ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA GIỐNG LAN RỪNG Dendrobium THU THẬP TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ RỪNG NAM CÁT TIÊN BẰNG KỸ THUẬT RAPD pdf

Để nghiên cứu đa dạng di truyền, trên thế giới hiê ̣n có nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái, chỉ thị isozyme hay chỉ thị phân tử RFLP, AFLP,

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA GIỐNG LAN

HỒ CHÍ MINH VÀ RỪNG NAM CÁT TIÊN

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: TRƯƠNG MINH DŨNG

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA GIỐNG LAN

HỒ CHÍ MINH VÀ RỪNG NAM CÁT TIÊN

BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa: 2003 – 2007 Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS VÕ THÁI DÂN

CN LƯU PHÚC LỢI

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

iii

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

- Ban Giám Đốc Viê ̣n Công Nghê ̣ Sinh Ho ̣c và Môi Trường – Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm TP HCM

- Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua

Đã hỗ trợ và tạo điều kiện tốt trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài Tôi xin trân tro ̣ng gửi lời biết ơn đến các thầy cô:

CN Huỳnh Kim Hưng và toàn thể các anh chị thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học

và Môi Trường – Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm TP HCM đã quan tâm giúp đỡ trong suốt thời gian ở phòng thí nghiệm

Kỹ sư Huỳnh Tuấn Anh – trưởng Tra ̣m khuyến nông huyê ̣n Tân Phú , tỉnh Đồng Nai đã tận tình hướng dẫn trong suốt thời gian thu mẫu tại rừ ng Nam Cát Tiên

Cô Nguyễn Thị Cách và các anh Trường , Tùng, chị Vân đã tận tình hướng dẫn trong suốt thời gian thu mẫu ta ̣i Thành phố Hồ Chí Minh

Toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

TP HCM, tháng 09 năm 2007 Trương Minh Dũng

iv

TRƯƠNG MINH DŨNG , Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, 9/2007 “Đánh

giá đa dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium thu thâ ̣p ta ̣i Thành phố Hồ

Chí Minh và rừng Nam Cát Tiên bằng kỹ thuâ ̣t RAPD.”

Hô ̣i đồng hướng dẫn: TS Trần Thi ̣ Dung, TS Võ Thái Dân, CN Lưu Phúc Lợi

Đi ̣a điểm nghiên cứu: Viê ̣n Công Nghê ̣ Sinh Ho ̣c và Môi Trường , Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Viê ̣t Nam sở hữu nhiều nguồn gen quý hiếm, đô ̣c đáo, mới la ̣ của giống lan rừng

Dendrobium Các giống Dendrobium không những đe ̣p , giá trị kinh tế cao , mà còn có giá trị y học Vì vậy, trước hết chúng ta cần phải khảo sát sự đa da ̣ng di truyền

của các giống lan rừng Dendrobium, tạo nền tảng cho công tác bảo tồn và tạo các

giống mới, trên cơ sở đó, xây dựng thương hiê ̣u cho cây lan Viê ̣t Nam

Thiết lâ ̣p quy trình li trích DNA tổng số từ mẫu lá có đô ̣ tinh sa ̣ch và ổn đi ̣n h cao Bên cạnh đó, xây dựng phản ứng PCR với primer RAPD cho tính đa hình cao

Từ đó, phân tích tính đa da ̣ng di truyền của 10 giống lan rừng Dendrobium thu thâ ̣p

tại Thành phố Hồ Chí Minh và Nam Cát Tiên dựa trên phần mềm NTSYSp c Version 2.1 và Winboot

Quy trình li trích DNA từ mẫu lá có đô ̣ tinh sa ̣ch và ổn đi ̣nh cao đã được tối ưu thành công 6 primer ngẫu nhiên : OPAC10, OPAH13, 0PB01, OPB08, S1384, U693 được dùng trong phân tích đa da ̣ng di truyền của các giống lan khảo sát bằng kỹ thuật RAPD Trên cơ sở đó , xây dựng sơ đồ phân nhóm di truyền của 10 giống

lan rừng Dendrobium

Sơ đồ phân nhóm di truyền cho thấy các giống lan khảo sát có sự đa da ̣ng cao về

mă ̣t di truyền, phân thành 5 nhóm với mức tương đồng gen từ 0.39 – 0.79

v

Genetic diversity analysis of wild Dendrobium stem at Ho Chi Minh city

and Nam Cat Tien forest by RAPD

Supervisor: Tran Thi Dung1, PhD; Vo Thai Dan2, PhD; Luu Phuc Loi1, BSc Student: Truong Minh Dung1

1

Department of Biotechnology, Nong Lam university, Ho Chi Minh city

2Faculty of Agriculture, Nong Lam university, Ho Chi Minh city

To analysis the genetic diversity of wild Dendrobium orchid, six decamers were used for 10 wild Dendrobium species, collected from Ho Chi Minh city and Nam

Cat Tien forest (Dong Nai province) Collecting 10 species from Ho Chi Minh city and Nam Cat Tien forest (Dong Nai province), optimizing of protocols for DNA extraction and purification, constructing of protocol for RAPD, analyzing the

genetic of 10 wild Dendrobium species by RAPD and constructing the dendrogram

by NTSYSpc 2.1 software, Winboot program are the objective of the study

Methods

- To identify 10 wild Dendrobium species with genotype

- Extraction of total DNA from fresh tissue of 10 wild Dendrobium species

- Six random primer: OPAC10, OPAH13, OPB01, OPB08, S1384, U693 were used to analysis of genetic diversity

- Following RAPD reactions, dendrogram were constructed by NTSYSpc 2.1 and Winboot program

Conclusion

Six decamers are enough to compare the identity of all samples We could use those primers to establish the methodology to perform genetic comparisons in

Vietnam Besides, the genetic diversity among 10 wild Dendrobium species were

established to support the breeder overcome difficulties in plant salection

vi

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM TẮT KHÓA LUẬN iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CHƢ̃ VIẾT TẮT ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG x

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ x

DANH SÁCH CÁC HÌNH xi

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 2

1.2 Mục tiêu – nội dung – yêu cầu đề tài 2

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1.Giới thiệu tổng quan về giống lan rừng Dendrobium 3

2.1.1 Đặc điểm hình thái 3

2.1.2 Các nhóm lan Dendrobium 5

2.1.3 Đặc điểm của 10 giống lan nghiên cứu trong đề tài 6

2.2 Quy trình li trích DNA ở tế bào thực vật 8

2.3 Giới thiệu về kỹ thuật PCR 11

2.3.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR 11

2.3.2 Thành phần thực hiện một phản ứng PCR 14

2.3.2.1 Mẫu 14

2.3.2.2 Primer 14

2.3.2.3 dNTP 16

2.3.2.4 MgCl2 17

2.3.2.5 Taq 17

vii

di truyền 18

2.4.1 Đa dạng di truyền 18

2.4.2 Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 18

2.4.2.1 Phương pháp chỉ thị hình thái 18

2.4.2.2 Phương pháp chỉ thị isozyme 19

2.4.2.3 Phương pháp dùng chỉ thị phân tử 19

2.5 Đánh giá sự đa da ̣ng di truyền bằng phần mềm NTSYSpc và Winboot 26

2.5.1 NTSYSpc version 2.1 26

2.5.2 Winboot 28

2.6 Các công trình nghiên cứu có liên quan 29

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 29

2.6.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 31

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 32

3.1 Nội dung, thời gian và địa điểm 32

3.1.1 Nội dung 32

3.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 32

3.2 Vật liệu 32

3.2.1 Các giống lan Dendrobium thí nghiệm 32

3.2.2 Thiết bị - dụng cụ 34

3.2.3 Hóa chất thí nghiệm 34

3.3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 36

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 36

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 36

4 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 45

4.1 Điều tra và thu thâ ̣p các giống lan rừng Dendrobium từ Thành phố Hồ Chí Minh và rừng Nam Cát Tiên dựa trên đă ̣c điểm hình thái 45

viii

4.3 Xây dƣ̣ng quy trình PCR dƣ̣a trên kỹ thuâ ̣t RAPD cho tính

đa hình cao 53

4.4 Phân tích sƣ̣ đa da ̣ng di truyền của 10 giống lan rƣ̀ng Dendrobium dựa trên 30 primer RAPD 54

4.5 Phân tích sƣ̣ đa da ̣ng di truyền của 10 giống lan rƣ̀ng Dendrobium bằng phần mềm NTSYSpc version 2.1 và Winboot 60

5 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 69

5.1 Kết luận 69

5.2 Đề nghị 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC

CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA: Deoxyribonucleic acid

dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate

EB: extraction buffer

EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

mM: milimolar (milimol/lite)

NCT: Nam Cát Tiên

OD: Optical density

PCR: Polymerase Chain Reaction

pmol: Picomol

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA: Ribonucleic acid

Rnase: Ribonuclease

SSR: Simple Sequence Repeat

Ta : Annealing tenperature (nhiệt độ bắt cặp)

TAE: Tris – Acetate – EDTA

TE: Tris – EDTA

Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)

TP HCM: Thành phố Hồ Chí Minh

U: Đơn vị hoạt tính

UPGMA: Unweighted Pair Group Method with Arithmetic

VNTR: variable number tandem repeat

x

Bảng 2.1 Nồng độ agarose và kích thước đoạn cần phân tách 11

Bảng 3.1 Primer 34

Bảng 3.2 Các giống lan thu thập từ Tp Hố Chí Minh và rừng Nam Cát Tiên 37

Bảng 3.4 Điểm khác nhau giữa 3 quy trình li trích 40

Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR 42

Bảng 3.6 Quy trình PCR 42

Bảng 4.1 So sánh các đă ̣c trưng về lá của các giống lan rừng Dendrobium 46

Bảng 4.2 So sánh các đă ̣c trưng về thân của các giống lan rừng Dendrobium 47

Bảng 4.3 Tỉ lệ DNA tổng số tinh sạch trong 3 quy trình li trích khảo sát 50

Bảng 4.4 Nồng đô ̣ DNA (ng/µl) tổng số theo 3 quy trình 51

Bảng 4.5 Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR 53

Bảng 4.6 Quy trình PCR 53

Bảng 4.7 Số band khuếch đại và band đa hình trên một số primer 55

Bảng 4.8 Hệ số đồng dạng của 10 giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh và Nam Cát Tiên 62

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1 Tỉ lệ DNA mẫu tổng số tinh sạch li trích theo 3 quy trình khảo sát 50

Biểu đồ 4.2 Biểu đồ thể hiện tính ổn định của 3 quy trình khảo sát 51

xi

Hình 2.1 Các giống lan rừng Dendrobium 5

Hình 2.2 Nguyên lí của phản ứng PCR 13

Hình 2.3 Nguyên lí của phản ứng RFLP 21

Hình 2.4 Nguyên lí của phản ứng AFLP 23

Hình 2.5 Nguyên lí của phản ứng RAPD 25

Hình 2.6 Nguyên lí của phản ứng microsatellite 26

Hình 2.7 Giao diê ̣n NTSYSpc 2.10m 27

Hình 2.8 Giao diê ̣n chương trình Winboot 29

Hình 3.1 Các giống lan Dendrobium nghiên cứu trong đề tài 33

Hình 4.1 So sánh các đă ̣c trưng về lá của các giống lan rừng Dendrobium 45

Hình 4.2 DNA li trích theo quy trình 1 49

Hình 4.3 DNA li trích theo qui trình 2 49

Hình 4.4 DNA li trích theo quy trình 3 50

Hình 4.5 Ảnh điê ̣n di sản phẩm RAPD với primer OPAC10 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh 54

Hình 4.6 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAC10 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh 55

Hình 4.7 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAC10 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên 56

Hình 4.8 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAH13 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh 56

Hình 4.9 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAH13 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên 57

Hình 4.10 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPB01 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh 57

