V. Quy trình thực hiện
V.5.2. Cách tiến hành
H V.21 Sơ đồ quy trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán
Bước 1: Pha huyền dịch vi khuẩn
Phân lập
Tạo huyền dịch điều chỉnh độ đục
Ria đều vi khuẩn lên đĩa thạch Mueller-Hinton
Đặt đĩa giấy kháng sinh
Ủ 37oC/qua đêm
Đo vòng vô khuẩn
Phân tích và trả lời kết quả
Dùng Ăng định lượng bắt khuẩn lạc nằm riêng lẻ trên đĩa thạch URI hòa vào 2 mL nước muối sinh lý (nồng độ 0.9%). Nếu khuẩn lạc lớn thì chỉ cần bắt 1 khóm còn nếu khuẩn lạc nhỏ thì bắt 3 5 khóm giống nhau nằm riêng lẻ.
Điều chỉnh huyền dịch vi khuẩn đạt độ đục như sau:
•Đối với mẫu nấm: ta đo khoảng 2 2.5 McFarland
•Đối với mẫu vi khuẩn: ta đo khoảng 0.5 0.9 McFarland Bước 2: Dàn vi khuẩn
Ria bằng tăm bông: nhúng tăm bông vào huyền dịch vi khuẩn sau đó nhấc lên và ép bớt huyền dịch vào thành ống, sau đó kẻ 2 đường chéo chia thạch thành 4 phần bằng nhau sau đó ria thành các đường chéo zích zắc từ trên xuống dưới ở các phần tư sao cho kín hết mặt thạch.
1 2 3 4 Bước 3: Đặt đĩa giấy
- Sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng đĩa giấy kháng sinh lên đĩa thạch. - Đặt đĩa kháng sinh cách thành đĩa 1 cm và các đĩa giấy cách nhau ít nhất 2 cm
Chú ý:
• Đĩa giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt, trong vòng 15 phút sau khi ria vi khuẩn lên đĩa thạch.
• Không di chuyển đĩa giấy khi đã tiếp xúc với mặt thạch để tránh các vòng ức chế chồng chéo lên nhau và có thể gây sai số khi đo vòng ức chế.
• Không được đánh rơi đĩa giấy xuống đĩa thạch, sau khi đặt đĩa giấy phải đảm bảo đĩa giấy đã được tiếp xúc hoàn toàn mặt đĩa thạch.
- Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch.
Bước 5: Đọc và biện luận kết quả kháng sinh đồ.
- Sau khi ủ ấm lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn (dùng thước đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp).
- So sánh kích thước vòng vô khuẩn với bảng tiêu chuẩn (bảng 1, 2, 3 hoặc 4 – phụ lục/44 - tùy từng loại vi khuẩn), sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh.
- Nếu có hiện tượng khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế thì có thể bắt khuẩn lạc không thuần (bắt lẫn với khuẩn lạc khác). Nếu trường hợp xuất hiện 2 vòng phân giải (vòng đậm vòng nhạt) có thể chủng vi khuẩn không thuần (xuất hiện đột biến có khả năng kháng kháng sinh).
H V.22 Kháng sinh đồ Gram (+) H V.23 Kháng sinh đồ Gram (-)
H V.26 Cách đặt đĩa kháng sinh lên thạch trong làm kháng sinh đồ
Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả kháng sinh đồ:
- Huyền dịch vi khuẩn làm thử nghiệm không thuần, nồng độ vi khuẩn không đúng với nồng độ Mcfarland chuẩn sẽ ảnh hưởng tới kết quả. Ví dụ: Nếu nồng độ vi khuẩn thấp có thể cho kết quả nhạy cảm giả và ngược lại.
- Môi trường:
+ Chọn môi trường phải phù hợp: Thường các vi khuẩn Gram (-) dễ sinh trưởng thì dùng môi trường Mulller-Hinton.
+ Đối với các vi khuẩn khó tính như tụ cầu hay liên cầu thì ta làm kháng sinh đồ trên BA hoặc URI.
+ Độ dày mỏng của môi trường: Độ dày của môi trường khoảng 4 mm hoặc khoảng 18
25mL thạch vào đĩa có đường kính 90 mm - Đĩa giấy kháng sinh:
+ Đĩa giấy quá hạn, hoạt tính kháng sinh có thể đã giảm. Điều này thường dễ nhận thấy thông qua sự giảm đường kính vòng ức chế của các chủng chuẩn.
+ Đĩa chưa tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch, đánh rơi đĩa khi thực hiện hoặc xê dịch đĩa trên mặt thạch.
