KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA NẤM Trichoderma VỚI NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Sclerotium rolfsii Sacc TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO pdf

49 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA NẤM Trichoderma VỚI NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Sclerotium rolfsii Sacc TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Trần Thị Thu Hà 1,2 , Phạm Thanh Hòa1 1 Trường Đại học Nông Lâm,

49

KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA NẤM Trichoderma VỚI NẤM BỆNH HẠI CÂY

TRỒNG Sclerotium rolfsii Sacc TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

Trần Thị Thu Hà 1,2 , Phạm Thanh Hòa1

1 Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế 2

Viện Tài Nguyên Môi Trường và Công Nghệ Sinh học, Đại học Huế

Tóm tắt Nấm Scleroitum rolfsii là nấm có nguồn gốc từ đất và có phổ ký chủ rộng Việc

phòng trừ nấm S rolfsii gặp nhiều khó khăn Nấm đối kháng Trichoderma có nhiều tiềm năng trong phòng trừ sinh học nấm S rolfsii Bốn mươi chủng nấm Trichoderma được phân

lập từ 8 mẫu đất khác nhau ở Thừa Thiên Huế và Quảng Trị Khảo nghiệm khả năng ức chế

và đối kháng với S rolfsii, có 11 chủng đối kháng cao; 26 chủng đối kháng trung bình, và 3

chủng đối kháng yếu Mười một chủng ức chế cao có hiệu quả ức chế sợi nấm dao động

61,39 - 88,06% Thời gian hình thành hạch nấm khi có mặt của nấm Trichoderma kéo dài hơn từ 5,33 - 7,67 ngày so với đối chứng (4,67 ngày) Sáu chủng nấm Trichoderma có khả

năng ức chế giảm số lượng hạch nấm hình thành 0,00 - 1,91 hạch nấm/cm2 tản nấm so với đối chứng (3,93 hạch nấm/cm2 tản nấm) Trong đó đáng chú ý chủng ĐR16 có khả năng ức

chế hoàn toàn sự hình thành hạch nấm S.rolfsii, làm cho hạch nấm không hình thành được

Từ khoá: Đối kháng, hạch nấm, nấm có nguồn gốc từ đất, Trichoderma

1 Đặt vấn đề

Nấm Sclerotium rolfsii là một trong những nấm có nguồn gốc từ đất, gây hại

vùng rễ cây trồng cạn và có phổ ký chủ rộng Nguồn bệnh của nấm tồn tại chủ yếu trong đất, trong tàn dư thực vật dạng sợi nấm, hạch nấm Hạch nấm có sức sống cao, tồn tại từ

năm này qua năm khác và là nguồn bệnh cho các cây trồng vụ sau, năm sau Nấm S

rolfsii gây hại trên nhiều cây trồng khác nhau, nhưng phổ biến nhất là gây hại trên lạc và

cây trồng họ cà (Kolte, 1997) Hàng năm, thiệt hại do bệnh gây ra trên cây lạc ở Ấn Độ ước tính khoảng 27% về năng suất lạc, ở Australia vào khoảng 25% (Middleton, 1980)

Ở Việt Nam, vùng Đông Nam Bộ có tỷ lệ bệnh 8-10% ở giai đoạn trước thu hoạch; miền Bắc Việt Nam tỷ lệ bệnh lên tới 20-25% (Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Yến, 1991; Mehan et al., 1991)

Nấm Trichoderma được ứng dụng để bảo vệ cây trồng chống các nấm và vi khuẩn gây bệnh Nấm Trichoderma đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng thông qua

nhiều cơ chế bao gồm ký sinh, chất kháng sinh và enzyme phân hủy vách tế bào của

nấm bệnh (Nguyễn Văn Đĩnh et al., 2007)

Hiện nay, việc phòng trừ nấm S rolfsii chủ yếu dựa vào biện pháp hóa học Tuy

nhiên biện pháp này không bền vững và ảnh hưởng đến môi trường Để phòng trừ nấm

S rolfsii chúng tôi phân lập nấm đối kháng Trichoderma và đánh giá hiệu lực ức chế

của chúng đến tản nấm và sự hình thành hạch nấm của S rolfsii trong điều kiện in vitro

để chọn ra chủng Triochoderma có tiềm năng phòng trừ nấm S rolfsii

2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Bốn mươi chủng nấm đối kháng Trichoderma được phân lập ở Thừa Thiên Huế

và Quảng Trị (Bảng 1)

