Luận văn : Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L.) hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kỹ thuật RAPD và AFLP part 5 ppsx

41 Hình 4.4: Sản phẩm PCR của 6 nghiệm thức khi thực hiện với primer 1 và primer 11 ở thí nghiệm 3 (NT: Nghiệm thức) Sau khi thực hiện thí nghiệm 3 chúng tôi nhận thấy nghiệm thức 2 (bảng 3.5 trang 31) là tối ưu nhất và trong số 4 primer thì primer 1 và primer 11 có xuất hiện các band, còn primer 2 và primer 9 không cho band trên gel điện di. 4.3.4. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều hiện đƣợc trồng tại tỉnh Ninh Thuận với primer 11 Chúng tôi thực hiện chạy RAPD với primer 11 trên 50 mẫu kết quả thu được 13 band (hình 4.5, hình 4.6, hình 4.7, hình 4.8 và hình 4.9) trong đó có 11 band đa hình chiếm tỷ lệ 84,6% và 2 band đồng hình chiếm tỷ lệ 15,4% (kích thước khoảng 580 bp và 850 bp), kích cỡ của các band khoảng từ 280 bp – 1900 bp (hình 4.8). Band đồng hình có mặt trong tất cả các mẫu còn band đa hình có ở mẫu này nhưng không có ở mẫu kia. Các band đa hình là cơ sở phân biệt giữa các mẫu có tính trạng khác nhau từ đó làm nền tảng để phân chia và xác định giống. Có band đa hình chỉ xuất hiện ở một vài mẫu như các band có kích thước khoảng 280 bp, 700 bp, 1100 bp, 1550 bp (hình 4.6, 4.8 và 4.9) 42 Hình 4.5: Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 với các mẫu thu đƣợc từ huyện Ninh Phƣớc và Ninh Hải Từ sản phẩm RAPD – PCR cho thấy chất lượng DNA mẫu ít ảnh hưởng đến kết quả RAPD – PCR. Trong một vài trường hợp chúng tôi thấy sản phẩm RAPD – PCR có vệt và các band không rõ, nguyên nhân có thể do điều kiện PCR chưa phù hợp hoặc do DNA mẫu gãy quá nhiều. NP1 NP2 NP3 NP4 NP5 Ladder NP6 NP7 NP 8 NP9 NP10 NH19 NH11 NH 12 NH13 NH14 NH15 Ladder NH16 NH17 NH18 BA48 BA49 BA50 600 bp 1750 bp 1500 bp 100 bp 580 bp 850 bp band đồng hình 1100 bp 43 Hình 4.6: Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 với các mẫu thu đƣợc từ huyện Ninh Hải và Bác Ái Hai band đồng hình có kích thước (khoảng) 580 bp và 850 bp cho band rất rõ, trong khi các band 280 bp, 1200 bp và 1550 bp (hình 4.8)…còn mờ. Chúng tôi đã tiến hành thay đổi điều kiện PCR nhưng các band mờ chỉ rõ hơn ở một mức độ nhất định. Để band mờ rõ hơn thì có thể phải thay đổi nhiều yếu tố trong phản ứng PCR và có thể kết quả cũng sẽ mất đi một vài band đã có. Trong điều kiện khóa luận chúng tôi chưa khảo sát sâu vấn đề này nên kết quả thu được còn vài band chưa rõ nếu nhìn bằng mắt. Tuy nhiên nếu sử dụng chức năng detecband trong máy Geldoc thì các band này vẫn được nhận diện rõ ràng. Hình 4.7: Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 với các mẫu thu đƣợc từ huyện Ninh Hải Qua hình 4.5, 4.6 và 4.7 chúng tôi thấy các mẫu NH14, NH19 và NH28 không xuất hiện band nguyên nhân có thể là do thao tác trong quá trình chạy PCR hoặc do primer 11 không phù hợp với các mẫu này. Do đó nên thực hiện