Mục tiêu cảu đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố sinh thái đến sinh trưởng, phát triển và chất lượng của nấm Vân Chi (Trametes versicolor) nuôi trồng tại Đà Nẵng là xác định ảnh hưởng của một số nhân tố môi trường đến sự sinh trưởng của sợi nấm Vân Chi trong giai đoạn sản xuất giống nấm; khảo sát và chọn được các khu vực phù hợp để trồng thử nghiệm nấm Vân Chi tại Đà Nẵng; xác định được ảnh hưởng của một số nhân tố sinh thái đến khả năng sinh trưởng, phát triển và chất lượng của nấm Vân Chi nuôi trồng tại Đà Nẵng.
Trang 1ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM >mx«
TRÀN THỊ HÀ ANH
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỚNG CỦA MỘT SO
NHÂN TÓ SINH THÁI ĐỀN SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIÊN VÀ
CHAT LUQNG CUA NÁM VÂN CHI (TRAMETES VERSICOLOR)
NUÔI TRÔNG TẠI ĐÀ NẴNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH THÁI HỌC
Trang 2ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
aQe
NGHIEN CUU ANH HUONG CUA MOT SO
NHAN TO SINH THAI DEN SINH TRUONG, PHAT TRIEN VA
CHAT LUQNG CUA NAM VAN CHI (TRAMETES VERSICOLOR) NUOI TRONG TAI DA NANG
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Những số liệu được sử dụng trong luận văn là trung thực
Các kết quả nghiên cứu trong luận văn do tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan và chưa từng được công bố trong bắt kỳ nghiên cứu nào khác
'Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài nghiên cứu của minh
Tác giả
—MAwL-
Trang 4LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô đã truyền đạt những kiến thức khoa học chuyên ngành bổ ích qua các môn học, giúp tôi trau dồi kiến thức trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu Đặc biệt, tôi gửi lời cảm ơn chân thành đến TS.Võ Châu Tuấn, PGS TS Đỗ Thu Hà người thầy đã luôn theo sát, hướng dẫn và chỉ bảo tôi
tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện công trình nghiên cứu này
'Tôi cảm ơn hợp tác xã nắm tại Hòa Vang, Sơn Trà, Ngũ Hành Sơn - Đà Nẵng ` đã giúp tôi rất nhiều trong quá trình tôi thực hiện đề tài này
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động viên, cảm ơn các đồng
nghiệp tại trường THPT Nguyễn Hiền nơi tôi công tác đã luôn quan tâm và giúp đỡ tôi
Trang 5NGHIÊN CU'U ANH HUONG CUA MỘT SÓ NHÂN TÓ SINH THÁI ĐẾN SINH TRUONG, PHAT TRIEN VA CHAT LUQNG CUA NÁM VÂN CHI (TRAMETES
VERSICOLOR) NUÔI TRÒNG TẠI ĐÀ NẴNG Ngành: Sinh thái học
Họ tên học viên: Trần Thị Hà Anh Người hướng dẫn khoa h‹
1 TS Võ Chau Tr 2 PGS.TS Đỗ Thu Hà
Cơ sở đào tạo: Đại học Đà Nẵng - trường Đại học Sư phạm
'TTóm tắt: Trong luận văn-này, kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của các nhân tố sinh thai đến
sự sinh trưởng, phát triển và chất lượng của nắm Vân Chỉ (7ramefes versicolor) nuôi trồng tại
thành phố Đà Nẵng Giai đoạn nuôi cấy giống Vân Chỉ dạng lỏng được tiến hành từ tháng 1
„đến tháng 3 năm 2018 Kết quả cho thấy, trên môi trường PG cải tiến với pÏI=S.5, nhiệt độ là 30°C là thích hợp cho sinh trưởng của sợi nắm Vân Chỉ Sau 7 ngày nuôi cấy sợi nắm đạt tiêu
chuẩn làm giống cắp 2 ở dạng lòng Nắm Vân Chỉ sinh trưởng, phát triển tốt nhất khi trồng trên cơ chất có thành phần là 83% mùn cưa + 15% cám gạo + 1% saccharose + 1% CaCO; ở khu vực Hòa Nhơn — Hòa Vang tương ứng với nhiệt độ là 26,2 đến 29.3°C, độ âm 85-89% Cụ thé sau 3
tháng nuôi trồng, nắm Vân Chỉ sinh trưởng, phát triển đạt khối lượng nắm tươi là 15,03g/bịch,
Trang 6RESEARCH ON THE IMPACT OF ECONOMIC PERSONS IN BIRTH,
DEVELOPMENT AND QUALITY OF TRAMETES VERSICOLOR CULTURE IN DA NANG Major: Ecology Full name of Master student: Tran Thi Ha Anh ‘Supervisor: 1 Dr Vo Chau Tuan
2 Assoc Prof Dr Do Thu Ha
‘Training institution: The Danang of University, University of Education
Abstract: In this thesis, research results on the influence of ecological factors on the growth, development and quality of Trametes versicolor cultured in Da Nang city The liquid culture phase of Van Chi was conducted from January to March 2018 The results showed that, on PG medium improved at pH 5.5, temperature of 30°C was suitable for growth hyphae Van Chi After 7 days of culture of mushroom hybrids meeting the standards of liquid level 2 seed
The Van Chi mushroom grows best when grown on a substrate containing 83% sawdust +
15% rice bran + 1% saccharose + 1% CaCO; in Hoa Nhon - Hoa Vang area corresponding to temperature is 26.2 to 29.3°C, humidity 85-89% Specifically after 3 months cultivating, Van Chi mushroom grows, grows to fresh weight of 15.03g / bag, dry Weight is 13.35g / bag and dry / fresh weight is quite high, teaching 88, 82% Van Chi mushroom after harvesting has the components of polysaccharides, PSP, protein, B1 and some other essential minerals In addition, the extract of fungal fruit has antioxidant and antimicrobial properties
Key words: Trametes versicolor, culture, gy, growth, quality, Da Nang
Trang 7v
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN, 2222111221121 die
00991005 .Ô.ÔỎ ii
NGHIEN CUU ANH HUONG CUA MOT SO NHAN TO SINH THAI DEN SINH TRUONG, PHAT TRIEN VA CHAT LUQNG CUA NAM VAN CHI (7RAMETES
VERSICOLOR) NUÔI TRÒNG TẠI ĐÀ NẴNG 2 e.s ee TẾ MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TÁT 22.2 2tr MP DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH MO DAU - 1 Lí do chọn đề tài 2 Mục tiêu của đề tài
3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
CHƯƠNG 1 TONG QUAN TAI LIEU
1.1 Giới thiệu chung về nắm Vân Chỉ 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.2 Giá trị dược học 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nắm Vân Chỉ 1.3.1 Nguồn cơ chất 1.3.2 Các chất dinh dưỡng 1.3.3 Các yếu tố môi trường
1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nắm 1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thể giới
