.3 Xác định thành phần lớp chất phospholipid 49 3.1.1.4 Xác định hàm lượng lớp chất lipid phospholipid 50 3.1.1.5 Phân lập lớp chất phospholipid 50 3.1.2 Xác định thành phần hàm lượng axit béo 50 3.1.3 Xác định hàm lượng protein hòa tan 51 3.1.4 Xác định thành phần hàm lượng axit amin 53 3.2 Nghiên cứu qui trình cơng nghệ tích hợp tạo chế phẩm có giá trị 53 3.2.1 Thủy phân Hàu enzyme kết hợp sóng siêu âm 54 3.2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng protein hòa tan thủy phân không sử dụng kỹ thuật siêu âm đầu dò 54 3.2.1.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng protein hòa tan thủy phân enzyme kết hợp sóng siêu âm 54 3.2.1.3 Tối ưu trình thủy phân Hàu enzyme kết hợp sóng siêu âm 55 3.2.2 Trích ly phospholipid 55 3.2.2.1 Trích ly lipid từ bã rắn sau thủy phân 55 3.2.2.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình phân lập lipid giàu phospholipid 57 3.3 Xác định cấu trúc hóa học 58 3.4 Hoạt tính sinh học 58 3.4.1 Thử nghiệm in vitro 58 3.4.2 Thử nghiệm in vivo 59 3.4.2.1 Tăng cường miễn dịch 59 3.4.2.2 Tăng lực 60 3.4.2.3 Độc tính cấp 61 3.4.2.4 Độc tính bán trường diễn 61 3.4.2.5 Chống viêm cấp gây carragenin 62 3.4.2.6 Chống viêm mạn 63 vi 3.5 Xử lý số liệu qui hoạch thực nghiệm 63 3.5.1 Xử lí số liệu 63 3.5.2 Tối ưu hóa kế hoạch thực nghiệm bậc trực giao Box-Wilson 63 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 67 4.1 Kết khảo sát lipid phosholipid số loài TMHMV 67 4.1.1 Hàm lượng lipid tổng 67 4.1.2 Thành phần hàm lượng lớp chất lipid 67 4.1.3 Thành phần hàm lượng axit béo 69 4.1.4 Thành phần hàm lượng phospholipid 70 4.1.5 Dạng phân tử phospholipid 72 4.1.5.1 Dạng phân tử phosphatidylethalnolamine 72 4.1.5.2 Dạng phân tử phosphatidylcholine 75 4.1.5.3 Dạng phân tử phosphatidylserine 77 4.1.5.4 Dạng phân tử phosphatidylinositol 78 4.1.5.5 Dạng phân tử phosphatidylglycerol 80 4.1.5.6 Dạng phân tử diphosphatidylglycerol 81 4.1.5.7 Dạng phân tử ceramide aminoethylphosphonate 82 4.1.5.8 Dạng phân tử axit phosphatidylglycolic 84 4.1.5.9 Dạng phân tử ceramide phosphatidylinositol 87 4.2 Theo dõi biến động hàm lƣợng lipid Hàu Crassostrea gigas nuôi Vân Đồn, Quảng Ninh 89 4.2 Lipid tổng 89 4.2 Thành phần hàm lượng lớp chất lipid 89 4.2.3 Thành phần hàm lượng axit béo 90 4.2.4 Thành phần hàm lượng lớp chất phospholipid 92 4.3 Quy trình cơng nghệ tích hợp tạo chế phẩm có giá trị 93 4.3.1 Quy trình tạo chế phẩm dịch đạm thủy phân 93 4.3.1.