KIỂM NGHIỆM Coliforms VÀ E.coli TRONG THỰC PHẨM

Bài báo cáo môn Nuôi cấy mô: KIỂM NGHIỆM Coliforms VÀ E.coli TRONG THỰC PHẨM để phát hiện Sallmonella có trong thực phẩm. Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến đỏ đậm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa muối mật. Quy trình khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường BGBL

Trường Đại Học Tiền Giang Khoa Nông Nghiệp – Công Nghệ Thực Phẩm HP PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH KIỂM NGHIỆM Coliforms VÀ E.coli TRONG THỰC PHẨM GVHD: TS.TRƯƠNG QUỐC TẤT Lớp: ĐH CNSH 19 Nhóm 3: Phan Thị Ngọc Hân: 019142002 Đỗ Nhựt Ý: 01914200 1.1 Nguyên tắc Đồng mẫu, cấy lượng định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose Đếm số khuẩn lạc lên men lactose sinh acid ủ o 37 C 24 – 48 Ngồi lactose, mơi trường chọn lọc cho Coliforms cịn chứa muối mật ức chế vi khuẩn Gram dương chât thị pH neutral red, crystal violet Trên môi trường khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến đỏ đậm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa muối mật Quy trình khẳng định thực cách ni cấy môi trường BGBL 1.2 Phương pháp Đồng 23gmẫu thịt cá tra pha loãng mẫu 200ml SPW o Hút 1ml dung dịch mẫu vào đĩa petri, bổ sung thêm 10 – 15ml môi trường VRB, để đông, ủ 37 C 24 – 48 Đếm khuẩn lạc màu đỏ đến đậm, có vịng tủa muối mật, đường kính ≥ 0.5mm o Chọn khuẩn lạc cấy vào môi trường BGBL lỏng, ủ 37 C 24 – 48 Đếm số ống có sinh hơi, tính tỉ lệ khẳng định Coliforms Hình 4.1: Quy trình định lượng Coliforms phương pháp đếm khuẩn lạc 2 Định lượng E.coli phương pháp đếm khuẩn lạc 2.1 Nguyên tắc o Mẫu đồng cấy lượng địnhh môi trường thạch chọn lọc chứa lactose, ủ 44 C 24 Trên môi trường VRB, đếm khuẩn lạc đặc trưng Coliforms, khẳng định khuẩn lạc đếm E.coli thử nghiệm IMViC 2.2 Phương pháp Đồng 23g mẫu thịt cá tra pha loãng mẫu 200ml SPW o Hút 1ml dung dịch mẫu cho vào đĩa petri, bổ sung 10 – 15 ml môi trường EMB, để đông, ủ 37 C 24 – 48 Đếm khuẩn lạc trịn dẹt, hình dĩa, có màu ánh kim xanh, đường kính ≥ 0,5mm o Chọn khuẩn lạc cấy vào môi trường EC lỏng, ủ 44 C 24 – 48 Chọn ống nghiệm có sinh hơi, cấy sang môi trường tryptone lỏng, MRVR, SCA Thử nghiệm IMViC Đếm số ống nghiệm cho kết IMViC + + - Tính tỉ lệ khẳng định E.Coli Mật độ E.coli Hình 4.2: Quy trình định lượng E.coli phương pháp đếm khuẩn lạc 3 Kết 3.1 Thử nghiệm Coliforms mẫu thịt cá tra Sau 48 ủ, mơi trường VRB có xuất khuẩn lạc màu đỏ đến đậm hình 4.3 Hình 4.3 Kết cấy trang mẫu môi trường VRB -2 -3 -4 nồng độ 10 , 10 , 10 (theo thứ tự từ trái sang) Tính kết quả: số khuẩn lạc nồng độ cao thấp 25 nên kết số trung bình cộng khuẩn lạc đếm tính cho 1g 1ml mẫu 2 CFU/g=(21/3)10 = 7.10 Ống Durham Hình 4.4 Kết thử nghiệm khả sinh Coliforms mơi trường BGBL Hình 4.5 Kết thử nghiệm khả sinh vi khuẩn (nguồn Internet) 3.2Thử nghiệm E.coli mẫu thịt cá