HÓA SINH của QUÁ TRÌNH sản XUẤT GIẤM các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men giấm

KHOA CƠ KHÍ VÀ CƠNG NGHỆ HĨA SINH CỦA Q TRÌNH SẢN XUẤT GIẤM Học phần: Cơng Nghệ Lên Men GVGD: TS Trần Bảo Khánh Sinh viên thực hiện: 1.Hoàng Thị Hồng Lựu Võ Thị Yến Linh Trần Thị Khánh Ly Lê Thị Diễm My Trần Thị Ly Huỳnh Công Trà My Lớp : CNTP 52B Huế, 2021 Lớp: Sử K28C MỤC LỤC Huế, tháng 11/2007 LỜI MỞ ĐẦU 1 Tổng quan .2 Lên men rượu .3 Q trình axetic hóa .8 3.1 Acetic Acid Bacteria 3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men giấm 13 KẾT LUẬN 15 LỜI MỞ ĐẦU Giấm ăn chất lỏng có vị chua chứa 4% acid acetic trở lên, hình thành từ lên men ethanol (C2H5OH) Trong nhiều văn hóa tồn giới, giấm sử dụng làm gia vị chất bảo quản sản phẩm thực phẩm khác đồ uống sau pha loãng với nước Giấm tạo trình lên men hai giai đoạn: giai đoạn lên men rượu loại đường lên men nào, lên men giấm (oxy hóa etanol) Ngày nay, với thay đổi cách tạo loại giấm khác làm cho đa dạng loại giấm tăng cao Với q trình sản xuất giấm q trình hóa sinh sản xuất giấm vô quan trọng Vì vậy, nhóm chúng em tìm hiểu hóa sinh q trình sản xuất giấm dưưới 1 Tổng quan Giấm tạo trình lên men hai giai đoạn: giai đoạn lên men rượu loại đường lên men nào, lên men giấm (oxy hóa etanol) Sự chuyển hoá etanol (CH3CH2OH) oxy (O2) thành axid axetic (CH3COOH) xảy theo phản ứng hóa học sau: CH3CH2OH + O2 → CH3COOH + H2O Quá trình lên men rượu thực nấm men (ví dụ: Saccharomyces cerevisiae) Hình 1.1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae Sự lên men chuyển hóa đường thành rượu diễn điều kiện yếm khí Sau đó, q trình lên men giấm xảy với có mặt oxy để chuyển rượu thành axit axetic Trên thực tế, có hai loại phương pháp oxy hóa truyền thống để sản xuất giấm: oxy hóa bề mặt oxy hóa chìm Q trình oxy hóa bề mặt q trình chậm nhiều so với trình lên men chìm, diễn nhanh chóng bề mặt tiếp xúc với oxy cao (hịa tan mơi trường) Hai q trình lên men liên quan đến sản xuất giấm mô tả ngắn gọn 2 Lên men rượu Quá trình lên men rượu sản xuất giấm thường diễn nhanh chóng thường làm cạn kiệt hầu hết loại đường có sẵn ba tuần + Các loại đường lên men chuyển hóa thành etanol nhờ tác động nấm men, thường chủng S cerevisiae (Budak cộng sự, 2014) + Lên men rượu trình lên men tự nhiên vi sinh vật tiêu thụ hợp chất hữu điều kiện yếm khí để cung cấp lượng cho tế bào (adenosine triphosphate; ATP), carbon dioxide (CO2) rượu (ethanol) (Bekatorou, 2016) + Lên men rượu diễn thông qua đường Embden Meyerhof – Parnas (đường phân), tức trình chuyển hóa đường hexose, chẳng hạn glucose, thành hai phân tử pyruvate hai phân tử ATP phân tử hexose (Hình 2.1) Các chủng S cerevisiae tự nhiên lên men glucose, mannose fructose thơng qua đường đường phân, galactose lên men thông qua đường Leloir kết hợp đường phân (Maris cộng sự, 2006) Hình 2.1 Sơ đồ mười phản ứng trình đường phân (con đường EMP) biến đổi phân tử glucose thành hai phân tử axit pyruvic Con đường Leloir thúc đẩy trình chuyển đổi beta-D-galactose