Hình 4.11 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPB01 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên 58

xii

Hình 4.13 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPB08 đối với các

giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên 59

Hình 4.14 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer S1384 đối với các

giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh 59

Hình 4.15 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer S1384 đối với các

giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên 60

Hình 4.16 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer U693 đối với các

giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh 60

Hình 4.17 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer U693 đối với các

giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên 61 Hình 4.18 Sơ đồ phân nhóm di truyền dựa trên kết quả RAPD đối với

nhóm lan rừng Dendrobium thu thập từ Thành phố Hồ Chí Minh và Nam Cát Tiên 63 Hình 4.19 Sơ đồ PCA dƣ̣a trên đă ̣c điểm hình thái của các giống lan

rừng Dendrobium khảo sát 64

Hình 4.20 Sơ đồ 3D PCA dƣ̣a trên đă ̣c điểm hình thái của các giống lan

rừng Dendrobium khảo sát 65

Với khí hâ ̣u nhiệt đới, Việt Nam nói chung và Thành phố Hồ Chí Minh, Nam Cát Tiên nói riêng có nhiều điều kiện tự nhiên thích hợp với việc phát triển nhiều

loại phong lan, địa lan, đă ̣c biê ̣t là giống Dendrobium Lan Dendrobium không

những đe ̣p mà còn có giá tri ̣ cao về mă ̣t kinh tế Bên cạnh việc nhập nội, lai tạo, nhân giống các giống mới, chúng ta còn sở hữu nhiều nguồn gen quý hiếm, độc đáo,

mới lạ của giống lan rừng Dendrobium

Do hiê ̣n nay , các giống lan rừng vẫn chưa được quan tâm nhiều trong xã hội ,

nên tiềm năng phát tri ển của giống lan rừng Dendrobium vẫn chưa được khai thác

triê ̣t để Vì vậy , trước hết chúng ta cần phải tiến hành khảo sát tính đa dạng di

truyền các giống lan rừng Dendrobium giữa các địa phương, trên cơ sở đó thực hiện

có hiệu quả việc nhân và tạo giống mới, đồng thời xây dựng các định hướng về

kiểm tra, quản lý và bảo vệ nguồn gen giống lan Dendrobium trong nước

Để nghiên cứu đa dạng di truyền, trên thế giới hiê ̣n có nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái, chỉ thị isozyme hay chỉ thị phân tử (RFLP, AFLP, RAPD, SSR) Tùy vào đối tượng, điều kiện và mục đích nghiên cứu

mà người ta lựa chọn phương pháp phù hợp nhất Trong đề tài này chúng tôi tiến

hành nghiên cứu tính đa dạng về di truyền của giống lan rừng Dendrobium bằng kỹ

thuật RAPD vì đây là kỹ thuật đơn giản, cho kết quả nhanh, và đặc biệt là không cần phải biết trước trình tự bộ gen của đối tượng

Trên cở sở đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu và thực hiê ̣n đề tài : “Đánh giá

đa dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium thu thập ta ̣i Thành ph ố Hồ

Chí Minh và rừng Nam Cát Tiên bằng kỹ thuâ ̣t RAPD”

Kết quả của đề tài này tạo cơ sở cho việc xây dựng thương hiệu cho cây lan Việt Nam nói chung và cây lan Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng

1.2 Mục tiêu – nô ̣i dung – yêu cầu đề tài

Mục tiêu

Xây dựng phương pháp nghiên cứu tối ưu nhằm phân tích sự đa dạng di truyền

của giống lan rừng Dendrobium, thu thập từ Thành phố Hồ Chí Minh và rừng Nam

Cát Tiên

Nô ̣i dung

- Điều tra và thu thâ ̣p các giống lan rừng Dendrobium từ Thành phố Hồ Chí Minh và rừng Nam Cát Tiên dựa trên đă ̣c điểm hình thái

- Tối ưu phương pháp ly trích DNA tổng số từ mẫu lá tươi cho đô ̣ tinh sa ̣ch và

ổn định cao

- Xây dựng quy trình PCR dựa trên kỹ thuâ ̣t RAPD cho t ính đa hình cao

- Phân tích sự đa da ̣ng di truyền của các giống lan rừng Dendrobium dựa trên primer RAPD

- Phân tích sự đa da ̣ng di truyền của các giống lan khảo sát bằng phần mềm NTSYSpc version 2.1 và Winboot

Yêu cầu

- Định danh chính xác các giống lan dựa trên đă ̣c điểm hình thái

- Li trích DNA tổng số từ mẫu lá với độ tinh sạch cao

- Xây dựng được qui trình PCR – RAPD ổn định, cho tính đa hình cao

- Đánh giá sự khác biệt di truyền giữa các giống lan rừng Dendrobium qua việc

phân tích RAPD với primer ngẫu nhiên

- Mô tả quan hệ di truyền của các giống lan rừng Dendrobium bằng phần mềm

NTSYS và Winboot

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu tổng quan về giống lan rừng Dendrobium

Dendrobium thuộc tông Epidendreae, họ phụ Epidendroideae, phân họ Orchidaceae

Lan Dendrobium có màu sắc phong phú, không thua kém bất cứ giống lan nào khác từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại Dendrobium có sọc nằm ngang hoặc

thẳng đứng, hoặc có đốm to hay nhỏ

Giống Dendrobium có trên 1200 loài và càng ngày càng lai tạo ra rất nhiều

giống mới Loài hoa này có xuất xứ ở châu Á, Philippines, Borneo, Australia, New Guinea và New Zealand

Cây có thể mọc ở nhiều vùng địa lý khác nhau, vừa chịu đươ ̣c khí hậu nóng ẩm lại vừa chịu đươ ̣c khí hậu khô hạn, ví dụ như vùng rừng thấp nhiệt đới, đồi núi cao của dãy Himalaya hay kể cả sa mạc khô hạn của Australia Điều kiện khí hậu lí tưởng nhất cho việc nuôi trồng loài hoa này là từ 280C- 330C nên rất thích hợp với điều kiện Việt Nam nói chung, Thành phố Hồ Chí Minh và Nam Cát Tiên nói riêng

Dendrobium không chỉ là loài hoa có giá trị về mặt mỹ thuật mà còn là một cây

dược liệu quí của nền y học cổ truyền

2.1.1 Đặc điểm hình thái

Rễ: Ngoài chức năng neo bám và nuôi dưỡng cho cây, rễ còn có vai trò dự trữ ,

hô hấp và cả nhiệm vụ quang hợp (photosynthese) Rễ càng phát triển còn có khả năng gạn lọc hấp thu các muối khoáng , các chất dinh dưỡng , các chất tan trong nước mưa hay trong sương mai Trên bề mă ̣t của rễ lan , chất nhung tơ (Vélamen) giữ nhiệm vụ hút nước được nhiều nhất và nhanh nhất, là màng che nóng hết sức hiệu quả cho bộ rễ Khi tiếp xúc với vỏ cây (giá thể) chúng tự hình thành một lớp các chất kết dính để cố định cho lan thật vững chắc trên giá thể hay giá đỡ của chúng