Chủng nấm Sclerotium rolfsii Sacc H001 được phân lập từ vùng trồng lạc ở

Phong Hòa, Phong Điền, Thừa Thiên Huế (Trần Thị Thu Hà et al., 2011)

Lấy mẫu đất sâu xuống cách mặt đất 15 - 20 cm (khoảng 5 kg/điểm) cho vào bao nilong sạch (100m2 lấy 7 điểm (35kg)), đem trộn đều, lấy ra khoảng 5kg cho vào bao nilong đem về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập

Sau đó lấy ngẫu nhiên ra 3g đất phân lập bằng phương pháp pha loãng trên môi trường chọn lọc ½ PDA theo phương pháp của Elad (1981) có bổ sung propamocarb (Askew, Laing, 1993) Tiến hành cấy truyền và làm thuần bằng phương pháp cấy đơn

bào tử (Lester et al., 2008) Nhận dạng hình thái của nấm Trichoderma theo phương

pháp của Elad (1981)

Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma phân lập được đối với nấm S rolfsii H001 trong điều kiện in vitro Sử dụng môi trường ½ PDA trên đĩa petry Ø 9 cm Cấy nấm đối kháng Trichoderma và nấm Sclerotium rolfsii đối xứng trên cùng một đĩa môi trường ½ PDA Công thức đối chứng chỉ cấy nấm Sclerotium rolfsii, không cấy nấm Trichoderma (Nguyễn Thị Thuần et al., 1996)

Mức độ đối kháng của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh được phân thành 4

cấp và đánh giá mức độ kháng (Nguyễn Thị Thuần et al., 1996; Trần Kim Loang et al., 2009) Tóm tắt như sau:

+ Đối kháng cao (+++): Nấm Trichoderma ức chế nấm S rolfsii ≥60%

+ Đối kháng trung bình (++): Nấm Trichoderma ức chế S rolfsii ≥40-59

+ Đối kháng yếu (+): Nấm Trichoderma ức chế nấm S rolfsii ≤40-20

+ Không đối kháng (-): Nấm Trichoderma ức chế nấm S rolfsii ≤19

Đo đường kính tản nấm của nấm gây bệnh S rolfsii và nấm Trichoderma sau 5

ngày (cm) nuôi cấy để tính % ức chế và đánh giá mức độ đối kháng Tính hiệu quả ức chế theo công thức Abort

Theo dõi thời gian hình thành hạch nấm S rolfsii trên đĩa petry cấy đối xứng với

nấm Trichoderma Đếm số hạch nấm tạo thành ở đĩa có cả nấm Trichoderma và S

rolfsii và ở đĩa đối chứng Tính số hạch nấm hình thành/cm2 tản nấm S rolfsii

Thí nghiệm được bố trí với 3 lần nhắc lại Số liệu được xử lý bằng ANOVA (Tukey test) bằng phần mềm thống kê SPSS 13.0

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Phân lập nấm Trichoderma từ các mẫu đất

Hầu hết các mẫu đất dùng phân lập đều thấy có sự hiện diện của nấm

Trichoderma với số lượng chủng phân lập được khác nhau Trong 8 mẫu đất chúng tôi

phân lập tổng cộng được 40 chủng nấm Trichoderma (Bảng 1)

Bảng 1 Kết quả phân lập nấm Trichoderma từ các mẫu đất khác nhau

T

T

Ký

Số chủng Trichoderma

Điền, TT Huế

3

2 ĐLT Đất dưới vỏ trấu, rơm ủ Quảng Thọ, Quảng

Điền, TT Huế

8

3 ĐP Đất dưới đống phân chuồng Quảng Thọ, Quảng

Điền, TT Huế

4

Điền, TT Huế

1

Quảng Trị

11

6 ĐV Đất phù sa trồng lạc Cam Thành, Cam Lộ,

Quảng Trị

6

Điền, TT Huế

3

Điền, TT Huế

4

3.2 Đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma phân lập được đối với nấm S rolfsii

Trong 40 chủng nấm Trichoderma được khảo sát tính đối kháng với nấm

Sclerotium rolfsii, có 11 chủng ức chế mạnh, chiếm 27,5%; 26 chủng mẫu đối kháng

trung bình, chiếm 65,0% và 3 mẫu đối kháng yếu, chiếm 7,5%

Bảng 2 Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma với nấm S rolfsii H001

Mức đối kháng của Trichoderma Số chủng Tỉ lệ (%)