thành glucose-1-phosphate, sau sử dụng đường đường phân Ở hầu hết vi sinh vật, bao gồm S cerevisiae, cần có năm loại enzyme để xúc tác q trình chuyển đổi này: galactose mutarotase, galactokinase, galactose-1-phosphate uridyltransferase, uridine diphosphat (UDP)-galactose-4epimerase phosphoglucomutase (Sellick cộng sự, 2008) + Bước đường chuyển đổi beta-D-galactose thành alphaD-galactose nhờ enzyme mutarotase + Sau đó, galactose-1-phosphate hình thành với hoạt động galactokinase, trao đổi nhóm glucose từ UDP-glucose để tạo UDP-galactose giải phóng glucose-1-phosphate + Enzyme epimerase chuyển đổi UDP-galactose thành UDP-glucose (bằng cách thay đổi hóa học lập thể C-4) + Glucose giải phóng dạng glucose-1-phosphate chuyển thành glucose-6-phosphate nhờ tác dụng phosphoglucomutase vào đường đường phân (Sellick cộng sự, 2008) Hình 2.2 Tóm tắt q trình dị hóa hexose lên men rượu nấm men Saccharomyces cerevisiae 1: Galactokinase (GAL1; EC: 2.7.1.6); 2: Galactose-1-phosphate uridylytransferase (GAL7; EC: 2.7.7.12); 3: Phosphoglucomutase (GAL5 PMG2; EC: 5.4.2.2); 4: Glucose6-phosphate isomerase (PGI1; EC: 5.3.1.9); 5,7: Hexokinase (HXK1 / HXK2; EC: 2.7.1.1); 6: Mannose-6-phosphate isomerase (PMI40; EC: 5.3.1.8); 8: Pyruvate decarboxylase (PDC1; EC 4.1.1.1); 9: Alcohol dehydrogenase (ADH1; EC: 1.1.1.1) (dựa Bekatorou, 2016; Maris cộng sự, 2006) Mannose fructose hai hexose lên men S cerevisiae + Sau q trình phosphoryl hóa xúc tác hexokinase, mannose-6phosphate đồng phân hóa thành fructose-6-phosphate mannose-6 phosphate isomerase hình 2.2 + Trong điều kiện kỵ khí q trình lên men rượu S cerevisiae, NADH tạo thành glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase tái oxy hóa thành NAD+ tác động kết hợp pyruvate decarboxylase (PCD; khử carboxyl khơng oxy hóa pyruvate thành acetaldehyde) rượu dehydrogenase (ADH; rượu: NAD+ oxidoreductase) (Agarwal cộng sự, 2013; Ho cộng sự, 2017; Maris cộng sự, 2006) Cơng thức hóa học tổng thể cho trình lên men rượu là: C6H1206  2C2H5OH + CO2 Với sản lượng lý thuyết 0,51g etanol 0,49g CO2 từ 1g đường Tuy nhiên, suất thực tế trình lên men rượu thấp (thường khoảng 0,46 g etanol 0,44 g CO2 trình lên men rượu) (Bekatorou, 2016) Giấm sản xuất từ nguyên liệu thơ có chứa đường lên men trực tiếp Nguyên liệu có chứa tinh bột disaccharid (như saccharose lactose) phải thủy phân trước lên men, Hình 2.3 Nho, táo gạo nguyên liệu ban đầu phổ biến sử dụng để sản xuất giấm, giấm mạch nha, giấm trái nhiệt đới, giấm mía loại giấm khác sản xuất số quốc gia nghiên cứu phát triển, mơ tả phần sau chương Hình 2.3 Sơ đồ dây chuyền sản xuất giấm Saccharose thủy phân thành glucose fructose men invertase (EC 3.2.1.26; beta-fructofuranosidase; S cerevisiae gene: SUC2), enzyme ngoại bào phân bố rộng rãi thực vật vi sinh vật (Sainz-Polo cộng sự, 2013) Beta-galactosidase (EC3.2.1.23; galactohydrolase; thường gọi lactase), enzyme thủy phân lactose thành glucose galactose, không biểu S.cerevisiae enzyme thủy phân chủ yếu xuất thực