Thân: Dendrobium thuộc nhóm đa thân Thân có nhiều đoạn phình lớn thành củ

giả (giả hành) Đó là bộ phận dự trữ nước và các chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi sống bám trên cao Củ giả rất đa dạng: hình cầu hoặc hình thuôn dài xếp sát nhau hay rải rác đều đặn hoặc hình trụ xếp chồng chất lên nhau thành một thân giả Cấu tạo củ giả: gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài là lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ, tránh sự mất nước do mặt trời hun nóng Đa số củ giả đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó làm nhiệm vụ quang hợp

Lá: Hầu hết các loài phong lan là cây tự dưỡng, nó phát triển đầy đủ về hệ thống

lá Hình dạng của lá thay đổi rất nhiều, từ loại lá mọng nước đến loại lá phiến mỏng Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo các gân vòng cung hay chỉ gấp lại theo gân hình chữ V Màu sắc lá thường xanh bóng, nhưng có trường hợp

2 mặt lá khác nhau Thường mặt dưới có màu xanh đậm hay tía, mặt trên lại khảm nhiều màu sặc sỡ

Hoa: hoa đối xứng qua một mặt phẳng Bên ngoài có 6 cánh hoa, trong đó 3 cánh ngoài cùng là 3 cánh đài, thường có màu sắc và kích thước giống nhau Một cánh đài nằm ở phía trên hay phía sau của hoa gọi là cánh đài lý, hai cánh đài nằm ở

2 bên gọi là cánh đài cạnh Nằm kề bên trong và xen kẽ với 3 cánh đài là 3 cánh hoa, chúng giống nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc Cánh còn lại nằm ở phía trên hay phía dưới, có hình dạng và màu sắc khác hẳn với các cánh còn lại gọi là cánh môi Cánh môi quyết định giá trị thẩm mỹ của hoa lan Ở giữa hoa có một trụ nổi lên, đó là bộ phận sinh dục của cây, giúp cây duy trì nòi giống Trụ gồm nhị và nhụy Sau khi thụ phấn, các cánh hoa héo, cuống hoa hình thành quả lan

Quả và hạt: quả lan thuộc quả nang, nở ra theo 3 - 6 đường nứt dọc Quả có dạng cải dài đến hình trụ ngắn phình ở giữa Khi chín, quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc Hạt lan rất nhiều, hạt liti Hạt chỉ cấu tạo bởi một lớp chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí Hạt trưởng thành sau 2 - 18 tháng

2.1.2 Các nhóm lan Dendrobium

Hình 2.1 Các giống lan rừng Dendrobium

Theo nhà phân loại học Việt Nam Phạm Hoàng Hộ, giống lan Dendrobium được

chia thành 13 nhóm sau:

2.1.3 Đặc điểm của 10 giống lan nghiên cứu trong đề tài

D anosmum (Giả Hạc): Thân thòng dài (đến 1.2m); lá có phiến mỏng (dài

10cm - 18cm); hoa đơn độc trên các đốt già, to, ửng hường với môi có tâm có sọc tía, cánh hoa nhọn (cao 3cm - 4cm), môi có lông nằm, xoan rộng Cây phân bố rộng khắp từ Bắc vào Nam Trung Bộ (Tây Nguyên) và phân bố từ Srilanca, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Indonesia

D chrysotoxum (Kim Điệp): Thân hình đùi hay bắp (dài 8cm - 40cm), có nhiều

sóng dọc thấp; lá 2 - 8, phiến dài 8cm - 15cm, rộng 2.5cm - 3cm, chót lõm; hoa mọc thành chùm thưa, xéo rồi thòng, dài 15cm - 20cm, hoa to, vàng ánh với môi có tâm cam, môi tròn, bìa dung, rìa lông mịn Cây mọc chủ yếu ở Tây Nguyên: Kom Tum, Daklak, Lâm Đồng và phân bố ở Lào, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc

D densiflorum (Thủy Tiên mỡ gà): Thân cao 20cm - 30cm, có 4 cạnh tròn, từ

hẹp đến đáy; lá 3 - 4, thon, dày, dài đến 15cm; hoa mọc thành chùm dày, to, thòng, hoa rộng 5cm, vàng cả, môi có tâm cam, tròn hình quặn, bìa có răng mịn Cây mọc

ở miền Trung (Vinh, Quãng Trị, Kon Tum, Lâm Đồng), nam bộ (Đồng Nai) và phân bố ở Lào, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc

D farmeri (Thủy Tiên trắng vàng): Giả hành thon, đáy từ từ hẹp, có 4 cạnh tròn,

cao 20cm - 40cm, long dài; lá 2 - 4, xoan thon, thon nhọn; hoa thòng, thường mọc trên dã hành không lá, ít hay nhiều hoa, hoa thường trắng với môi có bớt vàng (có thể toàn trắng), môi tròn, bìa có môi nhỏ, không đều Cây mọc chủ yếu ở Tây Nguyên và các tỉnh phía Nam, còn phân bố ở Lào, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan

D fimbriatum (Long Nhãn): Thân hình trụ hay đùi, cao đến 1m, lúc khô vàng

tươi; lá có phiến mỏng, thon, dài 10cm - 13cm, bẹ ngắn; hoa mọc thành chùm, thòng, thưa, hoa to, vàng nghệ, môi có bớt đỏ đậm, phiến hoa cao 3cm - 4cm, môi xoan rộng, bìa dung và có rìa mịn Cây mọc nhiều ở Tuyên Quang, Bắc cạn, Ninh Bình, Vinh, Bảo Lộc, Kon Tu và phân bố ở Lào

D heterocarpum (Nhất Điểm Hoàng): Mọc thành bụi đứng; than hình đùi, dài

20cm - 45cm, có rãnh; lá có phiến tròn, dài, thon, dài 10cm - 13cm, đầu tà, có 2 thùy Hoa từng cặp, to, màu vàng rơm, môi cam có sọc đỏ hay nâu, phiến hoa dài 3cm, môi hình bánh bò, hay mũi giáo, dài 4cm Cây mọc ở Đà Lạt (Lâm Đồng), và phân bố ở Lào, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc, Malaysia, Indonesia

D primulinum (Long Tu): Thân mảnh, đứng hay thòng, hình trụ dài, dài 45cm ;

lá có phiến thon, dài 8cm - 10cm, rộng 2cm Hoa hường, tím tím dợt, rộng 6cm, môi xoan rộng, có 3 thùy, bìa có răng mịn và rìa lông, gần như trắng, có đốm vàng và tím ở đáy Cây mọc chủ yếu ở Tây Nguyên và phân bố Mianma, Thái Lan, Trung Quốc