1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam -
CHƯƠNG 2 DOI TUQNG, PHAM VI, NOL DUNG VA PHUONG PHAP
NGHIÊN CỨU 15
2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Phạm vi nghiên cứu 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp điều tra và khảo sát
Trang 82.4.4 Phương pháp định lượng các hợp chất và xác định hoạt tinh sinh học trong nắm Vân Chỉ nuôi trồng tại Đà Nẵng 2222222srrecrrrrerrreerrreeerr TỔ
2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu - 21
CHƯƠNG 3 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN -2 3.1 Ảnh hưởng của một số nhân tố môi trường đến sự sinh trưởng sinh khối
sợi nắm Vân Chỉ trong quá trình sản xuất giống
3.1.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của
sợi nắm Vân Chỉ "— meNT -22
3.1.2 Anh hướng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của sợi nắm Vân Chỉ trong môi trường địch thê "
3.1.3 Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng của sợi nám
'Vân Chỉ trong môi trường dịch thê -24
3.2 Khảo sát các điều kiện sinh thái để xác định vùng trồng nấm Vân Chỉ tại Đà Nẵng -27 3.3 Khảo sát ảnh hướng c¡ của các nhân tố sinh thái đến sinh trưởng, phat tr triển của nắm Vân Chỉ + 8 3.3.1 Ảnh hưởng của cơ chất đến sinh trưởng, phát triển của nắm Vân Chi .28 3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nuôi trồng khác nhau đến oneal ng khác nhau đến trong quá trình trồng tại Đà Nẵng ti lệ nhiễm nấm dại 3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nuôi
khả năng lan sợi trên cơ chất trồng 32
3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nuôi trồng khác nhau đến
sinh trưởng của quả thể nấm Vân Chỉ scents m
3.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nuôi trồng khác nhau đến
năng suất quả thể nắm Vân Chỉ -34
3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm đến n chất lượng quả ú thể trong g quá t trình
nuôi trồng nấm Vân Chỉ ở các khu vực khác nhau -.-s 36 3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nuôi trồng khác nhau đến
seoo.36 3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nuôi trồng khác nhau đến sự tích lũy Protein, khoáng tổng số và vitamin BI trong nắm Vân Chỉ 37
3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nuôi trồng khác nhau đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết nám Vân Chỉ + 38 sự tích lũy polysaccharides và polysaccharide peptit trong nắm Vân Chỉ
Trang 9vii
3.5.1 Xây dựng quy trình sản xuất giống nắm Vân Chỉ dạng lỏng 7 3.5.2 Xây dựng quy trình nuôi trồng nắm Vân Chỉ tại Đà Nẵng
KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
Trang 10DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu Tên bảng Trang
Bảng3.1 | Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh | 22 trưởng của sợi nắm Vân Chỉ
Bảng 32 | Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của sợi — |24 nắm Vân Chỉ trong môi trường dịch thể
Bảng 3.3 Các yếu tố khí hậu các năm từ 2013 đến 2017 tại thành phó _ |27 Da Ning
Bang3.4 | Điều kiện khí hậu từ tháng 4 đến tháng 7 nim 2018 tai Da | 27 Nẵng
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của cơ chất đến sinh trưởng, phat trién của nám _ | 29 'Vân Chỉ trong quá trình nuôi trồng
Bảng 3.6 | Ảnh hướng của cơ chất đến sinh trưởng và phát triên của quả | 30
thé nam Van Chi
Bang 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nuôi trồng, 31
khác nhau đến tỉ lệ nhiễm nắm dại
Bang 3.8 | Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nuôi trồng, 32
khác nhau đến khả năng lan sợi trên cơ chất trồng
Bang 3.9 | Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nuôi trồng |33 khác nhau đến kích thước đọc quả thể nắm Vân Chỉ
Bảng 3.10 - | Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nuôi trồng — |33 khác nhau đến kích thước ngang quả thẻ nắm Vân Chỉ
Bảng 3.11 | Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nuôi trồng — |35 khác nhau đến năng suất quả thể nắm Vân Chỉ
Bảng 3.12 | Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nuôi trồng 36 khác nhau đến sự tích lũy polysaccharides va polysaccharide peptit trong nam Van Chi
Bang 3.13 | Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm ở các khu vực nuôi trồng 37 khác nhau đến sự tich ly Protein, khống tơng số và vitamin BI trong nắm Vân Chỉ
Bảng 3.14 _ | Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nu 38 khác nhau đến khả năng kháng khuẩn của dich cl
Chỉ
Bang 3.15 | Khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết qua thé nam Van Chi | 39
Trang 11x DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Số hiệu Tên hình Trang
Hình 1.1 | Chu trình sống của nắm Vân Chi 5
Hình 2.1 | Quả thể nắm Vân Chỉ ngồi tự nhiên l§
Hình 2.2 _ | Nấm Vân Chi giống cấp 2 trong môi trường nuôi cấy lỏng 15 Hinh 3.1 | Sinh trưởng của sợi nắm Vân Chỉ nuôi cấy trên các môi 2
trường
Hinh 3.2 _ | Sinh trưởng của sợi nấm Vân Chỉ nuôi cấy ở nhiệt độ 24
(a)22°C va (b)30°C
Hình 3.3 | Ảnh hưởng củapH môi trường đến khả năng sinh trưởng của |_ 25 sợi nắm Vân Chỉ trong môi trường dịch thể
Hinh 3.4 | Sinh trưởng sợi nấm vân chỉ trên các môi trường pH, 26
Hình 3.5 | Đo kích thước quả thê nắm Van Chi 34
Hình 3.6 | Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết qua thé nam Van Chi 39 Hình 3.7 _ | Cường độ màu tăng dần trong thí nghiệm kháng oxy hóa của | 40
dịch chiết sợi nắm Vân Chỉ
Trang 121 Lí do chọn đề tài
Nam lớn có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống, chúng có vai trò trong nền
kinh tế, khoa học và tham gia vào các chu trình chuyên hóa vật chất - năng lượng trong tự nhiên Ngày nay nhiều loài nấm được sử dụng làm thực phẩm giàu dinh dưỡng, một số được sử dụng làm dược phẩm để chữa trị một số bệnh nguy hiểm như tìm mạch, béo phì, giải độc và bảo vệ tẾ bào gan, phòng và điều trị loãng xương