Chúng tôi tiếp tục tập trung khảo sát đánh giá hiệu quả ức chế của các chủng

nấm Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh (Bảng 3) Hiệu lực ức chế tản nấm S

rolfsii dao động từ 61,39 - 88,06% Chủng có hiệu lực ức chế cao nhất là ĐR16

Hạch nấm là giai đoạn bắt buộc trong chu kì phát triển của nấm S rolfsii, do

nhiều sợi nấm đang kết lại với nhau tạo ra hạch nấm Hạch nấm có sức sống cao và

dạng bảo tồn nguồn bệnh của nấm S rolfsii (Agrios, 2004) Vì vậy, việc nghiên cứu khả

năng ức chế thời gian hình thành hạch nấm cũng như số lượng hạch nấm đóng vai trong

quan trọng khi ứng dụng trong thực tiễn sản xuất Ở công thức đối chứng thì thời gian

hình thành hạch nấm rất sớm, chỉ sau 4,67 ngày Còn ở các công thức khác có mặt của

nấm Trichoderma thì thời gian hình thành hạch nấm kéo dài hơn 5,33 - 7,33 ngày Sáu chủng nấm Trichoderma (ĐTO14, ĐLT15, ĐR16, ĐĐ19, ĐRN21, ĐTL25) ức chế sự

hình thành hạch nấm đạt từ 0,00 - 1,91 hạch nấm/cm2 tản nấm giảm đáng kể có ý nghĩa

so với đối chứng (3,93 hạch nấm/cm2 tản nấm) Đặc biệt chủng ĐR16 ức chế hoàn toàn khả năng hình thành hạch nấm (Bảng 3)

Như vậy, khả năng ức chế hình thành hạch nấm tức là có thể hạn chế được sự tích lũy nguồn bệnh và lây lan của nguồn bệnh ngoài đồng ruộng Khi có mặt của nấm

Trichoderma, thì nấm Trichoderma phát triển nhanh hơn nấm bệnh S rolfsii, chiếm vị

trí, cạnh tranh thức ăn, tiết chất kháng sinh ức chế sự phát triển của nấm bệnh, từ đó ức chế sự hình thành của hạch nấm Đặc biệt, chủng ĐR1,6 cần được nghiên cứu tiếp tục để

có cơ sở phát triển và sử dụng chủng nấm Trichoderma này trong sản xuất chế phẩm

sinh học ứng dụng trong thực tiễn sản xuất

Bảng 3 Tác dụng ức chế của nấm Trichoderma đến tản nấm và hình thành hạch nấm S rolfsii

Trichoderma

ĐK tản nấm

S rolfsii

(cm)

Hiệu lực

ức chế (%)

Hình thành hạch nấm (Ngày)

Số hạch nấm/cm 2 tản nấm

3 ĐTO14 3,10bcd 64,09 5,33 1,65abc

Ghi chú: Trong một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa với p< 0,05; ĐK: Đường kính

Hình 1 Khả năng ức chế của Trichoderma đối với nấm S rolfsii H001 trên môi trường ½PDA

Chủng ĐR16 và chủng ĐRN21

4 Kết luận

Đã phân lập được 40 chủng nấm Trichoderma để khảo nghiệm khả năng ức chế

và đối kháng với nấm bệnh S rolfsii, trong đó có 11 chủng có hiệu quả ức chế cao; 26

chủng đối kháng trung bình và 3 chủng có khả năng ức chế yếu Tiếp tục đánh giá khả năng ức chế của 11 chủng đối kháng cao cho thấy mức độ ức chế của 11 chủng dao động từ 61,39 - 88,06% Thời gian hình thành hạch nấm khi có mặt của nấm

Trichoderma kéo dài hơn có ý nghĩa thống kê từ 5,33 - 7,67 ngày so với đối chứng (4,67

ngày) Sáu chủng nấm Trichoderma (ĐTO14, ĐLT15, ĐR16, ĐĐ19, ĐRN21, ĐTL25)

có khả năng ức chế giảm số lượng hạch nấm hình thành 0,00 - 1,91 hạch nấm/cm2 tản nấm so với đối chứng (3,93 hạch nấm/cm2 tản nấm) Trong đó đáng chú ý chủng ĐR16

có khả năng ức chế 100% sự hình thành hạch nấm S.rolfsii

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Nguyễn Văn Đĩnh và cs, Giáo trình biện pháp sinh học bảo vệ thực vật, Nxb Nông