D lindleyi (Vẩy Rồng): Căn hành bò mang giả hành cao 3cm - 4cm, to 1.5cm,

xanh, lúc khô vàng; lá 1, phiến cứng, tròn dài, chùm thòng, dài 20cm - 30cm; hoa vàng dợt, tâm cam, lá đài và cánh hoa dài 1.5cm - 1.7cm, môi tròn, có lông ở đáy và

tâm, bìa dúng, chót hơi lõm Cây mọc từ Bắc vào Nam và phân bố ở Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc

D thyrsiflorum (Thủy Tiên vàng): Thân hình đùi, có 4 rãnh, dài tới 40cm, lúc

khô vàng nâu; lá 2 - 5, phiến dài 10cm, rộng 3cm - 4cm, dày, 5 - 7 gân; hoa thành chùm, dày, thòng, rộng 10cm, phiến hoa trắng hay vàng rất lợt, to 4cm, lá đài giữa cao 15mm, cánh hoa dài 2cm, môi vàng nghệ, có rìa mịn

D moschatum (Thái Bình): Bụi cao đến 1.5m, thân hình trụ có rãnh, không lá

khi phát hoa; lá có phiến tròn, dài, thon, đầu lõm, dài 7cm - 12cm, gân chánh 7 - 9; hoa mọc thành chùm dài 2cm - 30cm, hoa vàng ánh, to 4.5cm, môi có lông dày, hình chén, màu cam sậm, có hai bớt đỏ tròn, bìa rìa mịn Cây mọc ở Đà Lạt và phân

bố ở Lào, Mianma, Hymalaya, Thái Lan, Trung Quốc

2.2 Quy trình li trích DNA ở tế bào thực vật

Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng lớn nucleic acid tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân

tử bị gẫy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ) Các nucleic acid cần được tách chiết ở nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (Desoxyribonuclease-DNase và Ribonuclease-RNase)

Một qui trình ly trích DNA ở tế bào thực vật gồm 3 bước cơ bản:

Bước 1: Phá vỡ màng tế bào

Thông thường người ta nghiền tế bào hoặc mô trong một hỗn hợp dung dịch đệm chiết gồm Tris – HCl 1M (pH 7.5), NaCl 5M, EDTA 0.5M, sodium dodecyl sulfat 10% (SDS) Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là các

protein

Có thể sử dụng CTAB/NaCl (CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide) tạo phức hợp với polysaccharide và protein rồi kết tủa chúng Loại bỏ protein và phức hợp CTAB – polysaccharide – protein bằng hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Phenol và chloroform sẽ làm biến tính protein Ngoài ra chloroform còn làm cho pha nước và pha hữu cơ dễ tách rời nhau Isoamyl alcohol hạn chế sự nổi bọt trong suốt quá trình ly trích Mặc dù phenol làm biến tính protein nhưng nó có thể làm ức chế hình dạng của RNase và làm dung môi cho phân tử RNase có chứa những chuỗi dài polyA (Brawerman và ctv,1972) Do đó, có thể khắc phục nhược điểm này bằng cách sử dụng thêm chloroform sẽ giúp loại bỏ tất

cả các dấu vết còn sót lại của phenol trong nucleic acid Protein bị biến tính sẽ không hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha hữu cơ Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại

Bước 3: Tủa nucleic acid

Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác có thể hòa tan chúng lại trong dung môi theo nồng độ mong muốn Hai cách tủa thông dụng là:

- Tủa trong ethanol (ethylic alcohol), việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao), và nồng độ ethanol cao (2.5 dung dịch ethanol: l dung dịch mẫu), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc kết tủa Hầu như toàn

bộ nucleic acid đều tủa trong điều kiện nêu trên

- Tủa trong isopropanol, điểm khác biệt so với phương pháp trên là không cần sự hiện diện của muối, thể tích isopropanol: thể tích mẫu là 1: 1 Các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa nên có thể loại bỏ chúng bằng tủa trong isopropanol

Trong cả hai phương pháp, nucleic acid sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm Sau đó, cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại

Sau khi thu nhận nucleic acid ở dạng sạch, người ta có thể tiến hành phân tích định tính và định lượng chúng bằng một số phương pháp như phương pháp đo mật

độ quang, điện di

Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế

Phương pháp này không thật chính xác nhưng cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu, và thường điều này cũng đáp ứng đủ yêu cầu nghiên cứu

Nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các base purine và pyrimidine Gía trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm- Optical Density260nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan giữa một đơn vị OD260nm tương ứng với 50µg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi

Tuy nhiên, cách tính nay chỉ đúng với dung dịch nucleic acid sạch Để kiểm tra

độ tin sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280nm (OD280nm) Ở bước sóng 280nm, các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid Một dung dịch nucleic acid được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1.8 - 2.0

Log u = Log u0 – Kr*C

Trong đó, Log u0 là tính linh động của phân tử trong môi trường lỏng, Kr là hằng

số làm chậm (retardation coefficient) do cấu trúc gel đồng thời cũng phụ thuộc vào khối lượng của phân tử nucleic acid, C là nồng độ của gel

Qua đó, tính linh động của phân tử phụ thuộc vào hai chỉ tiêu: khối lượng phân

tư tức là số lượng nucleotide hay cặp nucleotide (DNA mạch đôi) và nồng độ các chất cấu thành gel Việc lựa chọn gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tùy thuộc kích thước trung bình của đoạn nucleic acid cần phân tách

Bảng 2.1 Nồng độ agarose và kích thước đoạn cần phân tách

2.3 Giới thiệu về kỹ thuật PCR

Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng tổng hợp di truyền nhờ polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985, đoạt giải Nobel năm

1993 và được sử dụng rộng rãi nhất PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E coli hay nấm men

2.3.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

PCR là một kỹ thuật phân tử tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả Thông qua PCR, hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysaccharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền Người ta gọi đó là kỹ thuật tạo dòng

PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

Bước 1: Giai đoạn biến tính - denaturation

Trong giai đoạn này, các phân tử DNA sợi đôi được biến tính thành DNA sợi đơn ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (melting temperature - Tm) của phân tử, thường là từ 940C - 950C trong vòng 30 giây đến 1 phút

Bước 2: Giai đoạn lai - hybridization

Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn nhiệt độ Tm của primer) cho phép các primer bắt cặp với khuôn, thường là từ 400C - 700C tùy thuộc vào Tm của primer sử dụng,

và kéo dài từ 30 giây đấn 1 phút

Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài - elongation

Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase sử dụng (polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian tùy thuộc độ dài của trìn tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lập đi lập lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân; theo tính toán sau 35 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 236 so với số lượng mẫu ban đầu

