V. Quy trình thực hiện
V.4. Nhuộm Gram –Định danh
Đối với mẫu dương tính thì tiến hành nhuộm Gram để định danh và làm kháng sinh đồ.
Quy trình nhuộm Gram:
- Bước 1: Chuẩn bị
• Lame có đánh số tiêu bản, tên bệnh nhân và khoa.
• Đĩa thạch có khuẩn lạc cần nhuộm gram định danh. - Bước 2: Dàn tiêu bản
Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý vào giữa lame, sau đó dùng Ăng định lượng bắt 1 ít khuẩn lạc phết đều trên lame theo đường xoắn ốc thành làn mỏng hình bầu dục với diện tích 1,5 – 2,5 cm. Hơ nhẹ qua đèn cồn cho khô. Không được hơ nóng quá vì sẽ làm các tế bào co lại.
- Bước 3: Kỹ thuật nhuộm
• Đặt lame lên giá đỡ.
• Phủ đầy dung dịch tím Crystal violet khắp bề mặt lame (để khoảng 30s).
• Rửa nước và nghiêng kính cho ráo.
• Phủ đầy dung dịch Grams Iodine (để khoảng 30s).
• Tẩy màu bằng dung dịch Methanol.
• Rửa nước và nghiêng kính cho ráo.
• Phủ đầy dung dịch Safranin (để 30s).
• Rửa nước.
• Để lame khô tự nhiên. - Bước 4: Đọc kết quả
Nhỏ 1 giọt dầu, đặt lên kính hiển vi soi ở vật kính x100 Gram dương có màu xanh tím còn Gram âm có màu hồng
H V.5 Quy trình nhuộm Gram
Môi trường URI có chứa chất chỉ thị Select4 giúp cho việc định danh sơ bộ một cách dễ dàng thông qua màu sắc và hình dạng khuẩn lạc.
Một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp ở đường tiết niệu:
-
Staphylococcus epidermidis :
+ Cầu khuẩn Gram (+), hiếu khí kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, không di động, sắp xếp theo mọi hướng và tạo thành tụ như chùm nho.
H V.6 Stap.epidermidis khi nhuộm Gram xem dưới kính hiển vi
+ Khuẩn lạc Stap. Epidermidis trên URI có trắng đục, hình tròn đường kính khoảng 2 – 4 mm, lồi, trơn, biên đều.
H V.7 Stap. epidermidis trên UriSelect4
-
+Liên cầu Gram (+), không sinh bào tử, kị khí tùy ý.
+ Khuẩn lạc tròn, lồi, màu xanh lơ, tâm trắng, viền nguyên vẹn, đường kính khoảng 1mm.
Khuẩn lạc già hình dạng không xác định, có viền răng cưa.
H V.8 Strep. agalactiae khi nhuộm Gram xem ở vật kình x100
H V.9 Srtep. agalactiae trên UriSelect4
-
Enterococcus faecalis :
+ Khuẩn lạc trên Uri tròn, trơn, dẹt, màu xanh dương đậm viền xanh nhạt, bên trong là vòng trắng và có tâm xanh đậm.
H V.10 Ent. faecalis trên UriSelect4
- Escherichia coli :
+ Thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, chúng hiện diện nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng.
+ Là trực khuẩn gram (-), di động bằng tiêm mao, không tạo bào tử, hiếu khí hay hiếu khí tùy ý. Nhiệt độ thích hợp 370C nhưng có thể mọc trên 400C, pH 7,4.
+ Đặc điểm khuẩn lạc trên Uri: Có màu hồng/đỏ, tròn đều, lồi, trơn, viền màu hồng nhạt, tâm trắng. Khuẩn lạc già không có hình dạng rõ ràng, viền răng cưa.
H V.12 E. coli trên thạch UriSelect4
-
Enterobacter species :
+ Trực khuẩn Gram (-), không sinh bào tử, di động hay không di động, hiếu khí hoặc kị khí tùy ý.
+ Đặc điểm khuẩn lạc trên Uri: Màu xanh, viền tím, lồi.