Nhiều nhà khoa học cho rằng nấm sẽ là một trong những thực phẩm rất quan trọng và
thông dụng của con người trong tương lai [9]
Hiện nay, ô nhiễm môi trường và thực phẩm bản đang là nguyên nhân chính khiến tỉ lệ mắc ung thư ngày cảng trẻ hóa [7] Việc tìm ra phương pháp phòng ngừa và điều trị các căn bệnh hiểm nghèo này càng được chú trọng Các loại thuốc, hóa chất trị liệu tuy có thể mang lại hiệu quả cho một số trường hợp nhưng chỉ phí rất cao và thường để lại nhiều biến chứng Trong khi đó, nấm dược liệu không chỉ có tác dụng
điều trị mà còn có thê giúp cơ thể phòng một số căn bệnh như: ung thư, tìm mạch,
nâng cao sức đề kháng, Trên thế giới có khoảng 2000 loại nắm có thể ăn và làm thuốc, ngoài nguồn nắm thu hái từ thiên nhiên, người ta đã trồng được hơn 60 loại theo phương pháp thủ công, bán công nghiệp, công nghiệp với hiệu quả và năng suất cao [22, [26]
Nắm Van Chi (Trametes versicolor) là một loại nắm dược liệu có giá trị dược liệu rất cao, đã và đang được ưa chuội
nước châu Âu, châu Mỹ
liên kết với protein, gồm 2 loại chính: polysaccharide peptit (PSP) va polysaccharide
\g ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, các
„ Trong nắm Vân Chi có chứa các hợp chất polysaccharid
krestin (PSK) Chúng đều là những hỗn hợp của các chuỗi đường liên kết với một số protein Tác dụng chung của PSP và PSK là hoạt hóa, tăng cường sự sản sinh, bảo vệ các tế bào của hệ miễn dịch [49] và ức chế nhiều loại tế bảo ung thư như các tế bào
ung thư biểu mô, các tế bào ung thứ máu [76] Ở Nhật Bản, PSK chiết xuất tir nam
Vân Chi đã được chứng minh có khả năng kéo dải thời gian sống thêm 5 năm hoặc hơn cho các bệnh nhân ung thư thuộc nhiều thể loại: ung thư dạ dày, ung thư đại tràng,
ung thư vòm họng, ung thư phổi, ung thư vú [49] Ngoài ra còn có tác dụng rất
mạnh kháng lại virus gây bệnh viêm gan B Trong Y học cô truyền Trung Quốc, nám
Van Chỉ được sử dụng đề làm giảm trầm cảm, giảm đờm, chữa lành rồi loạn phổi, tăng
cường vóc đáng và năng lượng, có ích với các bệnh mãn tính Gần đây PSP còn được chứng minh là có tác dụng chống lại sự xâm nhiễm của virus HIV type 1 [63]
Trang 132
nắm Vân Chỉ Các nghiên cứu cho thấy nấm sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu mát mẻ dao động từ 20°C đến 30°C tùy từng giai đoạn và độ âm cao từ
75% đến 90%
'Việt Nam là một nước nông nghiệp, với nguồn phế phẩm từ nông nghiệp như rơm rạ, mùn cưa, đồi dào Đây là nguyên liệu thích hợp đẻ trồng nấm Bên cạnh đó điều kiện khí hậu của nước ta rất phù hợp với việc nuôi trồng nắm Trong vài năm trở lại đây ngành sản xuất nấm dược liệu ở nước ta đang được quan tâm Các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu các loại giá thể thích hợp để nắm sinh trưởng và phát triển Mô hình sản xuất nắm dược liệu được chuyển giao, sản xuất tại nhiều địa phương và bước đầu đạt những kết quả đáng khích lệ Đà Nẵng cũng là một trong những tỉnh thành có điều kiện khí hậu thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của
các loại nắm dược liệu đặc biệt là nắm Vân Chỉ
Hiện thành phố Đà Nẵng đã phê duyệt quy hoạch 7 vùng phát triển nông nghiệp công nghệ cao, tập trung vào sản xuất rau an toàn, chăn nuôi gia súc gia cầm, sản xuất
nấm thương phẩm và dược liệu Trong những năm gần đây, ngành nuôi trong nam
dược liệu ở Đà Nẵng đã có nhiều chuyên biến tích cực về sự đầu tư, chất lượng giống, công nghệ góp phần nâng cao năng suất, chất lượng nấm Tuy nắm Vân Chi là nắm dược liệu quý, có nhu cầu lớn nhưng việc nghiên cứu sản xuất ở nước ta còn hạn chế như quy mô nhỏ, chỉ phí sản xuất cao và ít hiệu quả Vì vậy việc đa dạng hóa chủng giống nấm dược liệu, cải tiến công nghệ tiến tới sản xuất nắm dược liệu công nghệ cao là vấn đề cấp thiết hiện nay
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiền hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố sinh thái đến sinh trưởng, phát triển và chất lượng
của nấm Vân Chi (Trametes versicolor) nudi trong tại thành phố Đà Nẵng”
2 Mục tiêu của đề tài 2.1 Mục tiêu tông quát
Xác định được ảnh hưởng của một số nhân tố sinh thái đến sinh trưởng, phát triển và chất lượng của nắm Vân Chỉ nuôi trồng tại các khu vực khác nhau ở Đà Nẵng 2.2 Mục tiêu cụ thể ~ Xác định ảnh hưởng của một số nhân tố môi trường đến sự sinh trưởng của sợi xi ~ Khảo sát và chọn được các khu vực phủ hợp để trồng thử nghiệm nắm Vân Chỉ tại Đà Nẵng
~ Xác định được ảnh hưởng của một số nhân tố sinh thái đến khả năng sinh trưởng, phát triển và chất lượng của nấm Vân Chỉ nuôi trồng tại Đà Nẵng
Trang 14
3.1 Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp dẫn liệu khoa học mới về ảnh hưởng của các nhân tố sinh thái đến sự sinh trưởng, phát triển và chất lượng của nắm Vân Chỉ nuôi trồng tại Đà Nẵng
3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài làm cơ sở đề xây dựng quy trình sản xuất giống và nuôi trồng nấm Vân Chỉ trong điều kiện sinh thái tại Đà Nẵng, góp phần sản xuất nguyên liệu, dược liệu lớn và bền vững, phục vụ phát triển kinh tế và chăm sóc sức
Trang 15CHƯƠNG I
TONG QUAN TAI LIEU
1.1 Giới thiệu chung về nắm Van Chi
1.1.1 Vị trí phân loại
Trong hệ thống phân loại nấm Vân Chi Tramees versicolor thuộc giới nấm: Fungi, ngành nắm thật Eumycota, lớp nấm đảm: Basidiomycetes, bộ nấm lỗ: Aphyllophorales, ho nam nhiều lỗ: Polyporaceae và chỉ: Trametes [3], [9]
Nam Van Chi (Trametes versicolor (L.) Pilat) c6 tén khoa hoc truée day la Coriolus versicolor, hit
nay c6 tén méi la Trametes versicolor, có nghĩa là mỏng và nhiều màu sắc Vân Chỉ có tên khoa học phô biến hiện nay la Trametes versicolor sau một thời gian dài được nghiên cứu và đặt tên khác nhau ?zameres versicolor (L:Fr) Pilat, tite 1a loai Coriolus versicolor (L.:Fr) Quél, duge chinh Carl von
Linnacus tim ra va dat tén dau tién: Boletus versicolor L (1753) Sau 46 Persoon