H V.27 Kháng sinh đồ trên thạch thường và Uriselect4
H V.28 Kháng sinh đồ trên thạch máu
Kết Luận và Nhận định
Qua thời gian thực tập ở Bệnh viện 175 chúng em có một số kết luận sau:
- Bệnh viện có một vị trí vô cùng quan trọng trong công tác khám, chữa bệnh, phục vụ cộng đồng và Quân đội.
- Bệnh viện đã góp phần đảm bảo vấn đề sức khỏe cho cộng đồng từ đó góp phần phát triển đất nước.
- Đội ngũ cán bộ, nhân viên của Bệnh viện có trình độ chuyên môn và tay nghề cao được thường xuyên trao dồi năng lực thông qua các lớp tập huấn nâng cao chuyên môn và nghiệp vụ. Ngoài ra cán bộ, nhân viên còn được trang bị an toàn lao động đảm bảo an toàn, chuyên môn.
- Ban lãnh đạo Bệnh viện luôn quan tâm đến vấn đề ô nhiễm môi trường, chất lượng cuộc sống của nhân viên, luôn cập nhật những kỹ thuật, trang thiết bị mới nhằm hạn chế ô nhiễm môi trường và tăng tính hiệu quả trong khám chữa bệnh.
- Sự hoạt động ổn định của Bệnh viện đã giải quyết phần nào vấn đề bệnh tật trong cộng đồng.
- Điểm đặc biệt là các cô chú, anh chị trong Bệnh viện luôn vui vẻ, tận tụy trong công viêc, tinh thần trách nhiệm, gần gũi, thân thiện, hướng dẫn tận tình cho chúng em kiến thức chuyên môn cũng như thực tế công việc.
- Một vài nhận định sau quá trình thực tập tại phòng cấy:
+ Việc sử dụng các môi trường chuyên biệt (UriSelect4, BA, Sb,…) mang lại hiệu quả cao trong công tác phân lập và định danh vi khuẩn, vừa chính xác, tiết kiệm lại không tốn nhiều thời gian.
+ UriSelect4 được sử dụng phổ biến làm môi trường phân lập vi khuẩn từ các mẫu nước tiểu do tính nhạy cảm cao, khả năng phục hồi khuẩn lạc lớn và dễ sử dụng. Khác với trong quá trình học tập ở trường là sử dụng bộ kit sinh hóa để định danh vi khuẩn.
+ Các thao tác trong phòng cấy được thực hiện theo khuôn mẫu hợp lí và có tính chuyên môn cao.
+ Hồ sơ bệnh được ghi chú và lưu trữ một cách rõ ràng dễ hiểu.
+Trong giai đoạn thực tập đã tiếp xúc và thao tác với 9 mẫu bệnh phẩm nước tiểu, trong đó số ca âm tính có 4 ca, dương tính 5 ca.
Tài liệu tham khảo
[1] GS.TS Nguyễn Lân Dũng, Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Việt Nam, 2005.
[2] Vi sinh y học, Bộ y tế, Trường đại học y dược Tp. HCM, Khoa điều dưỡng – Kỹ thuật y học, Bộ môn xét nghiệm.
[3] Lịch sử Bệnh viện 175, Chủ biên Thiếu tướng – tiến sĩ Nguyễn Văn Hoàng Đạo, NXB Quân đội nhân dân Hà Nội, 2005.