Nghiệp Hà Nội, 2007, 128-143

[2] Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Yến, Kết quả nghiên cứu bệnh hại lạc ở Việt Nam,

Tiến bộ kỹ thuật về trồng lạc và đậu đỗ ở Việt Nam, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội, 1991,

111-120

[3] Lester W Burgess, Timothy E Knight, Len Tesoriero, Hien Thuy Phan, Cẩm nang chẩn

đoán bệnh cây ở Việt Nam, Nxb Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia

(ACIAR), 2008

[4] Trần Kim Loang, Lê Đình Đôn, Tạ Thanh Nam, Ngô Thị Xuân Thịnh, Nguyễn Thị

Tiến Sỹ, Trần Thị Xê, Phòng trừ bệnh do nấm Phytophthora trên cây hồ tiêu bằng chế

phẩm sinh học Trichoderma (Trico-VTN) tại Tây Nguyên, Tạp chí chuyên ngành bảo vệ

thực vật, Số 2, (2009), 22-27

[5] Mehan VK, Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Ly, Kết quả điều tra, xác định nguyên

nhân gây hiện tượng chết yểu hại lạc ở miền Bắc Việt Nam, Tiến bộ kỹ thuật về trồng

lạc và đậu đỗ ở Việt Nam, Chủ biên: Ngô Thế Dân và C,L,L, Gowda, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội, 1991, 105-109

[6] Nguyễn Thị Thuần, Lê Minh Thi, Dương Thị Hồng, Kết quả nghiên cứu bước bầu về

nấm đối kháng Trichoderma, Tuyển tập công trình nghiên cứu bảo vệ thực vật

1990-1995, Nxb Hà Nội, 1996

[7] Trần Thị Thu Hà, Trương Thị Diệu Hạnh, Trần Thị Nga, Ảnh hưởng của chất hoạt hóa

bề mặt từ các chủng vi khuẩn Pseudomonas đến nấm gây bệnh héo rũ lạc ở điều kiện

in vitro, Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 2, (2011), 30-34

[8] Agrios GN., Plant pathology, 5 th edition Elsevier Academic Press Publication, 2004 [9] Askew DJ, Laing MD, An adapted selective medium for the quantitative isolation of

Trichoderma species, Plant Pathol 42: (1993), 686-690

[10] Elad Y, Chet I, Henis Y., A selective medium for improving qualitative isolation of

Trichoderma spp from soil, Phytoparasitica 9: (1981), 59-67

[11] Kolte SJ., Annual oilseed crops in soilborne diseases of tropical crops RJ Hillocks

and JM Waller (eds) Soilborne Diseases of Tropical Crops, CAB International, (1997), 253-276

[12] Middleton KJ., Groundnut production, utilization, research problem and further

research needs in Australia In: Proc Int Workshop on groundnuts, 13-17 October,

1980 Patancheru, Andhra Pradesh, India, 1980

ANTAGONISTIC ACTIVITY OF Trichoderma ISOLATES AGAINST PLANT PATHOGENIC FUNGUS Sclerotium rolfsii Sacc IN THE IN VITRO

CONDITION Tran Thi Thu Ha 1,2 , Pham Thanh Hoa 1

1 College of Agriculture and Forestry, Hue University 2

Institute of Resources, Environment and Biotechnology, Hue University

Abstract Scleroitum rolfsii is a soilborne fungus that attacks a wide range of host There

have been a lot of difficulties controlling the plant pathogenic disease caused by S rolfsii Antagonistic Trichoderma is a well-known potential biocontrol agent Forty Trichoderma

isolates were isolated from 8 soil samples from Thua Thien Hue and Quang Tri The

antagonism of 40 Trichoderma isolates with S rolfsii was investigated by the dual culture

asay in which 11 isolates were strong antagonists; 27 isolates were moderate and 3 isolates

were weak Elevent strong antagonist isolates were further charaterised and showed a S rolfsii mycelial inhibition efficiency of 61,39 – 88,06% The presence of Trichoderma in

the dual culture asay also prolonged the length of time needed to produce sclerotia from

5,33 to 7,67 days in comparison with the control (4,.67 days) Six Trichoderma isolates

significantly inhibited the formation of sclerotia from 0,00 to 1,91 sclerotia/cm2 of mycelia, while the control produced 3,93 sclerotia/cm2 of mycelia Noticeably, the isolate ĐR16 completely inhibited the formation of sclerotia; no sclerotia were formed

Keywords: Antagonistics, biocontrol, sclerotia, soilborne fungus, Trichoderma