Trình tự Nucleotid đặc thù trong exon 2 gen myostatin của bò Lai sind và bò Vàng Việt Nam pot

Trình tự Nucleotid đặc thù trong exon 2 gen myostatin của bò Lai sind và bò Vàng Việt Nam Trần Xuân Hoàn*, Phạm Ngọc Uyển, Phạm Thị Phương Mai và Trần Xuân Toàn Phòng thí nghiệm trọng điểm tế bào động vật Viện Chăn nuôi * Tác giả để liên hệ: Trần Xuân Hoàn, Phòng thí nghiệm trọng điểm tế bào động vật Tel: (04) 2.166.165/ 0914.873.684; Fax: (04) 8.389.775. Email: Tranxuanhoan @yahoo.com.vn ABSTRACT The specific nucleotide sequence in the exon 2 of the myostatin gene of Lai sind cattle and Yellow cattle were reared in Vietnam A pair of PCR primers was used to amplify the exon 2 of myostatin gene of cattle breed: Lai sind and Yellow were reared in Vietnam. The 374 bp nucleotide sequence in the exon 2 of the myostatin gene was determined. The amino axit sequence deduced from the nucleotide sequence of Lai sind & Yellow cattle was well conserved with it’s sequence of other cattle breed, however it was found that a C-G transition at nucleotide position 374 results in the substitution of serine by cysteine at amino axit position 125, an A-C transition at nucleotide position 443, results in the substitution of tyrosine by serine at amino axit position 148 with the same frequence 0.1. There are two other mutations were revealed at nucleotide positions 414 T-C transition and 478 C-T transition with frequence 0.9 and 0.83 respectively, but these mutations do not change amino axit sequence. There are three specific mutations at nucleotide 374, 443 and 478 of Lai sind and Yellow cattle. Keywords: nucleotide, exon 2, myostatin gene, Lai sind, yellow cattle. Đặt vấn đề Gen myostatin bò nằm ở đầu ngoài nhiễm sắc thể số 2, chứa 3 exon và 2 intron. Myostatin đã được xác nhận như là nhân tố ảnh hưởng đến tỷ lệ thịt xẻ của bò thịt (double muscling) là do các đột biến trong vùng mã hoá làm cho gen bất hoạt, dẫn đến không có khả năng ức chế sự phát triển của sợi cơ [1]. Các kết quả nghiên cứu đã phát hiện ra 10 kiểu đột biến ở các giống bò khác nhau, trong đó có một đột biến xảy ra trong exon 1 là F94L; 3 đột biến trong exon 3 là nt 821(del11); E291X; C313Y và 6 đột biến xảy ra trong exon 2 là nt 414 C-T; nt419 del7 ins10; Q204X; D182N; N214S; E226X [1,3,4]. Kết quả trên cho thấy trong exon 2 gen myostatin của bò có nhiều đột biến và có khả năng làm tăng tỷ lệ thịt xẻ của bò. Tuy nhiên nghiên cứu trước đây của chúng tôi bằng kỹ thuật PCR-RFLP chưa phát hiện được các dạng đột biến Q204X và E226X trong exon 2 của bò Lai sind và bò Vàng Việt Nam. Điều này cho thấy khả năng bò Lai sind và bò Vàng có cấu trúc đặc thù riêng biệt trong exon 2 của gen myostatin so với các giống bò thịt của nước ngoài. Trong khi đó kiểu đột biến làm tăng thịt xẻ xuất hiện với tần số cao ở một số giống bò như Belgian Blue; Peidmontese và South Devon [1,5]. Do đó để xác định sự sai khác di truyền, làm cơ sở khoa học phát triển và ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP vào việc đánh giá ảnh hưởng của gen myostatin đến khả năng cho thịt của các giống bò nội trong công tác chọn lọc và lai tạo các giống bò thịt có tỷ lệ thịt xẻ cao, chúng tôi đã tiến hành giải trình tự đoạn gen chứa toàn bộ exon 2 gen myostatin.Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là bò Lai sind và bò Vàng nuôi ở Đông Anh, Hà Nội Phương pháp nghiên cứu Lấy mẫu máu: Máu bò lấy khoảng 0,5ml và được chống đông bằng dung dịch 0,5M EDTA theo tỷ lệ 1 EDTA: 20 máu. Tách ADN: Mỗi mẫu máu đã được chống đông lấy 200µl tách ADN theo kit của hãng Fermentas. Phản ứng PCR Đoạn ADN chứa exon 2 gen myostatin của bò Lai sind và bò Vàng được nhân lên từ các cặp mồi LL có trình tự như sau 5’- GTTCATAGATTGATATGGAGGTGTTCG-3’ Xuôi 5’- ATAAGCACAGGAAACTGGTAGTTATT-3’ Ngược Trước khi thực hiện phản ứng PCR, ADN được biến tính ở 95 0 C trong 4 phút. Sau đó phản ứng PCR chạy 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ có chu trình nhiệt như sau: 95 0 C trong 60s 60 0 C trong 60s 72 0 C trong 60s Kết thúc phản ứng được kéo dài 5 phút ở 72 0 C Sản phẩm PCR được tinh sạch theo kit MicroSpin TM S-200 HR columns cuả Amersham Biosiences, sau đó được thực hiện phản ứng giải trình tự với mồi xuôi và ngược riêng biệt. Tinh sạch phản ứng giải trình tự và tiến hành giải trình tự trên máy tự động ABI. Sai khác trình tự nucleotide được phân tích bằng phần mềm: Genetyx-Win (Version 4.0). Kết quả và thảo luận Đoạn ADN chứa exon 2 gen myostatin của bò Lai sind và bò Vàng được nhân lên từ cặp mồi LL do Karim & CS (2000) thiết kế. có mồi xuôi bắt đầu từ nucleotid 2286 và mồi ngược bắt đầu từ nucleotid 2840 trên trình tự gen myostatin của bò đã được Jeanplong & CS (2001) thiết kế. Do vậy kích thước mong đợi sẽ có chiều dài lá 555 bp. Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR từ cặp mồi LL của chúng tôi thu được đoạn ADN có kích thước phù hợp kết quả giải trình tự của Jeanplong & CS (2001). Nhưng nếu so với kết quả giải trình tự gen myostatin bò của Shibata & CS (2003) chúng tôi thấy thiếu một nucleotid T trong intron 1 là do ở vị trí 2343 - 2349 chỉ có 7 nucleotid T được lặp lại, trong khi đó theo kết quả của Shibata, 2003 tại các vị trí trên có 8 nucleotid T lặp lại. Chiều dài đoạn ADN nhân lên từ cặp mồi LL tuy có sai khác một nucleotid trong intron 1, nhưng chiều dài exon 2 không có sự sai khác giữa kết quả giải trình tự của chúng tôi với kết quả của Jeanplong (2001) và Shibata (2003). Chiều dài exon 2 gen myostatin của bò là 374 bp. Kết quả được thể hiện qua hình 1. gttcatagat tgatatggag gtgttcgttc atttttcata aaaatgatct tagtaacttt ttttcttatt catttatagc tgatcttcta acgcaagtgg aaggaaaacc caaatgttgt ttctttaaat ttagctctaa gatacaatac aataaactag taaaggccca actgtggata tatctgaggc ctgtcaagac tcctgcgaca gtgtttgtgc aaatcctgag actcatcaaa cccatgaaag acggtacaag gtatactgga atccgatctc tgaaacttga catgaaccca ggcactggta tttggcagag cattgatgtg aagacagtgt tgcagaactg gctcaaacaa cctgaatcca acttaggcat tgaaatcaaa gctttagatg agaatggcca tgatcttgct gtaaccttcc