(1805) đưa vào chi Polyporus (với hai loài: P versicolor Fr va P vulutinus Fr) Lucien Quélet (1886) lại đưa vào chỉ Coriolus Sau 50 năm, Abert Pilat (1936) đề nghị và được đa số các nhà nắm học thống nhất xếp vào chỉ Trametes, họ Polyporacea Các hệ thống phân loại về sau cũng phù hợp với quan điểm trên, nên hầu hết những tác giả gần đây đều sử dụng danh pháp đã chỉnh lí: Trametes versicolor
'Vân Chỉ là một loài nắm lớn thuộc phân lop Basidiomycetes gdm 22 000 loài đã
biết Nam 'Vân Chỉ gây hoại sinh cây bệnh, cư trú trên gỗ đã chết, thuộc loại nắm gây
há hủy đồng thời tất cả các cấu tử gỗ (hemicellulose, cellulose, lignin), giúp phá vỡ các gốc cây già, cây chết, vì thế chất dinh dưỡng của cây sẽ trở về đất dé tái sử dụng [1] [26] 1.1.2 Đặc điểm sinh học Van Chỉ là loại nắm hàng năm, trưởng thành dạng qua thé, cha da, hóa gỗ,
không cuống Mặt trên tán phủ lông dày, mịn, rất dễ biến đổi về mặt màu sắc Đảm quả khi non đạng u lồi tròn, sau phân hóa thành dạng bán cầu, khi giả đảm quả có dạng thận, dạng quạt, thót dần lại ở phần gốc hay cũng có khi trải sát giá thể hay trải cuộn lại thành dạng vành với mép tán màu trắng - trắng kem [14] Nắm thường mọc thành
tán dạng ngói lợp Mặt tán dễ thay đôi về màu sắc, đặc trưng bởi những vòng đồng tâm với màu sắc khác nhau, màu sắc từ trắng đến vàng nhạt, nâu nhạt, nâu rỉ có sắc thái
xanh đến đen
Trang 16lên của virus HIV trong tế bào, hạn chế phần nào sự phá hỏng hệ thống miễn dịch do
virus HIV gay ra, gay ức chế enzyme phiên mã ngược Do dé PSK đã góp phần ngăn
chặn giai đoạn nhiễm HIV dương tính sang giai đoạn mắc bệnh AIDS, và kéo dài thời gian sống cho những bệnh nhân này
- PSK cing có tính kháng sinh mạnh, hiệu quả trên Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Cryptococcus neoformans, Psedomonas aeruginosa, Candida albicans và một số loại vi trùng khác gây bệnh ở người
Ngoài ra, nắm Vân Chỉ sản xuất ra các enzyme phá gỗ như: laccaza, mangan peroxidaze (MnP), lignin peroxidaze (LnP) Các enzyme này đang được nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực tẩy trắng bột cellulose [10]
1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nắm Vân Chỉ
Trong quá trình sinh tưởng, phát triển nắm Vân Chỉ chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố Các tác nhân ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của Vân Chỉ gồm các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, độ âm, ánh sáng, độ pH, nồng độ CO; và tốc độ gió cũng như vai trò của các vi sinh vật khác cùng chung sống trong hệ sinh thái; các chất dinh dưỡng cần thiết; vai trò điều khiển của cac hoocmon, sự hiện diện và hoạt động đóng mở của các gen thông qua hệ thông tin chuyên hóa cũng như các chất trao đổi trong quá trình trao đổi chất ở nắm [§]
1.3.1 Nguén cơ chất
Nguyên liệu lúa mì rơm, rom ra, min cưa, dăm gỗ, bã mía, vỏ hạt, bông, thân lõi ngô, cám gạo, cám lúa mì chứa nhiều lignocellulose được sử dụng nhiều nhất cho
việc sản xuất các loại nắm ăn và nấm dược liệu (Kirbag và Akyuz, 2008b; Rodriguez
và Royse, 2008; Saber và cộng sự, 2010) 1.3.2 Các chất dinh dưỡng
Trong tự nhiên nắm sinh trưởng trên các loại phế thải có nguồn gốc thực vật,
nấm có khả năng phân hủy các chất hữu cơ Đa số nắm ăn là sinh vật dị dưỡng nên cần
được cung cấp carbon và nitơ a Nguén carbon
Khoảng một nửa trọng lượng khô tế bảo nấm được tao thanh tir carbon Nam dai
hỏi một lượng lớn carbon, nhiều hơn bắt cứ nguyên tố nào khác, nguồn carbon thích hợp cho sợi nấm phát triển gồm các monosaccharide, oligosaccharide và polysaccharide Nắm có sự phân việt khác nhau rất lớn trong khả năng sử dụng các
nguồn carbon khac nhau [8]
Nguồn carbon thường là muối carbonat, muối của các acid hữu cơ; cenllulose,
Trang 17kích thích tăng trưởng hệ sợi [43] b Nguôn nito
Nitrogen là yêu cầu cơ bản trong môi trường sợi nắm sinh trưởng, nó cần thiết
cho sự tổng hợp các axit amin, tông hợp protein là những nguyên liệu cần thiết đòi hỏi cho việc tạo thành tế bảo chất Không có protein, sự sinh trưởng khơng diễn ra [§]
Nguồn nitrogen thường là pepton, nước luộc ngũ cốc, bột đậu tương, cao nắm
men (NH,);SO¿, asparagine, alanine, glycin Cao nắm men là nguồn nitơ tốt nhất để
kích thích tăng trưởng hệ sợi nắm [43]
Xu và Yun (2003) chứng minh rằng, cao nắm men ở mức 1% là nguồn đạm hiệu
quả nhất cho SK sợi nắm Auricularia polytricha Mendany (2011) cho ring, cao nam men ở mức 0,4% là nguồn đạm thích hợp cho SK sợi nắm Lentinus edodes
e Vitamin
Yêu cầu vitamin cho giai đoạn sinh trưởng của quả thể cao hơn giai đoạn sinh trưởng của sợi nấm Vitamin có hoạt tính xúc tác và chức năng của nó như một
coenzyme Moi co thé dé can vitamin, nhưng khả năng tông hợp khác xa nhau Hàng
loạt nắm có khả năng tạo nên vitamin trên những môi trường đơn giản, tuy vậy một số khác đòi hỏi phải cung cấp vitamin vào môi trường để sự sinh trưởng diễn ra bình thường Những vitamin cần cho sự sinh trưởng và hình thành quả thể của nấm là vitamin BI, B2, B6, B12, vitamin K [8]
Ngoài ra, trong môi trường nuôi cấy sợi các nguyên tố khoáng là khơng thẻ thiếu Những muối khống quan trọng nhất bao gé1
photpho, canxi, lưu huỳnh, kali, magie, silie các nguyên tố này nhìn chung được hấp thụ dưới dạng vô cơ [8]
1.3.3 Các yếu tố môi trường
Cùng với việc cung cáp đầy đủ các chất dinh dưỡng, nắm muốn sinh trưởng tốt phải được nuôi trong điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, pH, ánh sáng phù hợp nhất Sinh trưởng của nắm Vân Chi gồm 2 giai đoạn: giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng và giai đoạn phát
triển hình thành quả thê nắm Giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng hình thành các sợi nắm