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng protein hòa tan thủy phân enzyme kết hợp sóng siêu âm 93 4.3.1.2 Qui hoạch thực nghiệm tìm mơ hình tốn tối ưu hóa q trình 96 4.3.1.3 Tối ưu hóa quy trình thủy phân 101 vii 4.3.1.4 Kiểm tra lại mơ hình tối ưu hóa 101 4.3.1.5 Quy trình cơng nghệ tạo chế phẩm giàu oligopeptide 102 4.3.2 Quy trình trích ly lipid tạo chế phẩm giàu phospholipid 104 4.3.2.1 Trích ly lipid từ bã rắn Hàu thủy phân 104 4.3.2.2 Trích ly lipid giàu phospholipid 106 4.3.2.3 Quy trình cơng nghệ tạo chế phẩm giàu phospholipid 107 4.3.3 Đánh giá chất lượng chế phẩm 108 4.3.3.1 Chế phẩm giàu oligopeptide 109 4.3.2.2 Chế phẩm giàu phospholipid 111 4.3.4 Bảng so sánh hiệu cơng nghệ tích hợp tạo chế phẩm 122 4.3.4.1 So sánh với thủy phân Hàu enzyme không sử dụng kỹ thuật siêu âm đầu dò 122 4.3.4.2 Bảng so sánh hiệu cơng nghệ tích hợp tạo chế phẩm 123 4.4 Hoạt tính sinh học chế phẩm 124 4.4.1 Chế phẩm giàu oligopeptide 124 4.4.1.1 Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro 124 4.4.1.2 Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch in vivo 125 4.4.1.3 Đánh giá tác dụng tăng lực in vivo 126 4.4.1.4 Đánh giá tác dụng độc tính cấp in vivo 127 4.4.1.5 Đánh giá tác dụng độc tính bán trường diễn in vivo 129 4.4.2 Chế phẩm giàu phospholipid 132 4.4.2.1 Đánh giá tác dụng chống viêm cấp in vivo 132 4.4.2.2 Đánh giá tác dụng chống viêm mạn in vivo 133 4.4.2.3 Đánh giá tác dụng độc tính cấp in vivo 133 4.4.2.4 Đánh giá tác dụng độc tính bán trường diễn in vivo 135 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 139 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 141 TÀI LIỆU THAM KHẢO 142 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined viii DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Trang Hình 1 Cấu tạo phân tử: a) glycerophospholipid, b) sphingophospholipid Hình Glycerophospholipid (a) cấu tạo phân tử, (b) kí hiệu, (c) màng tế bào Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo glycerophospholipid Hình 1.4 Cơng thức tổng qt số lysophospholipid Hình 1.5 Cơng thức tổng qt sphingophospholipid Hình 1.6 Cấu tạo hóa học hợp chất CAEP 16:0/18:2 10 Hình Phương trình thủy phân 23 Hình Mơ hình thủy phân protein tác nhân enzyme protease 29 Hình Sơ đồ khối quy trình cơng nghệ tách PC từ dầu đậu nành 35 Hình 10 Các phân đoạn lecithin đậu nành với hàm lượng PC khác 35 Hình 11 Sơ đồ cơng nghệ phân lập lecithin thô 36 Hình 12 Quy trình cơng nghệ tách loại dầu dung môi 36 Hình 13 Quy trình cơng nghệ tách loại dầu hỗn hợp khí siêu tới hạn 37 Hình 14 Quy trình cơng nghệ sản xuất lecithin tinh khiết theo lô 38 Hình 15 Quy trình cơng nghệ sản xuất lecithin tinh khiết liên tục 38 Hình 16 Lưu đồ HPLC lecithin chứa hàm lượng PC từ 20% đến 98 % 39 Hình Ảnh chuột Swiss albino trước thử nghiệm 44 Hình Sơ đồ thực nghiệm chung 47 Hình Sơ đồ xác định thành phần hóa học 48 Hình 3 Đường chuẩn mối quan hệ nồng độ protein hòa tan mật độ quang 52 Hình Sơ đồ qui trình thủy phân tạo chế phẩm 53 Hình Sơ đồ qui trình trích ly lipid từ Hàu thủy phân 56 Hình Hình ảnh TLC lớp chất lipid mẫu TMHMV nghiên cứu 67 Hình TLC chiều Crassostrea lugubris M3 71 Hình