VIRUS cúm và PHƯƠNGPHÁP sản XUẤT VACCINE BẰNG ADENOVIRUS VECTOR

Đ I H C ĐÀ NẴNG TR NG Đ I H C S PH M KHOA SINH ậ MỌI TR NG - - BÀI TIỂU LU N VIRUS CÚM VÀ PH NGPHÁP S N XU T VACCINE BẰNG ADENOVIRUS VECTOR Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Văn L Sinh viên thực hiện: Nhóm 1: ng Nguyễn Th Na ĐoƠn Văn Tùng Nguyễn Vĩnh Quốc Ph m Huỳnh H ng Đà Nẵng, ngày 22 tháng năm 2015 I Gi i thiệu Đặc điểm cấu tạo virus cúm Mỗi năm, có hàng tri u ngư i giới mắc b nh cúm với hiều mức độ, chủng lo i biểu hi n, biến chứng khác Cúm tên tiếng Anh influenza thư ng gọi flu b nh truyền nhi m gây b i virus có gene RNA, thuộc họ Orthomyxoviridae Họ bao gồm chi: - - Influenzavirus A (Cúm A) virus tập trung nghiên cứu nhiều nhất, đối tượng tuyền nhi m chúng gia cầm, động vật có vú ngư i Cúm A lo i cúm có độc tính cao lo i cúm gây b nh ngư i gây b nh nặng Influenzavirus B (Cúm B) nhi m lên ngư i phổ biến cúm A Influenzavirus C (Cúm C) nhi m lên ngư i heo, gây b nh nặng dịch ph m vi địa phương Isavirus nhi m lên cá, đặc bi t cá hồi Thogotovirus nhi m lên ve Các virus giống cấu trúc Virus cúm có d ng hình cầu bề mặt khơng đồng đều, đư ng kính 80– 120 nanomet, có lớp vỏ có b n chất glycoprotein bao gồm kháng nguyên: Kháng nguyên ngưng kết hồng cầu H (Hemaglutinin) kháng ngun trung hịa N (Neuraminidase) Hình Nucleocapsid bao bọc b i màng protein (M1), phía màng bao bọc b i lớp lipid kép có nguồn gốc từ màng sinh chất tế bào chủ Protein M2 đâm xuyên nhô khỏi vỏ t o thành kênh ion làm cho pH quan nội bào thay đổi, có vai trị quan trọng vi c hình thành h t virus Trên phần vỏ có lo i glycoprotein bao gồm kháng nguyên: - - Kháng nguyên ngưng kết hồng cầu H (Hemaglutinin) có 15 lo i (H1- H15) có cấu trúc hình trụ cấu t o b i hai phân tử riêng bi t HA1 HA2 nối với cầu disulfua, phân tử HA gắn vào màng lipid đầu kỵ nước Kháng ngun trung hịa N (Neuraminidase ) có lo i (N1 –N9) có d ng hình nấm phân tử NA phần thân gắn với lớp màng qua đầu kỵ nước Phần lõi virrus bao gồm phức hợp Ribonucleoprotein: Các polymerase protein PB1, PB2, PA NP Nucleoprotein gắn với đo n RNA virut t o thành Nucleocapsid Tồn t i thành phần Virus cúm cịn có RNA-RNA polymerase PB1, PB2, PA protein phi cấu trúc NS Bộ gen virus cúm Cấu t o h di truyền virus cúm sợi đơn RNA, chuỗi âm Từ đến phân đo n RNA, dài 10 – 15 kb, mã hóa cho protein cấu trúc phi cấu trúc Mỗi phân đo n mã hóa cho protein Đo n 1, 3, 4, mã hóa cho protein tương ứng PB2, PA, HA, NP NA Mỗi phân đo n 2, 7, 8, mã hóa cho pro tein tương ứng PB1 - PB2F2, M1 – M2 NS1 - NS2 T i hai đầu phân đo n gen có trình tự Nucleotide b o tồn gồm 13 nu đầu 5’ (5’ AGUAGAAACAAGG) 12 Nu đầu 3’ (3’ UCGUUUUCGUCC) trừ phân đo n 1,2,3,7 nu thứ C thay cho U, trình tự Nu đặc trưng cho virus cúm mà không tồn t i virus khác Cơ chế xâm nhiễm phát triển Bao gồm giai đo n sau: Sự bám dính virus Virus bám bám vào tế bào biểu mô đư ng hô hấp