cagaaccagg agaagatgga ctggtaagtg attactgaaa ataacatgct aaaaaccttg ttatgtgttt attcataatg tgaatgaata gtagtgaaaa ataactacca gtttcctgtg cttat Hình1: Trình tự đoạn ADN gen myostatin bò nhân lên từ cặp mồi LL Màu đậm: Vùng exon, Màu nhạt: Vùng intron Tuy nhiên kết quả giải trình tự đoạn ADN nhân lên từ cặp mồi LL của 30 con bò chúng tôi nhận thấy có đột biến cả trong intron 1 và trong exon 2. Trong exon 2 có 4 điểm đột biến với tần số xuất hiện lớn hơn 0,1. Đó là các đột biến tại các nucleotid 374; 414; 443 và 478. Kết quả được trình bày trong bảng 1. Bảng 1: Các đột biến điểm trong exon 2 gen myostatin bò Lai sind và bò Vàng Việt Nam Điểm đột biến nt374 nt414 nt443 Nt478 Bazơ đột biến G thay C C thay T C thay A T thay C Bộ ba thay đổi TGT-TCT TGC-TGT TCC-TAC TTG- CTG Thay đổi axit amin Cys – Ser Cys- Cys Ser- Tyr Leu- Leu Tần số xuất hiện 0,1 0,9 0,1 0,83 Ký hiệu đột biến S125C nt414C-T Y148S nt478T- C Qua bảng 1 ta thấy, tại nucleotid 374 có đột biến G thay C dẫn đến bộ ba TGC thay TCT, do đó axit amin Cystein thay cho Serine, được ký hiệu là S125C. Dạng đột biến này chưa được phát hiện ở giống bò nào trên thế giới, nhưng tần số xuất hiện đột biến này ở bò Lai sind và bò Vàng Việt Nam là 0,1. Điểm đột biến này có thể là đột biến đặc thù của bò Lai sind và bò Vàng Việt Nam. Tại nucleotid 414 có đột biến C thay T, dẫn đến bộ ba TGC thay TGT, nhưng không làm thay đổi axit amin Cystein, được ký hiệu là nt 414C-T. Theo Smith và CS (2000). Dạng đột biến này đã phát hiện được ở 11 giống bò thịt và bò sữa khác nhau, trong đó bò Saler có tần số xuất hiện đột biến cao nhất là 0,87, thấp nhất ở bò Belgian Blue là 0,09. Trong khi đó dạng đột biến này bò Lai sind và bò Vàng Việt Nam tần số xuất hiện là 0,9. Tại nucleotid 443 có đột biến C thay A, nên bộ ba TCC thay TAC, dẫn đến axit amin Serine thay Tyrosine, được ký hiệu là Y148S. Tương tự như đột biến S125C dạng đột biến này chưa được phát hiện ở giống bò nào trên thế giới. Như vậy, đã có 2 điểm đột biến trong exon 2 gen myostatin của bò Lai sind và bò Vàng mang tính đặc thù với cùng tần số xuất hiện là 0,1 đã làm thay đổi trình tự axit amin của myostatin. Tại nucleotid 478 có đột biến T thay C, nên bộ ba TTG thay CTG, nhưng không làm thay đổi axit amin Leucine, được ký hiệu là nt 478 T- C. Tần số xuất hiện đột biến này ở bò Lai sind và bò Vàng là 0,83. Dạng đột biến này cũng chưa được phát hiện ở các giống bò khác. So sánh toàn bộ trình tự nucleotid mã hóa axit amin trong exon 2 gen myostatin của bò Lai sind và bò Vàng Việt Nam với trình tự nucleotid trong exon 2. Kết quả giải tình tự của Jeanplong được thể hiện ở hình 2 và hình 3. Hình 2: Trình tự nucleotid mã hoá cho các axit amin trong Exon 2 của bò Việt Nam Hình 3: Trình tự nucleotid mã hoá cho các axit amin trong Exon 2 của theoJeanplong Sự khác biệt về trình tự ADN trong exon 2 gen myostatin của bò Lai sind và bò Vàng so với trình tự gen đã được Jeanplong và Shibata công bố, được mô phỏng qua hình 4. nt374 nt414 nt443 nt478 1: tct tgt tac ctg