-
Acinetobacter species :
+ Những vi khuẩn trước đây thường có nhiều tên khác nhau, nay được gom chung về một họ.
+ Là trực khuẩn Gram (-), hiếu khí và không di động.
+ Khuẩn lạc trên Uri màu trắng đục có tâm trắng, tròn, hơi lồi, trơn.
H V.14 Acinetobacter sp trên UriSelect4
- Klebsiella pneumoniae :
+ Là trực khuẩn Gram (-), không di động, có vỏ polysaccharide đặc trưng, sống kỵ khí tùy ý. + Khuẩn lạc Kleb.pneumoniae trên Uri có màu xanh tím, hình tròn, dẹt, nhám hoặc trơn.
H V.15 Kleb.pneumoniae trên UriSelect4
-
Proteus mirabilis :
+ Trực khuẩn Gram (-), hiếu khí, rất di động. Vi khuẩn có nhiều hình dạng khác nhau trên các môi trường khác nhau.
+ Khuẩn lạc trên Uri: tròn, lồi, không màu, làm môi trường chuyển màu nâu cam.
H V.17 Proteus mirabilis trên UriSelect4
-
Pseudomonas aeruginosa :
+ Vi khuẩn (-), hiếu khí, không sinh bào tử, hình que với khả năng di chuyển một cực. Có khả năng tiết ra nhiều loại sắc tố, bao gồm pyocyanin (lam-lục), fluorescein (vàng-lục) và pyorubin (đỏ-nâu).
+ Khuẩn lạc trên Uri có màu xanh lá đậm dần vào tâm, lồi, dài, có ánh kim, nhớt, viền nhám.
H V.18 Pseu.aeruginosa trên UriSelect4
-
+ C.albicans thuộc họ cryptococcacea không có nang đảm, là một loại nấm men sinh sản bằng đơn bào nảy chồi. Ở bên cạnh đó có thể có sợi nấm giả gồm các tế bào dài dính vào nhau bởi một điểm nhỏ và dễ gãy. Kích thước 2 - 4 µm. Thích nghi với môi trường có nồng độ đường cao và có tính acid cao.
H.V.19 C.albicans xem dưới kính hiển vi
+ C.albicans được cấy trên môi trường sabouraud và để tủ ấm khoảng 2 ngày.
+ Khuẩn lạc trên Sb có hình tròn, lồi, trơn, màu trắng đục. Khuẩn lạc già sẽ thấy khuẩn lạc bông lên.
H V.20 C.albicans trên Sabouraud
Cách cấy nấm:
- Dùng tăm bông lấy 1 ít nước tiểu, sau đó kẻ 2 đường chéo chia thạch thành 4 phần bằng nhau sau đó ria thành các đường chéo zích zắc từ trên xuống dưới ở các phần tư sao cho kín hết mặt thạch.
Kháng sinh đồ là phương pháp tìm độ nhạy cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh. Thử nghiệm kháng sinh đồ được chỉ định thực hiện trên bất cứ vi khuẩn nào gây ra tiến trình nhiễm trùng nhằm đảm bảo hiệu quả của kháng sinh trị liệu.
Thử nghiệm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby – Bauner (phương pháp kháng sinh khuếch tán trên mặt thạch).
V.5.1. Nguyên lý:
Kháng sinh được tẩm vào đĩa giấy theo từng nồng độ cho từng loại. Kháng sinh sẽ khuếch tán trên mặt thạch môi trường nuôi cấy. Đường kính vòng vô khuẩn thể hiện tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh.
- Nếu vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh đó thì nó sẽ không mọc xung quanh đĩa giấy. - Nếu vi khuẩn kháng với kháng sinh đó thì nó sẽ mọc xung quanh đĩa giấy.
- Tùy thuộc vào từng loại kháng sinh với nồng độ kháng sinh tẩm ở mỗi đĩa giấy mà cách đọc mức độ khác nhau (dựa vào đường kính vòng vô khuẩn):
+ Nhạy cảm (S)
• Kết quả là “nhạy cảm” (Susceptible) khi vi khuẩn bị ức chế bởi nồng độ thông thường đạt được của một kháng sinh.