phân nhánh dạng sợi gọi là hệ sợi nắm Sau khi hệ sợi nắm trưởng thành, gặp các điều kiện thuận lợi kích thích sự hình thành của mầm quả thể, đó là giai đoạn hình thành cơ quan sinh bào tử Sự hình thành mầm quả có thể được kích hoạt bởi những cú sốc môi
trưởng như tiếp xúc với ánh sáng, tăng nông độ oxy và sốc nhiệt độ [33] a Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, do đó ảnh hưởng đến trao đổi chất
và sinh trưởng của nắm Nhiệt độ tối thích cho sự sinh trưởng của hệ sợi nắm Vân Chỉ
Trang 18nắm mỏng, nhiều sâu bệnh Ngược lại, nhiệt độ thấp, nắm phát triển chậm, cuống nắm ngắn, mũ nắm dày [8]
b Độ ẩm
Nước là chất hòa tan các chất dinh dưỡng cần thiết cho đời sống của nấm nói chung và nắm Vân Chi nói riêng Hàm lượng nước trong nguyên liệu nuôi trồng chiếm 50%-75%, nếu nguyên liệu khô quá sẽ ảnh hưởng đến sinh trưởng của hệ sợi nắm, dẫn đến ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng nắm
Phan lớn nắm yêu cầu độ ẩm cao, độ âm nguyên liệu từ độ ẩm giá thể khoảng 6Š- 70%, là điều kiện tối ưu cho nắm sinh trưởng và phát triển [8] Giai đoạn nuôi sợi nắm 'Vân Chỉ đòi hỏi độ âm không khí từ 70-75% Đề hình thành mầm qua thé nam can 46 ấm cao từ 95-100%, những khi nấm gắn trưởng thảnh thì độ âm thấp hơn khoảng §5- 90% (Wang, 2006)
cpH
pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng của nắm, do pH ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, đến khả năng hòa tan các hợp chất Sinh khối sợi nắm Vân Chỉ đạt cao nhất khi nuôi cấy trong môi trường pH=6 (Sukumar và Cộng sự, 2008)
d Anh séng
Giai đoạn sinh trưởng dinh dưỡng ánh sáng dường như có ảnh hưởng không tốt đến sự sinh trưởng của hầu hết các loài nám Ánh sáng ảnh hưởng tới màu sắc và hình
dạng quả thê, đặc biệt ánh sáng làm thay đổi rõ rệt màu của quả thể nắm Vân Chi Ánh
sáng còn cần thiết cho sự phát triển mũ của nắm, khi chuyên chúng vào bóng tối thì
kích thích sự hình thành cuống nắm mà không kích thích hình thành mũ nắm [8]
e Không khí
Nắm là sinh vật hiểu khí, sử dụng oxi, nhả khí cacbonic Thành phần của không
khí, đặc biệt là nồng độ cacbonic có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng của nắm, Nồng
độ cacbonic từ 0,4-0,6% sẽ ức chế hoàn toàn sự hình thành nắm quả thẻ, khi nồng độ cacbonic từ 0,2-0,4% sẽ làm quả thé có chân dài, mũ mỏng Nồng độ khí cacbonic
thích hợp nhất cho giai đoạn ra quả thể dưới 0,2% [8] 1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nắm
1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
ăn Theo Liu và cộng sự (2010), phương pháp nuôi cấy truyền thống, giống
và nấm dược liệu đã được sản xuất trong các môi trường rắn sử dụng nguyên liệu tổng hợp có chứa nhiều lignocellulose, qua trình này thường kéo dài 2 -3 tháng, để sản xuất
ra đến quả thể Nuôi cấy trong môi trường dịch thể khác hẳn với nuôi cấy trên các cơ
chất rắn vì nó đưa đết năng sản xuất giống nắm cao hơn trong một thời gian ngắn
Trang 19i
Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng, sợi nắm sinh trưởng trong môi trường dịch thể là phương pháp thay thế nhanh chóng đề thu sinh khối sợi nắm với chất lượng
phù hợp hơn Nắm Vân Chỉ được sản xuất thương mại từ quả thê hoặc sợi nắm trong
trên hợp chất rắn [75] và sinh khối nắm trong lên men dịch thể [70] Phương pháp lên
men tang sau (nhân giống dạng dịch thể) được ứng dụng đề sản xuất nhiều loại nấm ăn
im dược liệu [46], [53] Hi
triển ở nhiều nước trên thế giới, đã có nhi:
và ên nay công nghệ nhân giống nắm dịch thể đã phát
công trình nghiên cứu đưa ra thành phần
dinh dưỡng bổ sung tối ưu, tốc độ sục khí, ảnh hưởng cả pH môi trường đến sinh trưởng của hệ sợi, thuận lợi, khó khăn của việc nhân giống nắm dịch thể
Kawai và cộng sự (1995) đã tiến hành nghiên cứu thời gian hình thành quả thể nắm hương (Eentinus edodes) khi sử dụng giống dịch thể Kết quả khi sử dụng giống dịch thể để rút ngắn được thời gian ươm bịch và thời gian hình thành qua thé tir 120 ngày xuống còn 90 ngày [48] Kỹ thuật lên men lỏng đã được phát triển cho một loạt các loại nắm và sử dụng nuôi cấy sợi nấm cho các ứng dụng khác nhau: ứng dụng nuôi
cấy lỏng sau đó cấy trên nguyên liệu nuôi trồng là chất rắn để thu quả thê nấm và sinh khối sợi Nu gọn, thời gian ngắn hơn và có ít cơ hội nhiễm :ấy lỏng cho khả năng sản xuất sinh khối cao trong một không gian nhỏ
Các nước trên thế giới đã tập trung nghiên cứu về nắm Vân Chỉ từ rất lâu bởi công dụng tuyệt vời của loài nắm này, song hẳu hết tập trung sâu vào nuôi cấy dịch thể để thu sinh khối sợi và tách chiết các hoạt chất sinh học Việc nuôi trồng thu quả thể ở loài nấm này rất ít nghiên cứu, kết quả nghiên cứu ở Mexico đã ghi nhận tốc độ sinh
trưởng của hệ sợi trong môi trường PDA (potato, dextro, agar) đạt 64 mm/7 ngày,
tương đương với 380,9 um/h Tất cả các nguồn cacbon hầu hết đều thích hợp đề sợi
nắm sinh trưởng, khi sử dụng cùng hàm lượng 1% fructose cho sinh khéi dat 5,41 g/l, bé sung glucose dat 5,54 g/l, bd sung mannitol dat 5,41 g/l, bd sung glucose dat 5,54 g/l, b sung mannitol dat 5,53 g/l, bé sung lactose cho thap nhat 1,47 g/l [69] Nghién
cứu ở Án Độ trên một chủng nam Vân Chỉ đã chỉ ra rằng sinh khói sợi nắm Vân Chỉ
Trang 20khi cấy lượng giống 70 mgil, thì thu được 91% các viên có đường kính lớn hơn l,6 mm [38]
Nam 1989, Xưởng Đông dược Thượng Hải nuôi trồng nắm Vân Chỉ từ bã mía và
chiết xuất ra polysaccharides đề tạo thành thuốc Vân Chi khuẩn dùng để điều trị bệnh viêm gan B mãn tính Công trình nghiên cứu sản xuất nắm Vân Chỉ thương mại từ quả thể hoặc sợi nắm trồng trên hợp chất rắn được thực hiện bởi Yadav và Tripathi vào năm 1991 và Park cùng các công sự vào năm 1994 Năm 1993 các nhà sinh học ở Đại học Sư phạm Thượng Hải đã dùng phương pháp nuôi cấy chìm để thu nhận sợi nắm Van Chi và phối hợp với Xí nghiệp Dược phẩm Tân Khang dé sản xuất ra thuốc Polysaccharopeptide PSP ứng dụng trong lâm sàng, phối hợp với các biện pháp phẫu thuật hoặc hóa trị để điều trị ung thư phổi, ung thư đường tiêu hóa và ung thư vú Năm 1981, Viện nghiên cứu kháng sinh Tứ Xuyên đã dùng sản phẩm nuôi cấy chìm sợi nắm Vân Chỉ để chiết xuất polysaccharides nội bào và ngoại bảo và phối hợp với Xí nghiệp Dược phẩm Trùng Khánh đề sản xuất ra thuốc Vân Tỉnh dùng để điều trị viêm