Hình ảnh TLC lớp chất PL C Lugubris M3 71 Hình 4 Sự phân mảnh PE p40:2: a) lưu đồ, b) MS-, c)MS2-, d) phân mảnh 72 Hình Sự phân mảnh PC 30:0: a) lưu đồ, b)c) MS-và MS2- 764,5421, d) MS2của 690,5136, e) phân mảnh 75 Hình Sự phân mảnh PS 38:1: a) MS-, b) MS2-, c) phân mảnh 77 Hình Sự phân mảnh PI 40:5: a) MS-, b,c) MS2-, d) phân mảnh 79 Hình Sự phân mảnh PG 32:0: a) MS-, b, MS2- 80 279 0,433 21,68 57,99 100 100 579,92 26,75 0,497 21,95 66,64 100 100 666,41 30,35 0,596 23,67 80,02 125 100 1000,24 42,26 0,534 20,90 71,59 125 100 894,83 42,82 0,582 26,07 78,18 125 100 977,26 37,48 0,634 26,07 85,10 125 110 1170,13 44,88 0,622 26,32 83,59 125 110 1149,31 43,67 0,603 25,10 80,99 125 110 1113,64 44,36 0,638 25,95 85,75 125 100 1071,86 41,31 0,645 25,41 86,61 125 100 1082,67 42,61 0,646 23,39 86,83 125 100 1085,37 46,41 0,554 20,37 74,40 125 100 45,65 0,620 25,08 83,26 125 100 1040,78 41,49 42,2444 2,19 0,638 27,08 85,75 125 100 1071,86 39,59 0,582 22,41 78,07 125 101 43,99 0,614 26,01 82,40 125 101 1040,27 39,99 41,2689 1,67 0,619 26,36 83,15 125 101 1049,82 39,82 929,97 985,67 40,85 2,08 44,30 0,43 43,44 1,87 Bảng 5.10b Kết tối ưu hóa điều kiện thủy phân TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 X1 1,024 0,243 -0,691 -1,478 -0,728 -1,405 -1,474 -1,414 -1,357 -1,000 -1,107 -1,229 -0,751 -0,320 0,863 -0,291 -1,532 0,224 -1,404 0,201 X2 0,580 0,198 -0,261 1,135 -0,862 -0,925 -0,175 -0,734 -0,811 -1,000 -0,940 -1,140 -0,285 -0,024 0,418 0,332 -1,435 0,266 -0,722 0,559 X3 -0,874 -0,130 -0,396 1,499 0,957 0,479 0,526 0,938 0,530 1,000 0,525 0,741 1,091 -0,073 0,418 0,397 -0,695 -0,064 0,831 0,963 X4 -1,352 -1,318 -1,268 1,413 1,216 1,419 0,673 1,131 0,254 1,000 -0,822 1,193 1,288 -1,432 -1,353 -1,307 -1,541 -1,009 1,388 1,510 X5 -0,823 -1,069 -0,593 1,528 1,067 -0,269 0,704 -0,124 -0,083 1,000 -1,340 -0,994 0,901 -0,775 -1,416 -1,467 -0,146 -1,112 -0,709 1,485 Y Desirability 46,060 1,000 46,983 1,000 46,278 1,000 45,264 1,000 45,339 1,000 46,297 1,000 45,550 1,000 46,793 1,000 45,255 1,000 45,464 1,000 48,807 1,000 46,352 1,000 46,012 1,000 46,732 1,000 45,426 1,000 45,981 1,000 45,285 1,000 45,654 1,000 46,444 1,000 45,469 1,000 280 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 -0,887 -1,447 0,781 1,262 0,723 0,497 -1,345 0,148 0,589 -0,279 1,016 -1,307 -1,244 -0,117 -0,190 0,858 -1,489 -0,967 -1,454 0,870 0,290 -0,919 -1,101 -1,415 1,455 -1,493 -1,450 0,062 -1,360 0,491 -1,311 -1,083 -0,421 -1,437 -0,409 -1,238 1,068 1,078 -0,408 0,034 -1,488 -0,551 0,989 -0,167 0,573 -1,388 -0,499 0,800 -0,723 0,879 -0,795 -1,009 0,106 -0,192 0,050 0,076 -0,044 0,365 -1,173 -0,516 -0,064 -0,771 -0,864 0,208 -0,580 -0,528 -1,434 -0,406 1,457 -1,057 -1,255 0,124 -1,246 0,088 -0,365 -0,825 0,004 -0,510 -0,090 -0,402 1,068 -0,043 -0,194 1,061 -0,975 0,384 -0,516 -1,306 -0,704 0,075 -0,370 -0,474 -0,723 -0,018 0,690 0,161 -0,696 -0,624 -0,972 0,340 -0,258 0,739 -0,313 -0,151 0,601 0,717 0,745 0,190 -0,316 0,686 0,387 -0,150 -0,240 0,470 0,627 -0,035 0,981 -0,927 0,470 0,672 -0,261 1,058 0,990 0,080 -0,030 0,106 0,713 0,887 0,016 0,485 0,172 0,824 -1,485 0,583 -1,146 -1,359 -1,168 -1,301 0,287 -0,367 -1,260 -1,046 -1,405 1,047 -1,169 1,407 -1,065 -0,894 0,439 -0,141 0,794 -0,766 -0,567 1,095 0,793 -0,612 -1,390 0,803 0,959 -1,228 0,404 -1,497 -0,250 1,473 -1,512 0,399 1,453 -1,148 -1,417 -1,262 1,367 1,495 0,471 1,292 -1,336 -0,881 -1,505 -1,164 -1,162 -0,754 -1,198 -1,546 -0,008 -1,530 -1,151 -0,796 -0,871 1,483 -0,572 1,404 -1,348 -1,380 1,044 -0,956 1,265 -1,467 -1,390 0,733 -1,359 -0,667 -1,344 -1,530 -0,003 -0,738 -0,122 -0,918 -1,466 1,100 -0,808 1,300 0,930 -0,291 -1,392 -1,380 1,401 1,547 -1,487 1,389 -1,487 -1,458 47,847 46,050 46,297 45,773 45,694 46,377 45,185 45,633 47,394 45,296 45,962 47,009 45,996 45,629 47,987 46,139 45,319 45,298 47,087 45,260 45,556 45,475 46,043 45,853 46,254 47,193 46,532 45,258 45,455 47,161 46,451 47,702 47,523 45,385 45,571 45,818 46,379 47,105 46,021 45,490 46,330 45,848 47,595 45,459 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 281 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 1,090 -1,420 0,084 -1,366 0,663 1,499 -0,472 -0,182 -1,379 -1,130 -0,855 -0,752 -1,276 -0,689 -1,242 -0,886 0,141 0,229 -0,725 -1,156 -1,502 -1,374 -1,516 -0,017 -0,403 -1,541 -1,285 0,393 -1,445 -1,399 -0,784 -0,328 -1,519 -0,689 -0,528 -0,433 1,058 -1,258 0,383 -0,758 0,602 0,709 -0,104 -0,096 -0,076 0,403 0,533 0,391 -0,858 -1,475 -0,894 0,089 1,298 0,620 0,412 -1,160 -0,310 -1,416 -0,442 -0,083 -1,191 -0,278 0,359 -0,415 -0,874 -0,685 -1,111 0,622 -0,968 -1,228 0,835 0,097 -0,536 0,335 -0,118 0,549 -0,788 -0,471 0,539 0,731 -0,028 1,289 -0,406 -0,213 0,476 0,626 0,983 -0,769 -1,177 -0,419 -0,714 0,401 0,257 -0,111 0,430 -0,179 0,573 1,085 0,399 0,265 -0,469 0,708 0,198 0,714 0,710 0,901 -0,745 0,771 -1,441 -0,789 -1,534 1,184 -1,480 -0,855 1,405 1,500 -1,473 1,158 -1,543 -1,515 1,530 0,539 1,531 -1,346 -1,508 -1,497 -1,402 1,331 0,435 0,153 0,505 -0,801 0,082 1,509 1,348 -1,267 -1,399 0,614 -1,181 1,236 -1,026 0,156 -1,433 1,526 -0,648 -0,376 -0,545 -1,490 -0,691 -1,410 1,332 1,460 -0,728 1,299 -0,660 -1,161 0,783 -1,517 1,161 -1,163 -1,459 -0,841 -0,728 -1,382 1,430 -0,886 0,573 -1,320 -1,524 0,121 1,303 -1,380 -0,048 0,588 -0,610 1,444 -0,318 -1,336 -1,253 1,301 45,350 46,462 45,234 45,535 46,075 46,263 45,960 46,068 47,534 46,130 45,569 47,611 47,355 45,717 49,582 47,677 45,632 46,432 45,508 45,268 45,458 45,261 45,450 46,534 45,625 47,520 47,185 47,477 45,748 45,844 46,108 45,343 45,784 45,268 45,849 46,863 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 