Sự khuếch đại này được tính như sau:

Tổng số khuếch đại = m*2n

Trong đó, n là số chu kỳ và m là số copy của chuỗi mã hóa cần nghiên cứu

Hình 2.2 Nguyên lí của phản ứng PCR

(http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html)

2.3.2 Thành phần thực hiện một phản ứng PCR

2.3.2.1 Mẫu

Trong PCR, kết quả đạt tốt nhất nếu DNA thật sự thuần khiết, DNA từ mô lá Số lượng DNA cần cho phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 5ng - 10ng DNA thuần khiết

Thông thường, nhiễm protein trong mẫu DNA trong quá trình ly trích DNA sẽ không ảnh hưởng xấu đến sự nhân DNA Tuy nhiên nhiễm DNA lạ sẽ dẫn đến kết quả PCR bị sai lệch

Đối với những DNA có kích thước quá lớn (>50kb), sự biến tính có thể không hữu hiệu và năng suất PCR thấp

2.3.2.2 Primer

Mồi (primer) là một thành phần quan trọng không thể thiếu trong phản ứng PCR Primer là những đoạn nucleotide ngắn , bắt cặp bổ sung đầu 5’ hay đầu 3’ của mạch DNA khuôn mẫu Primer được thiết kế dựa vào vùng trình tự đã được biết, nằm ở hai đầu của đoạn gen cần khuếch đại

Primer là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao Việc chọn primer là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân thủ một số nguyên tắc:

- Chiều dài primer

Đây là một chỉ tiêu quan trọng cho sự thành công của PCR, vì tính đặc hiệu và nhiệt độ bắt cặp của primer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer Nói cách khác, primer càng dài thì càng thể hiện được tính duy nhất và nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ bắt cặp càng cao Thông thường primer có chiều dài từ 18 base – 24 base (theo nguyên tắc của Wallace) có tính đặc hiệu cao, và cho nhiệt độ bắt cặp tối ưu Kích thước primer không nên quá ngắn, trừ trường hợp phục vụ cho mục đích đặc biệt, và cũng không nên quá dài vì sẽ làm giảm khả năng bắt cặp

- Nhiệt độ nóng chảy Tm

Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ mà tại đó một nữa sợi DNA là sợi đơn và một nữa còn lại là DNA sợi đôi Tm là đặc tính của các thành phần base Thành phần

(C+G) trong DNA cao sẽ dẫn tới nhiệt độ Tm cao vì liên kết H trong DNA cao hơn Có nhiều công thức tính Tm, một trong những công thức phổ biến nhất là:

Tm = 59.9 + 0.41*(%GC) – 600/chiều dài

Hai primer xuôi và ngược trong phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy không cách biệt nhau quá xa, vì nếu sự chênh lệch nhiệt độ lớn thì primer có Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, còn primer có Tm thấp hơn sẽ không thể lai được với

DNA

- Nhiệt độ bắt cặp Tanneal

Nhiệt độ bắt cặp Tanneal là nhiệt độ mà tại đó primer bắt cặp vào trong DNA khuôn Tanneal được tính theo công thức sau:

Tanneal = Tm-primer – 40C

- Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu của primer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer như đã nói ở trên Để có độ đặc hiệu cao, primer phải được thiết kế sao cho chỉ khuếch đại một trình tự đặc trưng duy nhất trên DNA hay chỉ cho một sản phẩm chính, và không nên có nhiều trình tự lặp lại trên primer, vì điều này sẽ dẫn đến sự xuất hiện các sản phẩm phụ Nhiệt độ của giai đoạn kéo dài không được quá thấp so với nhiệt độ bắt cặp của primer để đảm bảo tính đặc hiệu

- Trình tự bổ sung trên primer

Trình tự primer phải được thiết kế sao cho có không quá 3 cặp base có trình tự

bổ sung với nhau, vì điều này sẽ dẫn đến hiện tượng “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một primer, làm ngăn cản sự bắt cặp của primer với DNA

Hai primer xuôi và ngược phải không có trình tự bắt cặp bổ sung với nhau để tránh hiện tượng “dimer primer”, vì điều này sẽ dẫn đến sự cạnh tranh bắt cặp với DNA và cản trở sự hình thành sản phẩm mong muốn Ngoài ra, nồng độ quá thừa của primer cũng dẫn đến sự hình thành “dimer primer” (Bùi Chí Bửu,1999) Thông thường, primer xuôi và primer ngược thường có nồng độ bằng nhau, khoảng 0.1μM tương đương với 2.5pmol trong 25μl dung dịch phản ứng Trình tự DNA nằm giữa

hai primer “xuôi” và “ngược” không được quá lớn Phản ứng sẽ tối ưu trên những trình tự DNA nhỏ hơn 1kb

- Trình tự đầu 3’

Vị trí đầu 3’ của primer rất quan trọng trong việc kiểm soát hiện tượng

“mismatch” - bắt cặp không đặc hiệu Cần tránh trình tự A hay T ở đầu 3’, mà thay vào đó là G hoặc C vì mối liên kết hydro giữa G - C mạnh hơn A - T sẽ bảo đảm cho sự bắt cặp đặc hiệu

2.3.2.3 dNTP

Nồng độ dNTP thường được sử dụng là 20μM - 200μM Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh" Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTP sẽ làm giảm tính chuyên biệt của phản ứng PCR bằng cách tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase cũng như kìm hãm magnesium, làm ảnh hưởng đến nồng độ tối ưu của magnesium (Gelfand, 1989; Coen, 1995)

Nồng độ dNTP thích hợp nhất cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng

độ Mg2+, nồng độ primer, số lượng chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sản phẩm được khuếch đại

2.3.2.4 MgCl 2

Nồng độ MgCl2 cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR Trong thực nghiệm, nồng độ Mg2+ thấp là yếu tố hàng đầu đảm bảo tính chuyên biệt của phản ứng PCR, nồng độ cao làm hạn chế sự chuyên biệt

Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq

polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép Nồng độ Mg2+ thấp sẽ làm hạn chế quá trình kéo dài Ngược lại nồng độ Mg2+

cao sẽ giúp ổn định dây đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn (do sự mở dây đôi DNA) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho sản phẩm PCR ít đi; đồng thời, có thể làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra ổn định hơn và cho ra những sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn nhưng mức độ chuyên biệt thấp