• Có khi dùng với liều đuợc chỉ dịnh để điều trị nhiễm trùng. + Trung gian (I)
• “Kháng trung gian” (Intermediate) là kiểu kháng trong đó với những nồng độ ức chế thông thường của một kháng sinh thuờng cho đáp ứng thấp hơn so với kiểu nhạy cảm.
• Có thể sử dụng kháng sinh đó với liều cao hơn liều thông thuờng. Ðối với kiểu kháng này cần thận trọng khi đánh giá ranh giới mức độ kháng, tránh gây ra sự không thống nhất trong việc nhận định kết quả, đặc biệt đối với các loại thuốc có giới hạn độc tính hẹp.
+ Kháng (R)
• “Kháng” (Resistant) là kiểu kháng mà kháng sinh ở liều thông thuờng không có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn được khẳng định qua nồng độ ức chế và đuờng kính vùng ức chế nằm trong giới hạn của cơ chế kháng, hoặc thực tế kháng sinh không có hiệu quả trong điều trị lâm sàng.
H V.21 Sơ đồ quy trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán
Bước 1: Pha huyền dịch vi khuẩn
Phân lập
Tạo huyền dịch điều chỉnh độ đục
Ria đều vi khuẩn lên đĩa thạch Mueller-Hinton
Đặt đĩa giấy kháng sinh
Ủ 37oC/qua đêm
Đo vòng vô khuẩn
Phân tích và trả lời kết quả
Dùng Ăng định lượng bắt khuẩn lạc nằm riêng lẻ trên đĩa thạch URI hòa vào 2 mL nước muối sinh lý (nồng độ 0.9%). Nếu khuẩn lạc lớn thì chỉ cần bắt 1 khóm còn nếu khuẩn lạc nhỏ thì bắt 3 5 khóm giống nhau nằm riêng lẻ.
Điều chỉnh huyền dịch vi khuẩn đạt độ đục như sau:
•Đối với mẫu nấm: ta đo khoảng 2 2.5 McFarland
•Đối với mẫu vi khuẩn: ta đo khoảng 0.5 0.9 McFarland Bước 2: Dàn vi khuẩn
Ria bằng tăm bông: nhúng tăm bông vào huyền dịch vi khuẩn sau đó nhấc lên và ép bớt huyền dịch vào thành ống, sau đó kẻ 2 đường chéo chia thạch thành 4 phần bằng nhau sau đó ria thành các đường chéo zích zắc từ trên xuống dưới ở các phần tư sao cho kín hết mặt thạch.
1 2 3 4 Bước 3: Đặt đĩa giấy
- Sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng đĩa giấy kháng sinh lên đĩa thạch. - Đặt đĩa kháng sinh cách thành đĩa 1 cm và các đĩa giấy cách nhau ít nhất 2 cm
Chú ý:
• Đĩa giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt, trong vòng 15 phút sau khi ria vi khuẩn lên đĩa thạch.
• Không di chuyển đĩa giấy khi đã tiếp xúc với mặt thạch để tránh các vòng ức chế chồng chéo lên nhau và có thể gây sai số khi đo vòng ức chế.
• Không được đánh rơi đĩa giấy xuống đĩa thạch, sau khi đặt đĩa giấy phải đảm bảo đĩa giấy đã được tiếp xúc hoàn toàn mặt đĩa thạch.
- Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch.
Bước 5: Đọc và biện luận kết quả kháng sinh đồ.
- Sau khi ủ ấm lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn (dùng thước đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp).
- So sánh kích thước vòng vô khuẩn với bảng tiêu chuẩn (bảng 1, 2, 3 hoặc 4 – phụ lục/44 - tùy từng loại vi khuẩn), sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh.
- Nếu có hiện tượng khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế thì có thể bắt khuẩn lạc không thuần (bắt lẫn với khuẩn lạc khác). Nếu trường hợp xuất hiện 2 vòng phân giải (vòng đậm vòng nhạt) có thể chủng vi khuẩn không thuần (xuất hiện đột biến có khả năng kháng kháng sinh).