vật, động vật bậc cao vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn, nấm men nấm sợi Kluyveromyces, Bacillus, Bifidobacterium, Aspergillus Streptococcus spp (Xavier cộng sự, 2018) => Do đó, q trình lên men cồn nguồn có chứa lactose, chẳng hạn whey phơ mai, địi hỏi phải thủy phân trước loài lên men lactose Nấm men Saccharomyces cerevisiae Hình 2.4.Nấm men saccharomyces cerevisiae Nấm men S cerevisiae loài sử dụng rộng rãi để lên men rượu chịu nồng độ đường etanol cao, giá trị pH thấp, nhiệt độ thấp, áp suất cao lưu huỳnh đioxit (SO2) (Bekatorou, 2016; Jackson, 2008) Nấm men S cerevisiae chuyển đổi hồn tồn đường điều kiện lên men đồ uống có cồn thông thường (bia rượu) tạo lượng thấp hợp chất khơng mong muốn (ví dụ, hydro sulfua, axit axetic ) khối lượng tế bào khơng có oxy Q trình lên men tự phát, chẳng hạn cách làm rượu vang giấm truyền thống, bao gồm loài nấm men khác chiếm ưu tùy thuộc vào thành phần chất, điều kiện quy trình giai đoạn quy trình (Bekatorou, 2016; Jackson, 2008) Ở S cerevisiae, glucose vận chuyển qua khuếch tán thuận lợi đó, hấp thu glucose đòi hỏi gradient nồng độ qua màng sinh chất S cerevisiae chứa 32 thành phần họ vận chuyển hexose (HXT) liên quan đến điều hịa phiên mã sau phiên mã, tính đặc hiệu chất (chỉ chất cụ thể phản ứng với vị trí hoạt động enzyme) lực với glucose (Maris cộng sự, 2006) Nói chung, để S cerevisiae lên men carbohydrate khơng phải glucose (như fructose, mannose galactose), yêu cầu diện chất vận chuyển chức màng sinh chất, diện enzyme kết hợp chuyển hóa đường với đường đường phân trì cân oxy hóa khử khép kín (Maris cộng sự, 2006) Q trình axetic hóa Q trình axetic hóa sản xuất giấm thực vi khuẩn axit axetic (AAB), vi khuẩn hiếu khí bắt buộc với khả oxy hóa khơng hồn tồn rượu đường thành axit hữu Quá trình oxy hóa khơng hồn tồn xúc tác dehydrogenase phụ thuộc quinone pyrroloquinoline liên kết màng (PQQ-dDs), kết nối với chuỗi hô hấp cách khử ubiquinone thành ubiquinol Q trình oxy hóa ubiquinol kết hợp với q trình khử oxy chất oxy hóa quinol Do đó, rượu đường bị oxy hóa thành axit hữu vùng ngoại vi PQQ-dDs, ATP tạo thơng qua q trình phosphoryl hóa oxy hóa Trong hầu hết trường hợp, axit hữu hình thành theo phương pháp phân cực dạng chất chuyển hóa cuối khơng sử dụng làm nguồn cacbon Tuy nhiên, rượu đường, chẳng hạn etanol glucose, đơi bị oxy hóa đồng thời PQQ-dDs liên kết màng màng tế bào dehydrogenase hòa tan tế bào chất, cho trình tạo lượng đồng hóa cacbon (Arai cộng sự, 2016 ; Sakurai cộng sự, 2011) Acetobacter hầu hết loài Gluconacetobacter phát triển etanol tích lũy axetat q trình oxy hóa khơng hồn tồn Tuy nhiên, chất (etanol) tiêu thụ, chúng bị oxy hóa hồn tồn axetat tích lũy, q trình gọi q trình oxy hóa axetat gây gia tăng hoạt tính enzym chu trình axit tricarboxylic(TCA) acetyl-CoA synthetase (Acs) (Hình 3.3) Sự phát triển etanol dẫn đến tích tụ axetat diễn giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân đầu tiên, q trình oxy hóa axetat diễn giai đoạn cấp số nhân thứ hai (tăng trưởng diauxic) Q trình rõ ràng khơng thuận lợi sản xuất giấm, chế kiểm sốt việc chuyển từ oxy hóa khơng hồn tồn / đồng hóa sang chuyển hóa lượng carbon AAB chưa hiểu đầy đủ (Arai cộng sự, 2016; Sakurai cộng sự, 2011) Hình 3.3 Tóm tắt đường chuyển hóa carbon trung tâm Acetobacter aceti sở hữu chu trình TCA hồn chỉnh gen đường glyoxylase (dựa Arai cộng sự, 2016) 3.1 Acetic Acid Bacteria AAB tế bào Gram âm Gram biến đổi, không tạo bào tử, hình elip tế bào hình que, xảy dạng tế bào đơn lẻ, cặp tế bào chuỗi tế bào ngắn di động qua màng lơng roi phân cực AAB dương tính với catalase oxydase âm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, với oxy chất nhận điện tử cuối Hình 3.1: Acetic Acid Bacteria Độ pH sinh trưởng tối ưu chúng 5,0 – 6,5, chúng phát triển pH 3–4, nhiệt độ phát triển tối ưu cho hầu hết loài 28 – 30oC AAB gán cho thứ tự Rhodospirillales phần Alphaproteobacteria, họ Acetobacteraceae, chúng đại diện chi sau: Acetobacter, Acidomonas, Ameyamaea, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter, Granacteribacter, Kozakia, Neoasaia, Neokomribataea, Neokomribataea, Neokomribataea Swaminathania Tanticharoenia Các đặc điểm khác biệt loài chi AAB khác cung cấp đánh giá Mamlouk Gullo (2013), sách gần Matsushita cộng (2016) 10 AAB tìm thấy chất có chứa đường, etanol axit, chẳng hạn thực vật đồ uống lên men Các nguồn sử dụng rộng rãi để phân lập AAB Hầu hết dòng phân lập trì oC tháng mơi trường thạch thích hợp, bảo quản lâu dài đạt cách làm khô đông lạnh, bảo quản nitơ lỏng bảo quản lạnh –80 oC Để chọn AAB từ số chủng phân lập, chúng thường kiểm tra phát triển môi trường glucose – etanol – nitơ với pH 3,5 Để xác định mức độ chung, ứng cử viên AAB thu thường phải phân tích trình tự gen 16S rRNA, đặc biệt để xây dựng phát sinh loài Đối với việc xác định mức độ cụ thể, việc lai DNADNA toàn bộ gen cần thiết chủng xác định phân loại cấp độ chung Q trình oxy hóa etanol thành axit axetic sản xuất giấm chủ yếu thực Acetobacter, Gluconobacter, Gluconacetobacter Komagataeibacter, số 17 thành viên chi AAB Chi Acetobacter chi lâu đời phân loại AAB chi họ Acetobacteraceae Hình 3.2: Sự tạo thành axit axetic Chi có liên quan mặt phát sinh lồi với chi Gluconobacter, Neokomagataea, Swingsia Saccharibacter Trong chi Acetobacter, có hai nhóm 11 khác mặt phát sinh lồi: A aceti A pasteurianus Ở A aceti, axit tạo từ L-arabinose, D-xylose, D-glucose, D-galactose, D-mannose etanol Như mô tả phần trước, số điều kiện định, etanol bị oxy hóa thành axetat ngoại chất, ADH phụ thuộc PQQ (gen adhAB / adhS) ALDH, tế bào chất, NAD hòa tan (P) + ADH phụ thuộc (gen adh1 adh2) ALDH (Arai cộng sự, 2016) Ngoài gen adhAB / adhS, gen adh1 adh2 xác định hệ gen A aceti, có tính tương đồng cao với gen ADH I ADH II tương ứng A pasteurianus (Arai cộng sự, 2016) ALDH liên kết màng (gen ald-FGH) tham gia vào q trình tích tụ axetat từ q trình oxy hóa khơng hồn tồn etanol màng tế bào Một số gen mã hóa ALDH phụ thuộc NAD (P) + hịa tan giả định, tham