cách dùng HA gắn vào phần axit sialic Glucoprotein glucolipid bề mặt tế bào Ngay q trình bám dính hồn thành virus tiếp tục tình thâm nhập vào tế bào Sự thâm nhập virus Virus tiến vào tế bào chủ q trình thực bào, tồn virus bao bọc b i màng tế bào chủ đưa vào tế bào chất tế bào chủ qua thể thực bào điều ki n pH thấp Sự loại bỏ lớp vỏ virus Sự ho t động protein M2 chấm dứt tình tr ng pH thấp thể thực bào, đồng th i làm tăng cư ng hóa màng phần protein HA màng sinh chất với màng thể thực bào Dòng ion từ nội bào tràn vào h t virus dẫn đến liên kết protein virus khiến cho RNA virus thoát khỏi kiểm soát vỏ virus Khi q trình hịa màng hồn thành RNA gi i phóng vào tế bào tế bào chủ Sự tổng hợp RNA protein giải phóng virus Khác với virus mang RNA khác, sợi đơn RNA chuỗi âm virus tổng hợp nhân lên t i nhân tế bào Các RNA chuyển vào nhân tế bào, phức hợp polymerase gắn vào RNA virus, đồng th i cắt RNA tế bào chủ ho t động Nu nội bào Nu nội bào virus cắt đầu 5’ gắn mũ methyl hóa mRNA tế bào chủ với độ dài kho ng 13 đến 15 Nu dùng đo n làm mồi để tổng hợp mRNA virus Enzyme RNA polymerase virus thực hi n trình tổng hợp sợi mRNA bổ sung với RNA chuỗi âm Phần intron mRNA virus bị cắt bỏ b i enzyme tế bào để protein M1 hay NS1 tổng hợp mà không cần thêm phân cắt Một số protein tổng hợp quay tr l i với nhân tế bào gắn vào RNA đẻ hình thành RNP Các thê virus l i di chuyển tới lưới nội bào thể Golgi thực hi n trình Glycosyl hóa sau tiếp tục tới màng tế bào gắn vào lớp lipid kép màng Khi q trình gắn protein vào màng thành cơng, RNP M1 liên kết thành phần l i để t o nên h t virus Cuối h t virus n y chồi phía ngồi m ng tế bào chủ tách khỏi thành tế bào nh ho t động NA (Hình 2) Hình Các loại vaccine Vaccine bất hoạt S n xuất từ chủng virus nuôi túi ni u trứng gà có phơi, sau bị bất ho t b i Formandehyde Beta- propiolacton tinh s ch siêu ly tâm Bao gồm vaccine toàn phần vaccine bán phần - Vaccine toàn phần: an tồn có kh dung n p tốt, với hi u lực b o v ngư i lớn trẻ em 60 – 90 % Vaccine bán phần: gây ph n ứng phụ nhiên có ý kiến vaccine hi u qu trư ng hợp có lưu hành chủng virus Vaccine sống nh ợc độc Mục đích: tăng cư ng đáp ứng mi n dịch dịch thể mi n dịch t i chỗ thể Thích ứng điều ki n nhi t độ thấp nhi t độ thể (25o C) để đưa vào qua đư ng mũi với nhi t độ thể Virus bị bất ho t nhằm kích thích sinh kháng thể t i đư ng hô hấp đư ng hô hấp đồng th i tăng cư ng đáp ứng mi n dịch tế bào Các loại vaccine hệ Nuôi cấy tế bào MDCK (madin-darby canine kidney) tế bào Vero nhà s n xuất quan tâm kh tăng suất hy vọng tác dụng phụ thấp vaccine dụng S n xuất ứng dụng công ngh gen (Di truyền ngược, vaccine DNA, vaccine protein) nghiên cứu với hy vọng áp dụng rộng rãi tương lai Vaccine s n xuất dựa thay đổi cấu trúc gen virus làm gi m kh nhân lên (gen M2 M1 bị lo i bỏ), kh tổng hợp chất ức chế interferon thể virus (bỏ NS1), có kh gây đáp ứng mi n dịch