H V.22 Kháng sinh đồ Gram (+) H V.23 Kháng sinh đồ Gram (-)
H V.26 Cách đặt đĩa kháng sinh lên thạch trong làm kháng sinh đồ
Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả kháng sinh đồ:
- Huyền dịch vi khuẩn làm thử nghiệm không thuần, nồng độ vi khuẩn không đúng với nồng độ Mcfarland chuẩn sẽ ảnh hưởng tới kết quả. Ví dụ: Nếu nồng độ vi khuẩn thấp có thể cho kết quả nhạy cảm giả và ngược lại.
- Môi trường:
+ Chọn môi trường phải phù hợp: Thường các vi khuẩn Gram (-) dễ sinh trưởng thì dùng môi trường Mulller-Hinton.
+ Đối với các vi khuẩn khó tính như tụ cầu hay liên cầu thì ta làm kháng sinh đồ trên BA hoặc URI.
+ Độ dày mỏng của môi trường: Độ dày của môi trường khoảng 4 mm hoặc khoảng 18
25mL thạch vào đĩa có đường kính 90 mm - Đĩa giấy kháng sinh:
+ Đĩa giấy quá hạn, hoạt tính kháng sinh có thể đã giảm. Điều này thường dễ nhận thấy thông qua sự giảm đường kính vòng ức chế của các chủng chuẩn.
+ Đĩa chưa tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch, đánh rơi đĩa khi thực hiện hoặc xê dịch đĩa trên mặt thạch.
H V.27 Kháng sinh đồ trên thạch thường và Uriselect4
H V.28 Kháng sinh đồ trên thạch máu
Kết Luận và Nhận định
Qua thời gian thực tập ở Bệnh viện 175 chúng em có một số kết luận sau:
- Bệnh viện có một vị trí vô cùng quan trọng trong công tác khám, chữa bệnh, phục vụ cộng đồng và Quân đội.
- Bệnh viện đã góp phần đảm bảo vấn đề sức khỏe cho cộng đồng từ đó góp phần phát triển đất nước.
- Đội ngũ cán bộ, nhân viên của Bệnh viện có trình độ chuyên môn và tay nghề cao được thường xuyên trao dồi năng lực thông qua các lớp tập huấn nâng cao chuyên môn và nghiệp vụ. Ngoài ra cán bộ, nhân viên còn được trang bị an toàn lao động đảm bảo an toàn, chuyên môn.
- Ban lãnh đạo Bệnh viện luôn quan tâm đến vấn đề ô nhiễm môi trường, chất lượng cuộc sống của nhân viên, luôn cập nhật những kỹ thuật, trang thiết bị mới nhằm hạn chế ô nhiễm môi trường và tăng tính hiệu quả trong khám chữa bệnh.
- Sự hoạt động ổn định của Bệnh viện đã giải quyết phần nào vấn đề bệnh tật trong cộng đồng.
- Điểm đặc biệt là các cô chú, anh chị trong Bệnh viện luôn vui vẻ, tận tụy trong công viêc, tinh thần trách nhiệm, gần gũi, thân thiện, hướng dẫn tận tình cho chúng em kiến thức chuyên môn cũng như thực tế công việc.
- Một vài nhận định sau quá trình thực tập tại phòng cấy:
+ Việc sử dụng các môi trường chuyên biệt (UriSelect4, BA, Sb,…) mang lại hiệu quả cao trong công tác phân lập và định danh vi khuẩn, vừa chính xác, tiết kiệm lại không tốn nhiều thời gian.
+ UriSelect4 được sử dụng phổ biến làm môi trường phân lập vi khuẩn từ các mẫu nước tiểu do tính nhạy cảm cao, khả năng phục hồi khuẩn lạc lớn và dễ sử dụng. Khác với trong quá trình học tập ở trường là sử dụng bộ kit sinh hóa để định danh vi khuẩn.