Ser Cys Tyr Leu 2: tgt tgc tcc ttg Cys Cys Ser Leu 3: tct tgt tac ctg Ser Cys Tyr Leu Hinh 4: Một số trình tự axit amin thay đổi do đột biến trong exon 2 1: Theo Jeanplong (2001) ; 3:Theo Shibata (2003) 2: Theo kết quả giải trình tự bò Lai sind và bò Vàng Kết quả trên cho thấy trong 4 điểm đột biến ở exon 2 gen myostatin của bò Lai sind và bò Vàng chỉ có 2 đột biến tại nucleotid 374 và nucleotid 443 đã làm thay đổi trình tự axit amin. Nhưng điều đáng chú ý nhất là cả ba trường hợp có hai đột biến S125C và Y148S cùng xuất hiện ở ba cá thể bò, nhưng cả ba cá thể này có đột biến trong intron khác nhau. Như vậy để tìm hiểu mức độ ảnh hưởng của các đột biến S125C và Y148S đến hoạt tính sinh học của myostatin hay tỷ lệ thịt xẻ của bò, chúng ta cần ứng dụng phương pháp phát hiện đột biến điểm ở các nucleotid 374 và 443, đánh giá mức độ biểu hiện của gen myostatin trong các mô cơ khác nhau và so sánh khả năng cho thịt của các cá thể mang cả hai đột biến này với những cá thể không mang đột biến. Kết luận Chiều dài đoạn ADN gen myostatin của bò Lai sind và bò Vàng Việt Nam được nhân lên từ cặp mồi LL là 555bp, chứa toàn bộ exon 2 là 374bp. Phát hiện được 4 đột biến điểm, trong đó G thay C ở vị trí nucleotid 374, C thay T ở 414, C thay A ở 443 và T thay C ở 478 với tần số xuất hiện tương ứng là 0,1; 0,9; 0,1 và 0,83. Các đột biến tại nucleotid 374; 443 và 478 mang tính đặc thù của bò Lai sind và bò Vàng Việt Nam. Đột biến tại nucleorid 374 và 443 làm thay đổi bộ ba mã hoá axit amin dẫn đến serine và tyrosine được thay thế bởi cysteine và serine tương ứng tại các nucleotid trên, nhưng các đột biến tại nucleotid 414 và 478 không làm thay đổi axit amin. Tài liệu tham khảo .Bellinge R.H.S,.Liberle D.A,.Iaschi S.P.A, Brien P.A.O and.Tay G.K (2005): Myostatin and its implications on animal breeding: a review. Animal Genetics. Feb, 36 (1): pp. 1-6 Karim L. (2000): Convenient genotyping of six myostatin mutations causing double – muscling in cattle using a multiplex oligonucleotide ligation assay. Animal Genetics, 31(5): pp. 396 –399. .Jeanplong F, Sharma M.,.Somers W.G, Bass J.J. and.Kambadur R (2001): Genomic organization and neonatal expression of the bovine myostatin gene. Mol.Cell. Biochem 220: pp. 31-37 .Shibata M, Ohshima K, Muramoto T,.Matsumoto K, Komatsu M,. Aikawa K,.Fujimura S and.Kadowaki M (2003): Nucleotide sequence of myostatin gene and its developmental expression in skeletal muscles of Japanese Black cattle. Aniaml Science Journal ; 74: pp. 383-390 Smith J.A. (2000): Genetic variationin the bovine myostatin gene in UK beef cattle allele frequencies and haplotype analysis in South Devon. Animal Genetics. Oct,31(5): pp. 306-9 . Q204X và E 226 X trong exon 2 của bò Lai sind và bò Vàng Việt Nam. Điều này cho thấy khả năng bò Lai sind và bò Vàng có cấu trúc đặc thù riêng biệt trong. hóa axit amin trong exon 2 gen myostatin của bò Lai sind và bò Vàng Việt Nam với trình tự nucleotid trong exon 2. Kết quả giải tình tự của Jeanplong được