Phương pháp Tái tổ hợp (truyền thống) Ph ơng pháp Tái tổ hợp Tái tổ hợp phương pháp truyền thống vi c t o virus giống ứng dụng 50 năm qua Đó phương pháp thư ng gặp nhất, đặc bi t vi c s n xuất vaccine cúm thư ng Các giai đo n: - - Tiêm vào trứng gà có phơi lúc chúng virus, gồm virus cúm bị độc tính, có kh nhân lên tốt trứng gà (chủng nhược độc) virus mục tiêu (đang gây b nh) Vì chúng có đo n gen nên hai chủng tái tổ hợp theo 28 = 256 cách Chọn lọc virus tái tổ hợp, virus ph i mang gen chúng nhược độc gen chúng mục tiêu (gen HA gen NA) Virus chọn lọc thu nhận, tiêm vào hàng tri u trứng gà có phơi khác để s n xuất vaccine Phương pháp có khuyết điểm tốn cơng, tốn th i gian, kéo dài đến tháng Vì có đ i dịch, phương pháp khơng đủ cung cấp vaccine với số lượng lớn cho toàn thể giới (Hình 3) Hình u điểm ph ơng pháp Vaccine tái tổ hợp thực hi n đơn gi n tốt so với phương pháp khác Sự đa d ng tổ hợp virus tái tổ hợp làm tăng tính sinh mi n dịch đáp ứng Nh ợc điểm ph ơng pháp Vaccine kh sử dụng h n chế ngư i bị suy gi m mi n dịch vaccine chứa lượng virus hoang d i (virus khơng tái tổ hợp) Vaccine khơng có hi u qu t o mi n dịch chứa virus nhược độc nhân t o (virus khơng tái tổ hợp) Kh rị rỉ virus bên ngồi mơi trư ng Kh chủng vaccine tái tổ hợp đột biến tr thành chủng hoang d i tr l i Th i gian làm lâu đến tháng điều ki n nuôi bất định Phương pháp di truyền ngược Ph ơng pháp di truyền ng ợc Kawaoka (Nhật B n) cộng thuộc nhóm nghiên cứu phát minh “ Kỹ thuật di truyền ngược” vào cuối năm 1990 Vaccine từ phương pháp khơng rẻ l i có lợi mặt th i gian Gồm giai đo n: - - - - Chuyển gen HA, NA chúng virus (đang gây b nh) vào plasmid d ng vòng gen l i chủng virus (chủng nhược độc) chuyển vào plasmid tương ứng Các gen virus RNA nên chép ngược trừ chuyển vào plasmid Sau chèn tất c plasmid tái tổ hợp vào tế báo động vật Từ t o chúng virus giống Điều quan trong giai đo n Hình tế bào động vật ph i có enzyme chép sợi đổi mã (antisense RNA) transcriptase RNA phụ thuộc cho virus Tế báo động vật ph i đ m b o kh gây khối u (t o ung thư) không bị nhi m virus khác (như retrovirus) Hi n tế bào thận xanh Châu Phi (tế bào dịng Vero CCLSI) chứng an tồn phủ Mỹ chấp nhận để s n xuất vaccine cho ngư i Các virus giống tiêm vào trứng gà có phơi hay tế báo động vật để s n xuất vaccine (Hình 4) Số l ợng plasmid sử dụng ph ơng pháp di truyền ng ợc Các đơn vị phiên mã tối thiểu ho t động virus cúm RNP, bao gồm RNA virus phức với virus nucleoprotein (NP) RdRp virus, t o thành tiểu đơn vị ba protein PB1, PB2 PA Đồng th i với bổ sung tám Phân đo n RNA virus để “kickstart “ chu kỳ lây nhi m tế bào bị nhi m - Trong nghiên cứu tiên phong thiết lập dựa h thống plasmid RG cho vi-rút cúm, bốn nhiều plasmid biểu hi n protein virus kiểm soát Pol II promoter đồng t i n p vào tế bào với tám plasmid chứa tám phân đo n RNA virus, dẫn đến tổng số 17 plasmid mà t i n p vào tế bào - Một số nghiên cứu lượng t làm t i n p 12 plasmid (tám vRNA plasmid biểu hi n bốn plasmid protein-expression) cho h virus cúm A B Biểu hi n bốn protein helper virus cần thiết chi cần hai plasmid, sử dụng Pol II promoter ribosome nội điểm (IRES) đưa vào để thể hi n hai protein từ plasmid;do làm h thống RG yêu cầu cần t i n p 10 plasmid vào tế bào - Các h thống RG dựa T7 promoter mô t điều ki n địi t i n p 13 plasmid, cần thiết để biểu hi n T7 RNA polymerase helper virus protein - B i vi rút cúm C có b y phân đo n RNA, h thống dựa plasmid RG cho cúm C sử dụng 11 16 plasmid, tùy thuộc vào vi c có hay không nhiều protein thiết lập b n protein polymerase nucleoprotein biểu hi n từ plasmid H thống gọi “hai chiều” h thống 'một chiều'đều yêu cầu t i n p tám plasmid vào tế bào u điểm ph ơng pháp Một lợi ích quan trọng cơng ngh phần virus mục tiêu, chẳng h n kháng nguyên H5 H7, độc h i để phát triển bên trứng, phân đo n gen mã hóa cho kháng nguyên làm cho mức độ nguy hiểm gi m bớt bất ho t Các phương pháp di truyền ngược cách tiếp cận hợp lý trực tiếp so với cách tiếp cận truyền thống (hit-or-miss) Di truyền ngược khử nhi m lo i virus hoang dã có nguồn gốc h thống khơng xác định, ví dụ dịng tế bào khơng hợp l cho mục đích s n xuất vaccine, chứa mầm b nh khác giai đo n plasmid, HA thiết kế để lo i bỏ đặc tính gây b nh Vi c sử dụng di truyền ngược vi c t o HGRs chứng minh b i nhiều phịng thí nghi m, bao gồm c vi c sử dụng t o chủng tái tổ hợp không gây b nh từ lo i virus gây b nh cao Nh ợc điểm ph ơng pháp Quá trình bất ho t gi m độc lực kháng nguyên virus gặp khó khăn cần th i gian có hổ trợ thiết bị hi n đ i Hi u suất tái tổ hợp plasmid cDNA virus thấp Hi u suất t i n p plasmid vào dòng tế bào cấp phép s n xuất vaccine (vd: Tế bào Vero) thấp điều chỉnh số lượng plasmid II Kết qu nghiên cứu: “H trống di truyền ngược trung gian thông qua Adenovirus vector cho h virus cúm A” Để gi i h n chế phương pháp di truyền ngược plasmid, nhóm nguyên cứu thành lập h thống di truyền ngược dựa chuyển gen sử dụng adenovirus type 5, mà qu n lý cách an toàn nhiều thử nghi m lâm sàng Một vector adenovirus chép cao không đủ lực (ADV) với E1 E3 bị xóa s hữu cDNA RNA virus (vRNA) kiểm soát RNA polymerase I (PolI) promoter PolI terminator chuột cho phép tổng hợp vRNA hi u qu dẫn đến s n lượng virus cao tế bào Vero (Hình 5, A) Hình Những kết qu gợi ý h thống AdV- medicated có giá trị cho vi c s n xuất chủng vaccine h t giống tình đ i dịch Tổng hợp AdV- medicated virus cúm RNA Sự t i n p plasmid kết qu vào tế bào s n xuất 293A AdV tổng hợp vRNA reporter (ADV / Poli-GFP, Hình 5, B) Để kiểm tra xem ADV / PolI-GFP s n xuất vRNA reporter tế bào Vero, nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp protein huỳnh quang xanh (GFP) - (Hình 6B), khơng có biểu hi n GFP phát hi n tế bào mô t i n p (Hình 6A.) T i n p AdV / PolI GFP tế bào Vero dẫn đến tổng