tra -2 -3 -4 Mẫu thịt cá tra sau đồng pha loãng nồng độ 10 , 10 , 10 cấy trang môi trường đặc trưng EMB sau 24 ủ xuất khuẩn lạc trịn dẹt, hình dĩa, có màu ánh kim xanh Hình 4.6 Hình 4.6 Kết cấy trang mẫu mơi trường EMB -2 -3 -4 nồng độ 10 , 10 , 10 (theo thứ tự từ trái sang) 3.2.1 Thử nghiệm Indole Nguyên tắc: Tryptophan acid amin có thểbịoxi hóa sốvi sinh vậtcó hệ enzyme tryptophanase tạo nên sản phẩm chứa gốc indol Việc phát indol thực phản ứng phân tử với thuốc thử a p-Dimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ Đọc kết quả: (+) xuất lớp màuđỏtrên bềmặtmôi trường (-) lớp màu vàng thuốc thử Đơi có xuất màu cam skatol, tiền chất methyl hóa indol, tạo Hình 4.8 Kết thử nghiệm Indole (nguồn Internet) 3.2.2 Thử nghiệm Methyl red + Nguyên tắc: chỉthị đỏmethyl red giúp phân biệt nồngđộH diện môitrường sau vi sinh vật lên men glucose Chỉ thị thay đổi màu sau: pH6.0 màu vàng Đọc kết quả: (+) môi trường có màuđỏsau bổsungthuốc thử (-) có màu vàng Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống môi trường có giống ngày thực lại thử nghiệm Hình 4.9 Kết thử nghiệm Methyl red (nguồn Internet) 3.2.3 Thử nghiệm Citrate Nguyên tắc: sựbiến dưỡng citrate vi sinh vật sẽtạo CO làm kềm hóa mơitrường Mặt khác VSV có khả sử dụng citrate làm nguồn carbon có khả dùng muối ammonium làm nguồn đạm Sự phân giải muối ammonium dùng làm nguồn đạm mơi trường sinh NH làm kiềm hóa môi trường Sự gia tăng giá trị pH thị đổi màu thị pH môi trường Đọc kết quả: (+) xuất khuẩn lạc môi trườngchuyển sang màu xanh dương (-) khơng có khuẩn lạc mơi trường giữ ngun màu xanh lục Hình 4.10 Kết thử nghiệm Citrate (nguồn Internet) 3.2.4 Thử nghiệm VP Nguyên tắc: môi trường sử dụng môi trường lỏng MR-VP, pH 6.9 Dùng que cấy vịng cấy vào ống mơi trường MR-VP sinh khối từ khuẩn lạc chủng ủ 18-24 môi trường KIA Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường Sử dụngthuốc thử Barrittư(dung dịch A 5% α-naphthol cồntuyệt đối, dung dịch B 40% NaOH hay KOH) Trước tiên nhỏ giọt dung dịch A, sau nhỏ giọt dung dịch B Đọc kết sau 20 phút chậm Đọc kết quả: Salmonella cho phản ứng âm tính có tượng khơng đổi màu bề mặt mơi trường, dương tính có màu đỏ bề mặt mơi trường Hình 3.6 Kết thử nghiệm VP (nguồn Internet) ... vào môi trường EC lỏng, ủ 44 C 24 – 48 Chọn ống nghiệm có sinh hơi, cấy sang mơi trường tryptone lỏng, MRVR, SCA Thử nghiệm IMViC Đếm số ống nghiệm cho kết IMViC + + - Tính tỉ lệ khẳng định E.Coli. .. CFU/g=(21/3)10 = 7.10 Ống Durham Hình 4.4 Kết thử nghiệm khả sinh Coliforms mơi trường BGBL Hình 4.5 Kết thử nghiệm khả sinh vi khuẩn (nguồn Internet) 3.2Thử nghiệm E.coli mẫu thịt cá tra -2 -3 -4 Mẫu thịt... pH>6.0 màu vàng Đọc kết quả: (+) mơi trường có màuđỏsau bổsungthuốc thử (-) có màu vàng Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống mơi trường có giống ngày thực lại thử nghiệm Hình 4.9 Kết thử nghiệm