[4] http://www.nihe.org.vn/new-vn/thuong-quy-va-huong-dan-ky-thuat/936/Ky-thuat-khoanh- giay-khang-sinh-khuech-tan.vhtm [5] http://www.thanhnien.com.vn/pages/20120305/viem-duong-tiet-nieu-o-tre.aspx [6].http://wwwwnguoidigoigioheomay.blogspot.com/2012/06/nhung-vikhuan-gay-benh-5.html? m=1 [7] http://www.quandany.com/Khac/Tintucmoi/tabid/107/smid/657/ArticleID/780/Default.aspx [8] http://elib.quancoconline.com/ui/ViewContent.aspx?g=117592&c=2471629
Phụ lục
Bảng 1: Đường kính vòng vô khuẩn của vi khuẩn Gram (-) _ [2]
Kháng sinh Kí hiệu Hàm lượng SGiới hạn đường kính vùng ức chế (mm)I R Ciprofloxacin CIP 5 µg ≥ 21 16 –20 ≤ 15 Nitro furatoin FT 300µg ≥ 17 15 –16 ≤ 14 Gentamicin GM 10 µg ≥ 15 13 –14 ≤ 12 Ceftazidime CAZ 30 µg ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 Imipenem IPM 10 µg ≥ 16 14 – 15 ≤ 13 Amikacin AN 30 µg ≥ 17 15 – 16 ≤ 14 Meropenem MEM 10 µg ≥ 16 14 – 15 ≤13 Nalidixi acid NA 30 µg ≥ 19 14 – 18 ≤ 13 Cefotaxime CTX 30 µg ≥ 23 22 – 15 ≤ 14
Bảng 2: Đường kính vòng vô khuẩn của vi khuẩn Gram (+) _ [2]
Kháng sinh Kí hiệu Hàm lượng SGiới hạn đường kính vùng ức chế (mm)I R Erythromycin E 15 µg ≥ 23 14 – 22 ≤ 13 Vancomycin VA 30 µg ≥ 12 10 – 11 ≤ 9 Oxacillin OX 1 µg ≥ 13 11 – 12 ≤ 10 Cefotaxim CTX 30 µg ≥ 23 22 – 15 ≤ 14 Gentamicin GM 10 µg ≥ 15 13 – 14 ≤ 12 Cefalexin CN 30 µg ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 Ciprofloxacin CIP 5 µg ≥ 21 16 – 20 ≤ 15
Bảng 3: Đường kính vòng vô khuẩn của nấm _ [2]
Kháng sinh Kí hiệu Hàm lượng SGiới hạn đường kính vùng ức chế (mm)I R Econazole EC 50 µg ≥ 24 21 – 23 ≤ 20 Clotrimazole CTR 50µg ≥ 23 18 – 22 ≤ 17 Ketoconazole KET 50µg ≥ 21 18 – 20 ≤ 17 Nystatin NY 100IU ≥ 23 20 – 22 ≤ 19 Miconazole MCZ 50 µg ≥ 21 18 – 20 ≤ 17
Bảng 4: Đường kính vòng vô khuẩn của trực khuẩn mủ xanh _ [2]
Kháng sinh Kí hiệu Hàm lượng SGiới hạn đường kính vùng ức chế (mm)I R Ciprofloxacin CIP 5 µg ≥ 21 16.-.20 ≤ 15 Pristinamycin PT 15µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 Tobramycin TM 10 µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 Ceftazidime CAZ 30 µg ≥ 18 15 - 17 ≤ 14 Imipenem IPM 10 µg ≥ 16 14 - 15 ≤ 13 Amikacin AN 30 µg ≥ 17 15 - 16 ≤ 14 Meropenem MEM 10 µg ≥ 16 14 - 15 ≤13
Cefotaxime CTX 30 µg ≥ 23 22 - 15 ≤ 14
c
Chuẩn bị các đĩa thạch
• UriSelect 4: Cân 20g môi trường có sẵn + 2g agar hòa vào 400 mL nước cất 2 lần.
• Sabouraud: Cân 26g môi trường có sẵn + 2g agar hòa vào 400 mL nước cất 2 lần.
• Mueller-Hinton: Cân 136g môi trường có sẵn + 2g agar hòa vào 400 mL nước cất 2 lần. - Hấp tiệt trùng ở 1210C/30 phút, để nguội môi trường tới 500C.
- Đổ môi trường vào đĩa petri (đường kính 90 mm) dày khoảng 4 mm (tương ứng với khoảng 25 mL thạch).
Lưu ý:
+ Các đĩa thạch phải được đặt trên một mặt phẳng ngang để đảm bảo độ sâu cho tất cả các vị trí trong đĩa bằng nhau cho tới khi thạch đông ở nhiệt độ phòng.
+ Đổ quá nhiều hoặc quá ít thạch có thể ảnh hưởng đến kết quả: Nếu thạch quá dày có thể tạo ra kết quả kháng giả, hoặc thạch quá mỏng có thể tạo ra kết quả nhạy cảm giả.
+ Dùng ngay các đĩa thạch trong ngày, nếu chưa dùng ngay thì gói kín và bảo quản ở trong tủ lạnh (2 - 80C) và sử dụng trong vòng 2 tuần. Khi gói nên lật úp các đĩa thạch để hạn chế nước đọng trên mặt thạch, ghi tên môi trường và ngảy đổ môi trường.
+ Sau mỗi lần đổ đĩa ta nên để 1 gói đĩa thạch vào tủ ấm và để qua đêm xem lô đĩa mới có bị tạp nhiễm hay không.
+ Khi sử dụng, nếu mặt thạch ướt thì phơi các đĩa thạch trong tủ ấm (35 - 370C) khoảng 15 - 30 phút. Không mở nắp đĩa thạch khi phơi để tránh bị nhiễm.