gan do virut HBV và ung thư gan nguyên phát, đã đạt được hiệu quả tốt
1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở nước ta, có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của nắm Vân Chỉ được tiến hành Theo giáo sư Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Thu Hằng, công bố đây là loại nắm dược liệu quý hiện đã được sử dụng tại Trung Quốc từ cách đây trên 2000 năm và hiện nay đã có thể nuôi trồng thành công với kỹ thuật đơn giản tại Việt Nam Giống gốc hiện được lưu trữ tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội cho thay nam Vân Chi một loại nắm có ham lượng Beta Glucan cao có cả tác dụng ức ché HIV [16]
Trung tâm nghiên cứu phát triển Nắm và sản phẩm sinh học - Công ty trách
nhiệm hữu hạn Nấm linh chỉ đã đi tiên phong trong nghiên cứu về nấm ăn và nắm dược liệu ở Việt Nam Công ty đã sản xuất thành công nhiều sản phẩm có tác dụng phòng chữa bệnh như sản phẩm Sinh linh (bột sinh khối nấm linh chỉ), các sản phẩm
từ bào tử nấm linh chỉ Nắm Vân Chi, nấm đầu khi, nắm mặt trời cũng là một trong những loại nắm dược liệu mà công ty đã nghiên cứu khép kín từ qui mô nhân giống đến các sản phẩm thuốc có giá trị tăng cường sức khỏe
Trang 21
13
[1] Trung tam nghiên cứu Công nghệ sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội đang xây dựng phân xưởng lên men với các nồi lên men có điều khiển tự động đề triển khai hướng nghiên cứu tách chiết được phẩm từ sinh khối nắm Vân Chỉ
Không chỉ công trình nghiên cứu vẻ tác dụng của nấm Van Chi mà còn có các công trình nghiên cứu quy trình sản xuất nắm và các sản phẩm có nguồn gốc từ nắm 'Vân Chỉ Hàng loạt các công ty trong đó có công ty TNHH Nắm linh chỉ đã nghiên cứu qui trình sản xuất các sản phẩm từ nắm Vân Chỉ, có 2 dạng sản phẩm chính từ nắm Vân Chỉ đó là bột sinh khối sợi và quả thể nắm Vân Chỉ Hiện tại, hàng năm công ty đã cung cấp cho thị trường khoảng 10 tấn sinh khối nấm và 2-3 tấn quả thể/năm Nguyên liệu sử dụng nuôi trồng nắm Vân Chi là mùn cưa có bổ sung dinh dưỡng, nhiệt độ thích hợp nhất để quả thể nắm sinh trưởng phát triển từ 20 — 25°C, qua thé sinh trưởng thích hợp nhất vào tháng 2 đến tháng 5 dương lịch [1]
Lê TI
có nguồn gốc Trung Quốc Sau đó thử nghiệm trên môi trường lỏng cho kết quả thu
được nấm Vân Chỉ sinh trưởng tốt nhất trên môi trường 20 g bột đậu tương; 20 g
dudng kinh; 2,5 g (NH4):SO4; 2 g CaCOs; 1 g MgSOa; sinh khéi dat 16,68 g/l Tac gia cũng nghỉ loàng Yến và cộng sự (2003) đã phân lập giống nắm từ quả thẻ Vân Chỉ cứu khả năng sinh trưởng của nắm Vân Chỉ trên môi trường xốp, kết quả
chỉ ra nắm Vân Chỉ sinh trưởng tốt trên môi trường 80 g bã rượu; 18 g cám gạo; Ì g thạch cao; Ig CaCO;, sau 10 ngày hệ sợi Vân Chỉ đã sinh trưởng kín bình nguyên liệu, nhanh hơn so với môi trường khác từ 1- 10 ngày [17] Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Thùy cho thấy sinh trưởng của sợi nắm Vân Chỉ trên môi trường PDA cải tiến, nhiệt độ thích hợp là 30C, với pH tối ưu là 6,5 và tốc độ lắc là 140 vòng/phút sẽ thu được sinh khối cao nhất [17] Nghiên cứu của Lê Xuân Thám cho thấy sợi nắm 'Vân Chỉ trên môi trường dịch thể cần các nguyên tổ Kali, photpho Trong đó, Nồng độ Kali tối ưu cho sự phát triển to nim Trametes versicolor li 3°/oo, Nong 46 Photpho thích hợp nhất cho sự tăng sinh khối của Trametes versicolor li 1°/oo[14]
Theo nghiên cứu của Lê Võ Định Tường, phân viện hóa học các hợp chất thiên nhiên - Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, qua thời gian nghiên cứu đã bước đầu thành công với việc nghiên cứu trồng nám Vân Chi trên mùn cưa cây cao su dùng chế các thuốc phòng chống ung bướu, viêm gan và một số bệnh khác, từ một số giống nắm Vân Chi nhập từ Nhật Bản, Trung Quốc và giống nấm hoang đã ở Việt Nam Môi trường nhân giống và giữ giống và nuôi trồng nắm Vân Chỉ được áp dung là môi trường thạch khoai tây có bỏ sung giá đỗ và địch chiết nấm men trong ống nghiệm có đường kính 2,2 cm được dùng để nhân gid
Trang 22lít Tiệt trùng 121°C trong 2 giờ
Trong nghiên cứu khác tác giả đã nuôi trồng nắm Vân Chỉ thành công chủng du nhập từ Nhật Bản trên giá thể là mùn cưa cao su đạt năng xuất S1,5g khô/ bịch phôi (1200g) Sợi giống nắm Vân Chi này phát triển tốt trên môi trường gạo lứt có bổ sung bột của một số loại đậu trong điều kiện khí hậu thành phó Hồ Chí Minh Kết quả này mở ra khả năng có thể nuôi trồng nắm Vân Chỉ trên mùn cưa cây cao su ở quy mô công nghiệp phục vụ cho sản xuất thuốc phòng chống ung bướu từ loài nắm nỗi tiếng này Thành công này là bước đầu mở ra khả năng tự sản xuất các thuốc phòng chống ung bướu, viêm gan và một số bệnh khác từ loài nắm Vân Chỉ ở Việt Nam Trên cơ sở thử nghiệm môi trường cơ chất mùn cưa cao su đã xử lý, tạo âm và phối trộn một số thành phần phụ gia (ngô nghiền: 5%, cám gạo: 5%, bột nhẹ 1,5% và đường kính: 0,5%), Trung tâm công nghệ sinh học Đà Nẵng đã nuôi trồng thành công nắm Vân Chi
én lan trồng (nhiệt độ: 30+2°C; âm độ: >80%)
Nhìn chung, ở nước ta có một số nhà khoa học tập trung nghiên cứu sâu về nắm
dược liệu (nắm linh chi, hắc chỉ, Vân Chi, nắm đầu khi, đông trùng hạ thảo, ), việc
nuôi trồng nắm đề thu quả thể chủ yếu sử dụng nguồn giống thê rắn nên cho thời gian thương phẩm trong điều
Trang 2315
CHUONG 2
DOI TUQNG, PHAM VI, NOI DUNG VA PHUONG PHAP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu là nấm Vân Chỉ (Trametes versicolor) thudc ho
Polyporaceae, chỉ Trametes (Hình 2.1)