hợp vRNA reporter Để xác nhận thành phần vRNP hồn tồn từ AdVs, nhóm nghiên cứu thực hi n bốn bổ sung AdVs cho biểu hi n tiểu đơn vị polymerase NP (ADV / CMV-PB2, -PB1, PA, -NP) dẫn đến biểu hi n hi u qu cao GFP 48h sau t i n p (Hình 6C) Những kết qu cho thấy AdV t i n p thành công vRNP chức mức hi u qu cao nhiều so với thao tác t i n p plasmid vào tế bào Vero Kết qu xác định tỷ l tối ưu AdVs cho biểu hi n protein cho thấy dùng gấp lần AdVs để tổng hợp vRNA cho biểu hi n protein virus vừa đủ tổ chức hi u qu vRNP chức (dữ li u không hiển thị) Để so sánh hi u qu h Hình virus, hai phương pháp di truyền ngược dựa plasmid sử dụng, h thống 12-plasmid h thống 3-plasmid.T i 72 h sau t i n p AdV t i n p plasmid, nước nuôi cấy thu ho ch m ng bám chất kh o nghi m tế bào MDCK để xác định số lượng h virus t o Virus cúm phát hi n nước tế bào t i n p với 12 AdVs, thể hi n lực AdV qua h thống trung gian di truyền Hình ngược cho h virus cúm S n lượng virus từ tế bào t i n p 12-ADV kho ng 1.000 lần, cao so với từ tế bào t i n p 12-plasmid so sánh với 3plasmid tế bào (Hình 7) Nhóm nghiên cứu kiểm tra li u phương pháp tiếp cận phiên mã hai chiều PolI-PolII, cho phép tổng hợp đồng th i vRNA mRNA từ vùng phiên mã áp dụng H thống di truyền ngược AdV-mediated nhóm nghiên cứu Tế bào Vero t i n p với AdV (MOI=50) thể hi n GFP mức tương đối thấp t i 48 h sau t i n p (Hình 6D).T i n p thành công từ ADV / CMV-PB2, -PB1, -PA, -NP tăng cư ng độ biểu hi n GFP tế bào (Hình 6E) Những kết qu ADV / CMV-Poli-GFP t i n p gây tổng hợp c hai vRNA reporter mRNA 10 Để t o virus cúm truyền nhi m từ tám AdVs, nhân b n hộp phiên mã cho PolI tất c tám WSN vRNAs vào pAd / CMV / V5-DEST sử dụng tám AdVs chứa hộp phiên mã hai chiều cho phân khúc vRNA Tế bào Vero t i n p thành công với AdVs (MOI=50) S n lượng virus xác định t i 72h sau chuyển b i kh o nghi m m ng bám tế bào MDCK Lượng virus t o tế bào Vero với AdVs kho ng 10.000,10 cao 10 lần so với mẫu thu với 12-plasmid (P= 0,032), 3-plasmid (P= 0,045), 12 -AdV (P=0,035) h thống (Hình 7) đây, nhóm nghiên cứu chứng minh giới h n hi u qu t i n p tế bào mục tiêu khắc phục cách sử dụng Ad phương ti n chuyển gen RNA Virus cúm phiên mã hi u qu (Hình 6C E), virus cúm t o với hi u qu cao tế bào Vero t i n p với AdV chứa promoter PolI terminator Hơn nữa, h thống dẫn truyền 8-ADV, dựa h thống phiên mã hai chiều PolI-PolII đ t gia tăng đáng kể mặt thống kê s n lượng vi rút so với h thống khác, kể c h thống t i n p plasmid thành lập Với chuẩn bị tương đối d , h thống dẫn truyền 8- ADV lý tư ng cho nhân dòng hi u qu chủng giống vaccine cúm H thống di truyền ngược qua AdV-medicate đóng góp cho nghiên cứu b n virus cúm III Kết lu n Cúm lo i virus nguy hiểm kh thích ứng với điều ki n ngo i c nh dể bị biến chủng Đặc bi t kh lây nhi m cho ngư i cao Nghiên cứu virus cúm làm gi m kh bùng phát thành đ i dịch gây nguy h i cho giới Tuy