gia vào trình hình thành axetat tế bào chất, xác định A aceti (Arai cộng sự, 2016) Trước bước vào chu trình TCA để oxy hóa hồn tồn, axetat chuyển hóa thành axetyl-CoA thơng qua hai đường, xúc tác Acs xúc tác phosphotransacetylase (Pta) axetat kinase (Ack) (Arai cộng sự, 2016) Q trình tạo acetyl-CoA từ axetat xúc tác succinyl-CoA: axetat CoA transferase (SCACT) (gen aarC AAB) Ở A aceti, gen acs1 acs2 xác định gen Pta Ack, cho thấy q trình chuyển hóa axetat bắt đầu đường Acs SCACT Theo Arai cộng (2016), etanol kìm hãm đáng kể chu trình TCA cấp độ phiên mã A aceti, điều giải thích tích tụ axetat Cụ thể, q trình oxy hóa khơng hồn tồn etanol AAB, etanol sử dụng làm nguồn lượng Khi ethanol glucose có chất A.aceti, q trình chuyển hóa tràn glucose xảy kìm hãm gen chu trình TCA ethanol biểu tăng cường gen enzyme đường phân Kết tích tụ tế bào chất axetat acetylCoA, chất ức chế trình oxy hóa ethanol tế bào chất dẫn đến trình oxy hóa khơng hồn tồn tế bào chất Sự thiếu hụt đường glyoxylate, bao gồm isocitrate lyase (gen aceA) malate synthase (gen glcB), mong muốn cho sản xuất giấm cơng nghiệp từ etanol, thúc đẩy q trình chuyển hóa tràn glucose (Hình 3.3) Mô tả đặc điểm trao đổi chất A aceti dựa 12 cấu hình phiên mã, theo Arai et al Chúng nên xác nhận phân tích sinh hóa chuyển hóa Trong q trình lên men axetat, lồi Acetobacter chiếm ưu nồng độ axit axetic thấp A pasteurianus lồi tìm thấy nhiều nho dùng làm rượu, loài Acetobacter sp., Chẳng hạn A malorum, A cerevisiae, A.aceti, tìm thấy nho ăn Khi nồng độ axit axetic giấm vượt 5%, loài khác Komagataeibacter europaeus Gluconacetobacter trung gian chiếm ưu Gluconacetobacter europaeus lồi thu hồi từ giấm cơng nghiệp, lồi có hoạt tính ADH cao ổn định cho phép tăng trưởng hoạt động trao đổi chất nồng độ axit axetic cao Ở lồi AAB khác (ví dụ: A pasteurianus G trung gian), nồng độ axit axetic cao gây căng thẳng tế bào hoạt động ADH giảm nhanh A.aceti, q trình cơng nghiệp liên tục, phát triển khả phát triển nồng độ axetat cao 5%, tạo kiểu hình ổn định áp suất riêng Trong quy trình giấm cơng nghiệp bán liên tục, khả chịu axit cao tới 11,5 – 12% quan sát thấy chủng thích ứng với điều kiện quy trình 3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men giấm 3.2.1 Oxy Oxy yếu tố giới hạn sản xuất giấm tính hịa tan bị ảnh hưởng đáng kể thiết kế lị phản ứng sinh học, hệ thống sục khí sử dụng, nhiệt độ quy trình thành phần chất Để đảm bảo q trình acetyl hóa tối ưu, cần phải đạt trì mức oxy hịa tan thích hợp, điều ảnh hưởng đến tốc độ suất trình lên men, chất lượng cảm quan sản phẩm cuối (Ubeda cộng sự, 2011) Trong phương pháp acetyl hóa bề mặt truyền thống, khơng áp dụng q trình hịa tan oxy cưỡng Q trình truyền oxy thực màng AAB hình thành bề mặt giấm lên men khơng khí khoang đầu thùng Oxy xâm nhập qua gỗ thùng với tốc độ khoảng 30 mg / L năm (Gullo Giudici, 2008) Mặt khác, sản xuất giấm rượu cơng nghiệp chìm, nồng độ oxy hòa tan quan trọng phát triển vi khuẩn, đó, cung cấp khơng khí bắt buộc Tuy