2.3.2.5 Taq

Taq DNA polymerase (Taq) là enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp DNA

được tách ra từ loài vi khuẩn ưa nhiệt Thermus aquaticus Nhờ tính chất bền với

nhiệt, hoạt tính polymerase và khả năng bổ sung gốc adenosin (A) vào đầu 3’ của chuỗi DNA dạng sợi kép nên Taq có hai thuận lợi chính sau: hồi phục sau khi tác động nhiệt không cần kéo dài, enzyme này hoạt động mạnh ở nhiệt độ cao, lúc đó việc tác động của các primer ở đầu dây đơn sẽ chuyên biệt hơn và sinh tổng hợp DNA sẽ nhanh hơn

Taq nhạy cảm với ion magnesium Nồng độ tối hảo của Mg2+ là 1.5mM - 2.5mM Vì dNTP có thể gắn với Mg2+, còn EDTA lại là chất có khả năng tạo phức của các ion kim loại, cho nên nồng độ chính xác của magnesium tùy thuộc vào nồng

độ của dNTP và EDTA

2.3.2.6 Buffer

Dung dịch đệm có tác dụng làm cho phản ứng PCR diễn ra hiệu quả Dung dịch đệm giúp duy trì pH, hạn chế ảnh hưởng của chất ức chế, bảo vệ enzyme, ổn định mẫu

Polymerase có phạm vi pH hẹp, sự thay đổi pH từ 0.5 – 1.0 cũng làm giảm số lượng của sản phẩm PCR Khi thay đổi nhiệt độ, Tris ảnh hưởng đến pH của buffer, ảnh hưởng đến sư hoạt động của Taq polymerase

2.4 Đa dạng di truyền – một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 2.4.1 Đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là tập hợp tất cả các gen khác nhau của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật Đa dạng di truyền tồn tại trong một loài và giữa các loài khác nhau

Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gen có thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể Qua đó, sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã được biểu hiện Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền

Đa dạng di truyền giúp cho các loài sinh vật đảm bảo sự sinh sản, chống chịu với bệnh tật và khả năng thích nghi với điều kiện môi trường luôn luôn thay đổi Bảo tồn nguồn gen không chỉ nhằm ngăn chặn sự tuyệt chủng của một loài mà bảo tồn nguồn gen còn nhằm ngăn chặn sự mất mát của các gen, các phức hợp gen

và các genotype, ngăn chặn sự tuyệt chủng các nòi địa lý (landraces) mà vốn gen của chúng bị suy giảm nghiêm trọng tới mức một số gen và một số phức hợp gen có thể bị mất đi, tiềm năng di truyền của loài bị giảm mạnh, và trong trường hợp cực đoan, đó là sự tiệt chủng của loài

2.4.2 Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

2.4.2.1 Phương pháp chỉ thị hình thái

Gen - thể hiện bản chất di truyền, thường thể hiện một hay nhiều tính trạng có thể đo đếm được – gen đó xem như gen chỉ thị Chỉ thị hình thái là một trong những phương pháp sơ khai trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền

Tuy nhiên, số chỉ thị hình thái hiện diện trong tự nhiên cũng rất ít, không thỏa mãn yêu cầu của nhiều chương trình chọn giống và chỉ có quy mô hình thái (cơ

quan) hoặc ở giai đoạn phát triển đặc biệt của cá thể Sự thể hiện các chỉ thị hình thái bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường, điều này làm cho chỉ thị hình thái kém thu hút trong cải tiến giống cây trồng

2.4.2.2 Phương pháp chỉ thị isozyme

Isozyme là các dạng protein có cùng phản ứng enzyme nhưng có sự khác nhau khi chạy điện di Kỹ thuật điện di được dùng để đo sự di động của phân tử protein trong một khoảng thời gian nhất định, trên điện trường đồng nhất Các protein đột biến khác nhau về điện tích sẽ có sự di chuyển khác nhau nên có thể phát hiện sự khác nhau giữa chúng bằng kỹ thuật điện di Sự khác nhau này phản ánh sự khác nhau trong kích thước và cấu trúc của phân tử protein Trong nhiều trường hợp, còn liên quan tới sự thay thế bởi một amino acid trong phân tử protein do đột biến từ alen này sang alen khác

Nhờ kỹ thuật điện di này, cùng lúc có thể phân tích nhiều cá thể của một quần thể nào đó để đánh giá chính xác số phần trăm dị hợp tử của một gen nhất định Nó cho biết sự đa dạng giữa các nhóm sinh vật theo các protein được quan sát

Tuy việc áp dụng chỉ thị isozyme đã làm thay đổi việc nghiên cứu đa dạng di truyền theo chiều hướng thuận lợi hơn nhưng số chỉ thị cũng quá ít, không thỏa mãn cho nhu cầu nghiên cứu

2.4.2.3 Phương pháp dùng chỉ thị phân tử

Chỉ thị phân tử đã chứng minh có tầm quan trọng hơn về lâu dài so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme, do số lượng của nó gấp hơn nhiều lần so với chỉ thị isozyme (Tanksley và ctv., 1980)

Về căn bản, bất cứ chuỗi mã DNA nào được phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc hai giống khác nhau đều có thể được xem là một chỉ thị phân tử Các chỉ thị phân tử có thể chia làm hai nhóm như sau:

- Chỉ thị dựa vào phương pháp lai DNA (DNA – DNA hydridization based): RFLP (Restriction Fragment Length Polymophism), minisatellite

- Chỉ thị dựa vào phương pháp PCR: AFLP (Amplified Fragment Length Polymophism), SSR (Simple Sequence Repeat), SSCP (Single Strand Conformation Polymophism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Những lợi ích của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme:

- Đo lường trực tiếp các vật liệu di truyền

- Có nhiều chỉ thị trong quần thể

- Đo lường không chi phối ảnh hưởng môi trường và ảnh hưởng có tính chất phát triển

Các chỉ thị phân tử thường dùng trong đánh giá sự đa dạng di truyền

Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác

RFLP là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen DNA bộ gen sẽ được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.

Hình 2.3 Nguyên lí của phản ứng RFLP

(http://www.scq.ubc.ca/?p=286) RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp

và dị hợp Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo

ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu), DNA yêu cầu có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này

Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn Một cặp primer oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, điện di

và phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide PCR - RFLP bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp RFLP

Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen

Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự primer, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt Thông thường, enzyme cắt giới hạn sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme, một enzyme cắt thường xuyên (tạo ra những trình tự nhỏ) và một enzyme cắt không thường xuyên (nhằm hạn chế số lượng các đoạn cắt) Cặp enzyme thường được dùng nhất là EcoRI - MseI Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ được gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme Primer của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa

cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại, chính trình

tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích.