282 Phụ lục 6: Kết trích ly lipid giàu phospholipid 283 Bảng 6.1b: Kết khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ CH3COOC2H5:n-C4H9OH Tỉ lệ dung môi 4:1 3:1 2:1 1:1 1:2 1:3 Hàm lượng lipid so với khối lượng chất rắn (%) 3,9 5,2 3,5 3,5 3,0 3,0 Sai số 0,2 0,3 0,3 0,1 0,1 0,2 Bảng 2b Kết khảo sát ảnh hưởng tốc độ li tâm Tốc độ li tâm (vòng/phút) 2000 2500 3000 3500 4000 4500 Hàm lượng lipid so với khối lượng chất rắn (%) 4,1 4,7 5,6 3,8 4,2 4,4 Sai số 1,3 0,6 0,3 0,1 0,4 0,5 Bảng 3b Kết khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (%) 10 25 35 45 50 Hàm lượng lipid so với khối lượng chất rắn (%) 1,2 1,9 3,4 4,1 3,7 3,7 Sai số 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,4 Bảng 4b Kết khảo sát ảnh hưởng số lần trích ly Số lần trích ly Hàm lượng lipid so với khối lượng chất rắn (%) 4,1 6,5 6,9 7,3 7,2 7,4 Sai số 0,6 0,3 0,1 0,1 0,1 0,1 Bảng 5b Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian li tâm Thời gan li tâm (phút) 10 14 16 18 20 22 Hàm lượng lipid so với khối lượng chất rắn (%) 4,1 4,6 5,1 5,7 5,2 5,3 Sai số 0,1 0,2 0,2 0,2 0,1 0,1 284 Bảng 6b Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/lipid thủy phân Tỉ lệ dung môi/lipid 1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 Hàm lượng PoL (%) 53,4 64,4 73,6 82,9 81,9 68,6 Sai số 9,6 0,4 0,9 1,5 1,5 0,6 Bảng 6b Ảnh hưởng só lần chiết Số lần chiết Hàm lượng PoL (%) 70,8 96,4 98,9 98,4 99,2 99,1 Sai số 10,4 0,4 0,8 0,8 0,3 0,2 Bảng 7b Ảnh hưởng thời gian lắc dung môi Thời gian lắc dung môi (s) 40 60 80 100 120 150 Hàm lượng PoL (%) 77,6 90,8 96,6 97,8 96,1 94,6 Sai số 6,8 4,6 1,1 0,6 1,6 2,6 285 Phụ lục 7: Phiếu trả kết hoạt tính 286 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC _ Địachỉ: 18 Hoang Quoc Viet, CauGiay, Hanoi, Vietnam Tel: 844-38361774; Fax: 844-38363144; Email: thaodo@ibt.ac.vn KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH CẢM ỨNG TĂNG CƢỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO (Kết thử nghiệm có giá trị với mẫu đem thử) - Tênmẫu: Mẫu A6 Dạng mẫu thử:Dạng bột,Trên nhãn ghi tên mẫu rõ ràng Ngày sản xuất: Dòng tế bào thử nghiệm: + RAW264.7:Dòng tế bào đại thực bào macrophage - Ngƣời gửi mẫu: Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm KHCNVN - Thời hạn thử nghiệm:tháng 10-12/2018 - Tài liệu tham khảo: Taniguchi T, Matsui H, Fujita T, Hatakeyama M, Kashima N, Fuse A, Hamuro J, Nishi-Takaoka C, Yamada G (1986)Molecular analysis of the interleukin-2 system Immunol Rev, 92: 121-133 Manosroi A, Saraphanchotiwitthaya A, J Manosroi; In vitro immunomodulatory effect of Pouteria cambodiana(Pierre ex Dubard) Baehni extract; Journal of Ethnopharmacology 101 (2005) 90–94 Jianjun Xua,Yongxin Zhao, Haji Akber Aisa (2017) Anti-inflammatory effect of pomegranate flower