lại phản ứng RAPD – PCR đối với các mẫu NH14, NH19 và NH28 để có kết luận chính xác hơn. NH20 NH21 NH22 NH23 NH24 NH25Ladder NH26 NH27 NH28 NH29 NH30 band đa hình 44 Hình 4.8: Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 với các mẫu thu đƣợc từ huyện Ninh Sơn Sử dụng 5 primer trong kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa hình của các giống tằm dâu (Nguyễn Thị Thanh Bình, 2005) thì trung bình mỗi primer cho 13,4 band, với primer 11, Samal và ctv (2003) đã chạy RAPD thu được 11 band trong đó có 9 band đa hình và 2 band đồng hình. Ở một nghiên cứu khác Sunil Archak và ctv (2003) đã chạy RAPD trên cây điều với 5 primer thu được 56 band, trung bình 11,2 band trên mỗi primer. Điều này cho thấy primer 11 có tính đa hình cao và khá ổn định. Trong các mẫu đã nghiên cứu có 37 mẫu xuất hiện band 750 bp chiếm tỷ lệ 78,72% số mẫu khảo sát. Tuy nhiên band 750 bp lại xuất hiện không đồng nhất, giữa các mẫu còn có sự chênh lệch. Điều này có thể do bản chất trọng lượng phân tử của band nhưng cũng có thể do quá trình điện di làm sai lệch các band (điện di không thẳng). Band 750 bp có thể là band đặc biệt dùng để phân biệt giữa các giống. Do đó nên tách band này để giải trình tự nhằm giải đáp cho sự chênh lệch và phục vụ cho công tác phân biệt và chọn giống. NS31 NS32 NS33 NS34 NS35 NS36 Ladder NS37 NS38 NS39 NS40 NS41 280 bp 1900 bp 1550 bp 1200 bp 750 bp 45 Hình 4.9: Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 với các mẫu thu đƣợc từ huyện Bác Ái Hình 4.10: Xác định các band dƣới dạng peak trong máy Geldoc. Từ kết quả thu được trên gel điện di chúng tôi mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1 (xem chi tiết ở bảng 4.3 phần phụ lục II) để phân tích mối tương quan di truyền giữa các mẫu nghiên cứu bằng phần mềm NTSYS phiên bản 2.1. Chúng tôi chọn 7 mẫu đại diện với các đặc điểm: Giữa các mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp nhất (NS32 với BA47 là 0.38) và cao nhất (NP2 với BA46 là 1,00) trong tổng số 47 mẫu nghiên cứu (3 mẫu NH14, NH19 và NH28 không phân tích) và 4 mẫu NP10, NH12, NS40, BA46 dùng trong kỹ thuật AFLP để phân tích hệ số đồng dạng di truyền. Ladder BA42 BA43 BA44 BA45 BA46 BA47 700 bp 750 bp 46 Bảng 4.1: Hệ số đồng dạng di truyền của 7 mẫu đại diện trong kỹ thuật RAPD Mẫu NP2 NP10 NH12 NS32 NS40 BA46 BA47 NP2 1.000000 NP10 0.692307 1.000000 NH12 0.769230 0.615384 1.000000 NS32 0.538461 0.692307 0.769230 1.000000 NS40 0.769230 0.615384 0.846153 0.615384 1.000000 BA46 1.000000 0.692307 0.769230 0.538461 0.769230 1.000000 BA47 0.846153 0.538461 0.615384 0.384615 0.615384 0.846153 1.000000 Bảng 4.1 là kết quả phân tích hệ số đồng dạng di truyền trên 7 mẫu đại diện cho thấy hệ số này biến thiên từ 0,38 đến 1,00. Như vậy các mẫu phân tích có quan hệ di truyền khá xa nhau. Tuy nhiên kết luận này còn phụ thuộc vào tỷ lệ mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp. Nếu các mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp chiếm một tỷ lệ lớn thì các mẫu phân tích có quan hệ di truyền xa nhau. Ngược lại nếu chỉ một vài mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp thì không kết luận được. Trên cơ sở bảng hệ số đồng dạng di truyền, chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại đối với 24 mẫu điều mà tại Ninh Thuận thường được người trồng điều xếp vào nhóm điều Việt Nam. 47 Coefficient 0.65 0.74 0.82 0.91 1.00 NP10 NP1 NP7 NH11 BA48 BA49 NP5 NS34 BA42 NP9 NH20 NH21 NH23 NH30 NS41 NH22 NS38 NP10 NH15 NH17 NS36 NH25 BA45 BA46 BA47 Hình 4.11: Cây phát sinh chủng loại của 24 mẫu thuộc nhóm điều Việt Nam tại tỉnh Ninh Thuận Qua hình 4.11 cho thấy hệ số đồng dạng di truyền của các mẫu thuộc nhóm điều Việt Nam biến thiên từ 0,65 đến 1,00. Có quan hệ di truyền tương đối gần nhau nhưng cây phát sinh chủng loại có rất nhiều nhánh cho thấy nhóm điều Việt Nam có sự phân ly rất phức tạp. Đây có thể là kết quả của việc phát triển trồng mới tự phát, hạt giống là tổ hợp của sự giao phấn ngẫu nhiên của các cá thể cha mẹ khác nhau. Similarity Coefficient 48 Coefficient 0.69 0.77 0.84 0.92 1.00 NH12 NP2 BA44 NS31 NP4 NH27 NP6 NH26 NP8 NH12 NH18 NS39 NS32 NS35 NP3 NH13 BA50 NS40 BA43 Hình 4.12: Cây phát sinh chủng loại của 18 mẫu thuộc nhóm điều Ấn Độ tại tỉnh Ninh Thuận Qua hình 4.12 cho thấy hệ số đồng dạng di truyền của các mẫu thuộc nhóm điều Ấn Độ biến thiên từ 0,69 đến 1,00. Có quan hệ di truyền gần hơn nhóm điều Việt Nam Similarity Coefficient 49 và cây phát sinh chủng loại cũng có rất nhiều nhánh, cho thấy nhóm điều Ấn Độ cũng xảy ra tình trạng tương tự như nhóm điều Việt Nam. Coefficient 0.68 0.76 0.84 0.92 1.00 NH11 NP3 BA50 NP4 NP7 NH11 NP8 NS37 NS32 NS35 BA44 BA46 Hình 4.13: Cây phát sinh chủng loại của 11 mẫu có tính trạng hạt to và năng suất cao tại tỉnh Ninh Thuận Qua hình 4.13 chúng tôi nhận thấy mặc dù các mẫu có cùng tính trạng hạt to và năng suất cao nhưng về kiểu gene lại có sự khác nhau tương đối xa. Các mẫu có tính trạng hạt to và năng suất cao chủ yếu thuộc nhóm điều Ấn Độ. Mẫu BA46 thuộc nhóm điều Việt Việt Nam Ấn Độ Việt Nam Ấn Độ Similarity Coefficient 50 Nam nhưng lại có kiểu gene khá gần với mẫu BA44 điều Ấn Độ. Như vậy BA46 có thể là cây lai giữa điều Việt Nam và điều Ấn Độ . kỹ thuật AFLP để phân tích hệ số đồng dạng di truyền. Ladder BA42 BA43 BA44 BA 45 BA46 BA47 700 bp 750 bp 46 Bảng 4. 1: Hệ số đồng dạng di truyền của 7 mẫu đại di n trong kỹ thuật RAPD. 3 1) l tối ưu nhất và trong số 4 primer thì primer 1 và primer 11 có xuất hiện các band, còn primer 2 và primer 9 không cho band trên gel điện di. 4.3.4. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của. của quần thể điều hiện đƣợc trồng tại tỉnh Ninh Thuận với primer 11 Chúng tôi thực hiện chạy RAPD với primer 11 trên 50 mẫu kết quả thu được 13 band (hình 4 .5, hình 4.6, hình 4.7, hình 4.8 và