+ Các thao tác trong phòng cấy được thực hiện theo khuôn mẫu hợp lí và có tính chuyên môn cao.
+ Hồ sơ bệnh được ghi chú và lưu trữ một cách rõ ràng dễ hiểu.
+Trong giai đoạn thực tập đã tiếp xúc và thao tác với 9 mẫu bệnh phẩm nước tiểu, trong đó số ca âm tính có 4 ca, dương tính 5 ca.
Tài liệu tham khảo
[1] GS.TS Nguyễn Lân Dũng, Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Việt Nam, 2005.
[2] Vi sinh y học, Bộ y tế, Trường đại học y dược Tp. HCM, Khoa điều dưỡng – Kỹ thuật y học, Bộ môn xét nghiệm.
[3] Lịch sử Bệnh viện 175, Chủ biên Thiếu tướng – tiến sĩ Nguyễn Văn Hoàng Đạo, NXB Quân đội nhân dân Hà Nội, 2005.
[4] http://www.nihe.org.vn/new-vn/thuong-quy-va-huong-dan-ky-thuat/936/Ky-thuat-khoanh- giay-khang-sinh-khuech-tan.vhtm [5] http://www.thanhnien.com.vn/pages/20120305/viem-duong-tiet-nieu-o-tre.aspx [6].http://wwwwnguoidigoigioheomay.blogspot.com/2012/06/nhung-vikhuan-gay-benh-5.html? m=1 [7] http://www.quandany.com/Khac/Tintucmoi/tabid/107/smid/657/ArticleID/780/Default.aspx [8] http://elib.quancoconline.com/ui/ViewContent.aspx?g=117592&c=2471629
Phụ lục
Bảng 1: Đường kính vòng vô khuẩn của vi khuẩn Gram (-) _ [2]
Kháng sinh Kí hiệu Hàm lượng SGiới hạn đường kính vùng ức chế (mm)I R Ciprofloxacin CIP 5 µg ≥ 21 16 –20 ≤ 15 Nitro furatoin FT 300µg ≥ 17 15 –16 ≤ 14 Gentamicin GM 10 µg ≥ 15 13 –14 ≤ 12 Ceftazidime CAZ 30 µg ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 Imipenem IPM 10 µg ≥ 16 14 – 15 ≤ 13 Amikacin AN 30 µg ≥ 17 15 – 16 ≤ 14 Meropenem MEM 10 µg ≥ 16 14 – 15 ≤13 Nalidixi acid NA 30 µg ≥ 19 14 – 18 ≤ 13 Cefotaxime CTX 30 µg ≥ 23 22 – 15 ≤ 14
Bảng 2: Đường kính vòng vô khuẩn của vi khuẩn Gram (+) _ [2]
Kháng sinh Kí hiệu Hàm lượng SGiới hạn đường kính vùng ức chế (mm)I R Erythromycin E 15 µg ≥ 23 14 – 22 ≤ 13 Vancomycin VA 30 µg ≥ 12 10 – 11 ≤ 9 Oxacillin OX 1 µg ≥ 13 11 – 12 ≤ 10 Cefotaxim CTX 30 µg ≥ 23 22 – 15 ≤ 14 Gentamicin GM 10 µg ≥ 15 13 – 14 ≤ 12 Cefalexin CN 30 µg ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 Ciprofloxacin CIP 5 µg ≥ 21 16 – 20 ≤ 15
Bảng 3: Đường kính vòng vô khuẩn của nấm _ [2]
Kháng sinh Kí hiệu Hàm lượng SGiới hạn đường kính vùng ức chế (mm)I R Econazole EC 50 µg ≥ 24 21 – 23 ≤ 20 Clotrimazole CTR 50µg ≥ 23 18 – 22 ≤ 17 Ketoconazole KET 50µg ≥ 21 18 – 20 ≤ 17 Nystatin NY 100IU ≥ 23 20 – 22 ≤ 19 Miconazole MCZ 50 µg ≥ 21 18 – 20 ≤ 17
Bảng 4: Đường kính vòng vô khuẩn của trực khuẩn mủ xanh _ [2]