Hình 2.4 Nguyên lí của phản ứng AFLP

AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn

bộ gen Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các primer sử dụng không cần đặc hiệu loài (các primer thương mại có thể dùng cho hầu hết các loài) Tuy nhiên AFLP là một

marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp

Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

RAPD được định nghĩa là sự đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên PCR RAPD thực hiện dựa trên cơ sở sự bắt cặp ngẫu nhiên của các primer đơn ngắn (10 nucleotide) với mạch khuôn Các đoạn primer oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đối diện của mạch khuôn DNA trong khoảng cách có thể khuếch đại được (dưới 3000bp) sẽ cho ra những đoạn DNA có kích thước khác nhau sau khi khuếch đại

Sự có mặt của các sản phẩm DNA khác nhau chứng tỏ đã có một sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA bộ gen và primer Các primer dùng trong RAPD thường ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA bộ gen Do đó tính đa dạng thu được nhờ RAPD là đáng tin cậy, vì khi có sự thay đổi một base nitơ nào đó thì nó sẽ ngăn cản việc tiếp hợp giữa primer và DNA mạch khuôn Sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn primer cũng như sự xen vào của một gen nào đó sẽ làm thay đổi kích thước đoạn DNA được khuếch đại

Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng như nguyên tắc phản ứng PCR thông thường Tuy nhiên, vì sử dụng primer ngẫu nhiên nên nhiệt độ bắt cặp của primer thấp để tạo điều kiện bắt cặp không nghiêm ngặt Nhiệt độ bắt cặp của phản ứng là 300C-

360C Chính vì yếu tố đặc hiệu thấp nên kết quả RAPD thường có độ lặp lại không cao và khó tối ưu phản ứng Đây chính là trở ngại lớn nhất của RAPD vì kết quả phụ thuộc rất nhiều yếu tố như thành phần phản ứng PCR (đặc biệt là thành phần

Mg2+ và chất lượng DNA bản mẫu), các thiết bị cũng như thao tác thí nghiệm Ngoài ra RAPD là một marker trội do đó những gen điều khiển tính trạng lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình trong điện di

Hình 2.5 Nguyên lí của phản ứng RAPD

(http://www.fao.org/docrep/008/y5970e/y5970e06.htm) Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat)

Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gen eukaryote là những vùng có tính biến dị cao Những vùng này có chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable number tandem repeat) còn gọi là các tiểu vệ tinh Các VNTR này đặc trưng bởi số lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA Microsatellite là các VNTR có số đơn vị trình tự lõi từ 1bp - 6bp, số lần lặp lại của microsatellite khoảng 70 lần Do

số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo

ra khi sử dụng phương pháp này là rất cao

Hình 2.6 Nguyên lí của phản ứng microsatellite

(http://210.212.212.7:9999/PHP/SILKSAT/index.php?f=protocol_ssr) Dựa trên trình tự DNA microsatellite được bảo tồn ở các cá thể cùng loài cho phép chúng ta thiết kế primer để khuếch đại trình tự lặp lại trong toàn bộ kiểu gen, trình tự primer sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus microsatellite Kết quả tạo

ra các đoạn DNA có chiều dài khác nhau phân tách trên gel polyacrylamide Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bước đầu tiên rất quan trọng trong việc phân tích kỹ thuật này Do đó, việc sử dụng microsatellite gặp phải nhược điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi locus đa hình Ưu điểm lớn nhất của microsatellite là có tính đa hình cao và là một marker đồng trội

2.5 Đánh giá sự đa da ̣ng di truyền bằng phần mềm NTSYSpc và Winboot 2.5.1 NTSYSpc version 2.1

NTSYS là ứng dụng được viết trên ngôn ngữ FORTRAN , bởi Trường Đa ̣i ho ̣c Kansas, 1966 NTSYSpc được phát triển dựa trên NTSYS v à trở thành phần mềm đươ ̣c sử du ̣ng phổ biến trong phân tích đô ̣ đa da ̣ng di truyền của quần thể dựa vào viê ̣c thiết lâ ̣p sơ đồ phân nhóm di truyền giữa các sinh vâ ̣t

Hình 2.7 Giao diê ̣n NTSYSpc 2.10m

Kết quả của các kỹ thuâ ̣t sinh ho ̣c phân tử như RAPD, RFLP, AFLP, microsatellite sẽ đươ ̣c mã hóa nhi ̣ phân: nếu xuất hiện phân đoạn DNA thì kí hiệu là

1, không thì kí hiệu là 0 Số liệu này sẽ được sử dụng để xây dựng ma trận tương đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix) Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và được xây dựng trên công thức toán học của Dice (1979):

Sij = 2a / (2a + u)

Trong đó:

i, j: tên của mẫu

a: tổng số vị trí mà cả i và j đều có band

u: tổng số vị trí mà chỉ i hoă ̣c j có band

Sij: Hệ số tương đồng giữa 2 mẫu i và j

Từ Sij ta tính được khoảng cách di truyền giữa i và j:

Dij = 1 – Sij

Principal Component Analysis (PCA) (Sneath và Sokal , 1973) đươ ̣c sử du ̣ng để làm nổi bật sự khác biệt về các tính trạng hình thái trong quần thể , đồng thờ i để

miêu tả mối tương quan giữa những đă ̣c điểm được đánh giá PCA được thực hiê ̣n bằng chương trình Eigen, Proj và Mxplot của phần mềm NTSYSpc 2.1

Winboot (Yap và Nelson, 1996) là chương trình xây dựng bootstrap dựa trên dữ liê ̣u nhị phân của kết quả của các kỹ thuật sinh học phân tử (RAPD, AFLP, RFLP, microsatellite): nếu xuất hiện phân đoạn DNA thì kí hiệu là 1, không thì kí hiệu là

0 Từ đó, xác định khoảng tin cậy của sơ đồ phân nhóm di truyền và được xây dựng trên công thức toán học của Dice (1979):

Sij = 2a / (2a + u)

Trong đó:

i, j: tên củ a mẫu

a: tổng số vị trí mà cả i và j đều có band

u: tổng số vị trí mà chỉ i hoă ̣c j có band

Sij: Hệ số tương đồng giữa 2 mẫu i và j