in lipopolysaccharide(LPS)-stimulated RAW264.7 macrophages Pharm Bio 55(1): 2095–2101 Li G, Yang X, Zhao J, Chang J (2018) Saccharum Alhagi polysaccharide-1 and -2 promote the immunocompetence of RAW264.7 macrophages in vitro Experimental and therapeutic medicine; 15: 3556-3562 I VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1 Vật liệu Vật liệu hoá chất: - FBS GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB (Sigma) Đĩa 96 giếngnhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf), máyđọc ELISA 96 giếng (Bio-rad) 287 Các hóa chất thơng thường khác Dịng tế bào macrophage RAW 264.7 cung cấp ngân hàng tế bào ATCC (Manassas, Virginia, USA) 1.2 Phƣơng pháp - Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro Tế bào RAW 264.7 nuôi cấy dạng đơn lớp mơi trường ni cấy DMEM có bổ sung 10% huyết phơi bị (FBS), 1% kháng sinh PSF điều kiện 37oC 5% CO2 Tế bào đựợc cấy chuyển Trypsin - EDTA (0,05 %) sau ngày nuôi cấy Phương pháp xác định phát triển tế bào RAW264.7 - - - - Phương pháp MTT sử dụng để xác định phát triển tế bào tác động chất nghiên cứu Phương pháp xác định phát triển tế bào thông qua hình thành sản phẩm formazan mầu đưa MTT vào giếng tế bào tác động enzyme tế bào sống Phương pháp thực theo bước sau: Tế bào đưa vào đĩa 96 giếng với nồng độ 1x104 tế bào/giếng ; Tế bào đĩa ủ với chất thử (10 l) pha DMSO 10% để có nồng độ nồng độ 100g/ml, 20 g/ml; g/ml; 0.8 g/ml Các giếng tế bào có dung mơi pha mẫu sử dụng làm đối chứng âm; Ủ đĩa tế bào thí nghiệm tủ ấm 37oC, 5% CO2 ngày; Thêm vào giếng 20µl MTT (5mg/ml) ủ tủ ấm 37oC giờ; Loại bỏ dịch nổi, thêm vào giếng100µl DMSO để hịa tan mầu formazan tạo thành, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ 10 phút sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết hàm lượng màu formazal qua phổ hấp phụ bước sóng 540 nm Khả sống sót tế bào có mặt chất thử xác định thông qua công thức sau: [OD(chất thử) x 100 % sống sót = OD(đối chứng âm) Phương pháp xác định tác động mẫu thử đến tổng hợp IL-2 Tế bào RAW 264.7 đưa vào giếng thí nghiệm đĩa 96 giếng với lượng tế bào ph hợp (5 × 104 tế bào 190 l môi trường) ủ 37oC qua đêm cho tế bào ổn định - Chất thử (10 l) pha DMSO 10% đưa vào giếng nồng độ khác Một số giếng khơng có chất thử có tế bào (190l) 10l DMSO sử dụng làm đối chứng âm - Sau 2h thêm LPS với nồng độ 1g/ml vào tất giếng thí nghiệm - Sau 24 h, thu dịch nuôi tế bào thử chất để xác định có mặt Interleukin 2(IL-2 mouse ELISA Kit) có môi trường nuôi cấy theo hướng dẫn nhà sản xuất kit (R&D Systems, Minneapolis, US) Phương pháp xử lí số liệu - 288 Các số liệu xử lí Excel, trình bày dạng mean ± SD Các thuật toán thống kê Student's t-test, F’test phương pháp phân tích phương sai nhân tố ngẫu nhiên (one way ANOVA) để kiểm tra sai khác có ý nghĩa so với đối chứng âm, với P