nhiên, để t o chủng vaccine phòng ngừa ngăn chặn cúm cần tr i qua nhiều giai đo n Lịch sử cho thấy cơng trình nghiên cứu virus cúm có từ kỷ trước, kèm theo t ng Vaccine C i thi n phương pháp t o s n xuất vaccine số lượng lớn nhằm ứng biến nhanh kịp th i với chuyển biến thay đổi chủng cúm giới cần thiết, đặc bi t Cúm A H thống di truyền ngược Plasmid tiến vượt bật khoa học nghiên cứu cúm, m phát triển vaccine s n xuất từ tế bào động vật H thống Adenovirus vector phương pháp c i tiến so với H thống di truyền ngược plasmid, với kh ưu vi c s n lượng, biểu hi n th i gian Phương pháp cho phép nghiên cứu sâu vaccine, biểu hi n gene, virus học Phương pháp rút ngắn qu ng đư ng công sức nghiên cứu tương lai Đặc bi t y học phục vụ đ i sống 11 TÀI LI U THAM KH O Generation of influenza vaccine viruses on Vero cells by reverse genetics: an H5N1 candidate vaccine strain produced under a quality system Division Virus học, Vi n Tiêu chuẩn sinh học kiểm soát, South Mimms, Potters Bar, Herts EN6 3QG, Anh Hoffmann, E., G Neumann, Y Kawaoka, G Hobom, and R G Webster 2000 A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Natl Acad Sci USA97:6108–6113 Wood, J M., and J S Robertson.2004 From lethal virus to life-saving vaccine: developing inactivated vaccines for pandemic influenza Nat Rev Microbiol.2:842–847 Young, L S., P F Searle, D Onion, and V Mautner.2006 Viral gene therapy strategies: from basic science to clinical application J Pathol 208: 299–318 Takada, A., N Kuboki, K Okazaki, A Ninomiya, H Tanaka, H Ozaki, S Itamura, H Nishimura, M Enami, M Tashiro, K F Shortridge, and H Kida.1999 Avirulent avian influenza virus as a vaccine strain against a potential human pandemic J Virol.73:8303–8307 Fodor E, Devenish L, Engelhardt OG, Palese P, Brownlee GG, Garcia-Sastre A Rescue of influenza A virus from recombinant DNA J Virol 1999; 73:9679–9682 Neumann G, Watanabe T, Ito Het al.Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96:9345–9350 Neumann G, Kawaoka Y Generation of influenza A virus from cloned cDNAs–historical perspective and outlook for the new millenium Rev Med Virol 2002; 12:13–30 Many ways to make an influenza virus – review of influenza virus reverse genetics methods Othmar G Engelhard Article first published online: 19 JUN 2012 12 ... đặc bi t vi c s n xuất vaccine cúm thư ng Các giai đo n: - - Tiêm vào trứng gà có phôi lúc chúng virus, gồm virus cúm bị độc tính, có kh nhân lên tốt trứng gà (chủng nhược độc) virus mục tiêu (đang... trưng cho virus cúm mà không tồn t i virus khác Cơ chế xâm nhiễm phát triển Bao gồm giai đo n sau: Sự bám dính virus Virus bám bám vào tế bào biểu mô đư ng hô hấp cách dùng HA gắn vào phần axit... trình bám dính hồn thành virus tiếp tục tình thâm nhập vào tế bào Sự thâm nhập virus Virus tiến vào tế bào chủ q trình thực bào, tồn virus bao bọc b i màng tế bào chủ đưa vào tế bào chất tế bào