= Str dung giống cấp 2 nám Van Chi được cung cấp từ Phòng Công nghệ sinh học, khoa Sinh ~ Môi trường, Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng Hình 2.2: Nắm Vân Chỉ giống cấp 2 trong môi trường nuôi cấy lỏng 2.2 Phạm vi nghiên cứu ~ Đề tài tiến hành nghiên cứu trong thời gian 10 tháng từ tháng 1 đến tháng 10/2018
~ Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của sợi nắm để sản xuất giống nắm lỏng tại phòng Công nghệ sinh học, khoa Sinh - Môi trường, Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng
~ Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và chất lượng của nắm Vân Chỉ trồng tại 3 địa điểm: Hòa Vang, Ngũ Hành Sơn và Sơn Trà, Đà
Trang 242.3 Nội dung nghiên cứu
~ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự sinh trưởng của sợi
của nắm Vân Chị, tạo giống nắm dạng lỏng
~ Khảo sát và chọn được các địa điểm phù hợp để trồng thử nghiệm nắm Vân Chi tại Đà Nẵng
~ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số nhân tố sinh thái đến sinh trưởng và phát triển của nám Vân Chỉ nuôi trồng tại Đà Ning
~ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số nhân tổ sinh thái đến chất lượng nắm Vân Chỉ nuôi trồng tại Đà Nẵng
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp điều tra và khảo sát
Tiến hành khảo sát thực tế tại khu vực nghiên cứu, kết hợp với phỏng vấn chuyên gia và các nhà vườn về đối tượng nghiên cứu Điều tra, thu thập số liệu từ các nguồn tài liệu về khí hậu của thành phố Đà Nẵng từ tháng 4 đến tháng 7 năm 2018
3.4.2 Các phương pháp nhân giống nắm Vân Chỉ trong phòng thí nghiệm a Phương pháp xác định ảnh hưởng của môi trường nghiên cứu đến sinh
trưởng của sợi nắm
Các môi trường thí nghiệm là môi trường lỏng không có agar: + Môi trường bán tổng hop (BTH)
+ Môi trường Czapek + Môi trường Raper + Môi trường Agricus + Môi trường PG cải tiến
Khoai tây rửa sạch, đun sối trong nước cất khoảng 15 phút lọc lất phần nước trong (nước chiết khoai tây) Bổ sung các thành phần khác như glucose, cao nắm men vào nước chiết khoai tây theo công thức của từng môi trường Sau đó điều chỉnh pH của môi trường bằng dung dịch NaOH và HCI đạt pH=6
Cho 50 ml môi trường vào chai thủy tỉnh cùng đường kính, hấp khử trùng bằng ấy giống từ môi trường thạch, mỗi chai cấy 1 miếng thạch 0,5 cmỶ cắt từ ống nghiệm giống cấp 1 Ủ ở nhiệt độ hơi nước nóng ở I2I°C trong 30 phút Để nguội một ngày,
phòng, tiến hành thu và cân sinh khối sau 15 ngày Sinh khối tươi được sáy đến khô ở nhiệt độ 50°C và tiến hành cân khối lượng khô Xử lý số liệu để chọn ra môi trường
tạo sinh khối nhiều nhất
Mỗi môi trường thực hiện 10 bình Tổng số chai cấy là 50 chai
Trang 2517
sợi nấm
Tiến hành điều chỉnh môi trường về các pH khác nhau: 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7: 7,5;
8, Điều chỉnh pH acid dung dịch HCI 0,IN và pH kiềm dung dịch NaOH 0,1N Khử trùng môi trường 121°C/30 phút Sau 24h, cấy giống từ môi trường thạch, mỗi chai cấy 1 miếng thạch 0,5 cmỶ cắt từ ống nghiệm giống cấp 1 Ủ ở nhiệt độ phòng, tiến hành thu và cân sinh khối sau 15 ngày Sinh kh
50°C và tiến hành cân khói lượng khô Thí nghiệm được lặp lại 3 lần tươi được sấy đến khô ở nhiệt độ
Thí nghiệm được thực hiện với 8 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 10 chai Tổng số chai cấy là 80 chai
e Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của sợi nắm
Môi trường và pH sử dụng là môi trường và pH đạt hiệu quả cao nhất từ khảo sát
trên
Tiến hành khử trùng môi trường 121°C/30 phút Sau 24 giờ, cấy giống từ môi
trường thạch, mỗi chai cấy I \g thạch 0,5 cm” cắt từ ng nghiệm gióng cấp 1 Nuôi
ở 2 mức nhiệt độ là 22°C và 30°C, tiến hành thu và cân sinh khối sau 15 ngày Sinh
khối tươi được sấy đến khô ở nhiệt độ 50°C và tiến hành cân khối lượng khô Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
Thí nghiệm được thực hiện với 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 10 chai Tổng số chai cấy là 20 chai
2.4.3 Các phương pháp nuôi trồng nắm Vân Chỉ trong tự nhiên tại thành phố Đà Nẵng
* Xử lý các nguyên liệu chính sử dụng trong nuôi
~ Mùn cưa cao su được làm âm bằng nước vôi 1%, ủ 3 — 5 ngày, đảo đống ủ, ủ
tông nắm Vân Chỉ
tiếp 3 5 ngày Độ âm của mùn cưa sau khi ủ đạt 65 - 67%, mùn cưa đã được xử lý tiến hành phối trộn phụ gia theo công thức thí nghiệm
~ Bông phế loại: làm ẩm đều bằng nước vôi 1%, ủ lại trong vòng 24-36 giờ, xé tơi, đảo đều, ủ lại 24 giờ
~ Đóng túi 17 x 35 em, mỗi bịch nguyên liệu nặng 1 kg Mỗi môi trường bố trí 10 bịch nguyên liệu Khử trùng bằng nồi hấp áp lực trong 24 giờ Sau khi hap dé bich nguội I ngày rồi cấy giống ở thể rắn với một lượng như nhau vào mỗi bịch Bịch nắm
cấy giống xong được nuôi trong phòng ở điều kiện tối, nhiét 46 25 — 30°C
* Cây giống
Trang 26
nuôi ủ tơ, thường xuyên vệ sinh sạch sẽ phòng cấy giống * Vom soi va rach bich
Chuan bi khu vực ươm: Nhà ươm túi phải đảm bảo các u cầu: sạch sẽ, thơng
thống, độ ẩm từ 75-85%, ánh sáng yếu, nhiệt độ từ 20-30°C
Ươm sợi: Chuyển nhẹ nhàng vào nhà ươm và đặt trên các giàn giá miệng túi lên phía trên hoặc treo bịch sao cho miệng túi quay ngang Khoảng cách giữa các túi từ 2- 3em Giữa các giàn luống có lối đi để đi kiểm tra Trong thời gian ươm không được tưới nước, hạn chế tối đa việc vận chuyển Trong quá trình sợi nắm phát triển, nếu thấy có túi bị nhiễm cần loại bỏ ngay khỏi khi vực ươm trồng Khi hệ sợi nắm lan kín đáy bịch, chuyển nắm sang nhà trồng, tháo nút bông hoặc rạch bịch phôi (tại 3-4 vị trí so le
nhau, chiều dài đường rạch khoảng 4-5cm)
* Chăm sóc, thu hoạch
Sau khi tơ nắm lan lại các vị trí rạch thì tiến hành tưới phun sương để duy trì độ ấm từ 80-90% Nhiệt độ thích hợp dé nam ra qua thé tir 17-20°C, ánh sáng tán xạ từ
mọi phía Sau khi quả thê trưởng thành (quả thê có kích thước nhất định, ngả sang màu vàng) thì tiến hành thu hái bằng cách nắm chặt tai nắm và nhỏ ra từ từ Quả thẻ nắm