nhiên, nồng độ oxy hòa tan mức ức chế phát triển AAB Nồng độ oxy hòa tan tối ưu trình bán liên tục thiết lập 1-3 mg / kg (Gullo Giudici, 2008; Ho et al., 2017) 13 3.2.2 Nhiệt độ AAB vi sinh vật ưa nhiệt, nhiệt độ phát triển tối ưu chúng từ 25 đến 30oC Trên nhiệt độ tối ưu, vi khuẩn bị vơ hiệu hóa enzym thiết yếu bị biến tính, màng bị hư hỏng làm thành phần cấu tạo tế bào, tác dụng độc hại axit axetic tăng lên Nhiệt độ tăng trưởng tối thiểu tối đa khó xác định biến đổi loài ảnh hưởng thành phần mơi trường Nói chung, hệ thống không trang bị kiểm sốt nhiệt độ (quy trình truyền thống), hoạt động AAB ưa chuộng mùa xuân mùa hè q trình acetyl hóa bị mắc kẹt xảy gia tăng nhiệt độ, đơi vượt 40oC nước Địa Trung Hải sản xuất giấm (Gullo Giudici, 2008; Ho cộng sự, 2017) Trong quy trình chìm cơng nghiệp, nhiệt độ làm việc tối ưu khoảng 30oC Nhiệt độ tăng trình trình lên men axit axetic q trình hiếu khí thuận lợi mặt nhiệt động học (khoảng 8,4 MJ / L etanol bị oxy hóa), dẫn đến chức chuyển hóa AAB bị giảm khơng thể đảo ngược; đó, kiểm sốt nhiệt độ bắt buộc (Gullo cộng sự, 2014; Matsutani cộng sự, 2013) Trên giới hạn nhiệt độ sản xuất giấm công nghiệp, số nghiên cứu xuất chủng AAB có chất làm mát nhiệt, có khả oxy hóa ethanol (lên đến 9%) khoảng 38–40 ° C mà khơng có thời gian trễ đáng kể Ví dụ, hai chủng A Tropicalis A pasteurianus sàng lọc, phát triển 40 45 oC, đề xuất thích hợp cho sản xuất giấm thủ cơng Vì q trình oxy hóa etanol phản ứng tỏa nhiệt, nên tính bền nhiệt đặc điểm AAB có lợi cho sản xuất giấm cơng nghiệp có khả giảm chi phí làm lạnh (Gullo Giudici, 2008; Ho et al., 2017) 3.2.3 pH Giá trị pH tối ưu cho phát triển AAB nằm khoảng 5,0 – 6,5; nhiên, số loài phát triển giá trị pH thấp hơn, trường hợp rượu vang có độ pH 3,02– 3,85 sản xuất giấm balsamic truyền thống, phạm hoạt động vi khuẩn quan sát thấy giá trị pH Các chủng AAB phân lập từ môi trường axetat với pH 2,0– 2,3 Khả chịu đựng AAB độ pH thấp phụ thuộc nhiều vào thông số khác nhau, chẳng hạn nồng độ etanol oxy; đặc biệt, giảm hàm lượng etanol cao hàm lượng oxy thấp (Gullo Giudici, 2008) 14 KẾT LUẬN Tóm lại, nhờ có giấm mà sản xuất người ta tạo nhiều loại sản phẩm khác nhau, phù hợp với nhu cầu người tiêu dùng Mặt khác, hóa sinh trình sản xuất giấm quan trọng khơng Đồng thời, nhờ việc tìm hiểu hóa sinh q trình sản xuất giấm giúp chúng em giả vấn đề lên men rượu, q trình acetic hóa,… 15 ... lên men rượu loại đường lên men nào, lên men giấm (oxy hóa etanol) Ngày nay, với thay đổi cách tạo loại giấm khác làm cho đa dạng loại giấm tăng cao Với trình sản xuất giấm q trình hóa sinh sản. .. với điều kiện quy trình 3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men giấm 3.2.1 Oxy Oxy yếu tố giới hạn sản xuất giấm tính hịa tan bị ảnh hưởng đáng kể thiết kế lò phản ứng sinh học, hệ thống... q trình lên men liên quan đến sản xuất giấm mô tả ngắn gọn 2 Lên men rượu Quá trình lên men rượu sản xuất giấm thường diễn nhanh chóng thường làm cạn kiệt hầu hết loại đường có sẵn ba tuần + Các