sau thu hoạch có thê được sắy khô ở 50-60°C đề thuận lợi cho quá trình bảo quản a Phương pháp xác định ảnh hướng của nguằn nguyên liệu đến sinh trưởng của
nắm Vân Chỉ
Các cơ chất được dùng dé tiến hành thí nghiệm bao gồm:
~CT 1: 88% mùn cưa + 5% cám gạo + 5% cám bắp + 1% saccharose + 1% CaCOs ~ CT 2: 88% mùn cưa + 10% cám gạo + 1% saccharose + 1% CaCOs
~ CT 3: 88% mùn cưa + 10% cám bắp + 1% saccharose + 1% CaCOs
~ CT4: 78% mùn cưa + 10% cám gạo + 10% cám bắp + 1% saccharose + 1% CaCO,, = CT 5: 83% mùn cưa + 15% cám gạo + 1% saccharose + 1% CaCO;
~ CT 6: 83% mùn cưa + 15% cám bắp + 1% saccharose + 1% CaCOs ~ CT7: 78% mùn cưa + 20% cám gạo + 1% saccharose + 1% CaCO;
~CT 8: 68% mùn cưa + 15% cám gạo + 15% cám bắp + 1% saccharose + 1% CaCO,, - CT 9: 78% mùn cưa + 20% cám bắp + 1% saccharose + 1% CaCOs
~CT 10: 73% mùn cưa + 25% cám gạo + 1% saccharose + 1% CaCO; ~CT 11: 73% mùn cưa + 25% cám bắp + 1% saccharose + 1% CaCO,,
Trang 2719
b Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm đến sinh trưởng, phát
triển của nắm Van Chi
Công thức nguyên liệu sử dụng là công thức đạt hiệu quả cao nhất trong khảo sát ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu đến sinh trưởng của nám Vân chỉ
“Thí nghiệm được thực hiện tại 3 khu vực nuôi trồng, mỗi khu vực tiến hành thí nghiệm trên 150 bịch phôi nắm Tổng số bịch phôi nắm sử dụng là 450 bịch
Theo doi diễn biến khí hậu thời tiết tại khu vực trồng: Theo dõi bằng nhiệt kế, âm kế suốt thời gian sinh trưởng phát triển của nắm
+ Mỗi ngày theo dõi, ghi số liệu tại 3 thời điểm: sáng, chiều, tối Sau đó tính số liệu trung bình trong ngày
+ Mỗi tháng theo dõi 30 ngày và tính số liệu trong bình trong tháng Theo dõi
Các bịch nắm được chăm sóc tai các khu vực nghiên cứu theo dõi về các chỉ tiêu
trưởng phát triển của nắm Vân Chỉ trên nguyên liệu trồng
~_Thời gian phủ kín nguyên liệu (ngày): là thời gian được tính từ khi bắt đầu cấy giống đến khi sợi nắm phủ trắng hết bịch nguyên liệu
~ Thời gian hình thành mầm mống quả thể (ngày): là thời gian được tính từ khi
cấy giống đến khi xuất hiện chân nắm đầu tiên
~ Thời gian quả thê trưởng thành (ngày): là thời gian được tính từ khi cấy giống đến khi quả thể trưởng thành, chuyển sang màu vàng, có thể thu hoạch
~ Tốc độ của sợi nắm được tính theo công thức sau: V= D/T
+ V: Tốc độ mọc của hệ sợi (mm/ngày)
+ D: Chiều dài bịch nguyên liệu sợi sinh trưởng kín trắng (mm) +: Thời gian hệ sợi nắm mọc trên bề mặt môi trường (ngày)
= Tỷ lệ nhiễm bệnh (9%) Š „ng số bịch phôi nấm ”etrhễm nứt v00,
“Theo dõi các chỉ tiêu quyết định năng suất, hình thái của nắm Vân Chi
~ Khối lượng quả thê (gram/bịch) ~ Kích thước dọc mũ nắm (mm) ~ Kích thước ngang mũ nam (mm)
Xử lí số liệu để tìm ra khu vực thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của nắm Van Chi
2.4.4 Phuong pháp định lượng các hợp chất và xác định hoạt tính sinh học trong nắm Vân Chỉ nuôi trằng tại Đà Nẵng
Trang 28a Phương pháp xic dinh ham heong polysaccharides
Polysaccharides cé nhiéu dang và nhiều qui trình chiết khác nhau Chiết PS ở 100°C trong 16 giờ, cho năng suất ly trích cao, nhưng làm biến đổi cấu trúc sinh học các polysaccharides có trong nam Van Chỉ Qui trình chiết xuất polysaccharides từ
nắm Vân Chi (Yihuai gao và cộng sự, 2001)
Tiến hành thí nghiệm: Quả thê Van Chi thái mỏng đã sấy khô đem ngâm nước ở 70°C trong 3 giờ, tiến hành chiết thu được dịch chiết lần 1 và bã chiết lần 1
Lặp lại quá trình ngâm và chiết với bã chiết lần 1 ta thu được dịch chiết và bã chiết lần
2 Bã chiết lần 2 ngâm với cồn 80% ở 70°C trong hai giờ thu được dịch chiết lần 3 Thu nhận được 3 dịch chiết và lọc Thu phần cặn và bổ sung vào 3 ml nước cắt và 1 ml phenol Hỗn hợp được bổ sung 5 mI dung dịch H;SO, đậm đặc và đun nóng tại 40°C
trong 30 phút, sau đó đem mẫu đề nguội ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, tiến hành so
màu tại bước sóng 492 nm Làm mẫu đối chứng tương tự, dùng 3 ml nước cất thay mẫu Từ hiệu số giá trị OD (A= 485 nm) giữa dịch mẫu và đ
lượng polysaccharides có trong mẫu bằng cách so sánh với giá trị OD (2 = 485 nm) chứng sẽ tính được hàm của glucose (4-§ mg/ml) được dùng làm chất chuân
b Phương pháp xác định hàm lượng PSP thô có trong quả thể nắm lân Chỉ Hàm lượng PSP thô được xác định bằng phương pháp của Ueno S và cộng sự
: Mẫu nắm được đem đi ngâm nước nóng ở nhiệt độ 80°C — 98°C trong 2h-3h Sau đó đem đi làm lạnh và lọc, bã được đem đi chiết bằng nước nóng như trên để có thể chiết ết lượng PSP có trong quả thể nấm Dịch đem đi cô quay cho bay bớt hơi nước, sau đó tiến hành tủa PSP bang cén 70°, tiến hành lọc và thu tủa, đem đi sấy trong vòng 24 giờ ở 50°C và cân trọng lượng Từ đó đánh giá được hàm lượng PSP có trong quả thể nắm Vân Chỉ
e Phương pháp xác định hàm lượng khác trong hệ sợi nắm Vân Chỉ
~ Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Biure ~ Định lượng vitamin B, bằng phương pháp huỳnh quang
4 Phương pháp xác định khả năng kháng oxi hóa của nắm lân Chỉ
Sử dụng phương pháp Reducing power đề kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa: lần
lượt lấy (50 -500 ng) bột chiết pha trong | ml nude cat, 2 ml dung dich ethanol 96%, 2
Trang 2921
Đo độ hấp thụ của dung dịch trên với thiết bị UV-Vis ở bước sóng 700 nm Thực hiện
tương tự với mẫu kiểm chứng
Công thức tính chỉ số chống oxy hóa:
— Rsample Reontrol
AAI: chỉ số chống oxy hóa
Rsample: mật độ quang của mẫu Rcontrol: mật độ qua mẫu kiểm chứng
e Phương pháp xác định hoạt tinh kháng khuẩn của dịch chiết nắm lân Chỉ
Chuan bi dich vi khuan (Escherichia coli): Cay ria tạo khuẩn lạc trên môi trường
thạch LB, vi khuẩn được tồn trữ trong ống thạch nghiêng và bảo quản lạnh ở 4°C Từ ống tồn trữ, chọn 2-3 khuẩn lạc đưa vào bình tam giác chứa 10ml môi trường LB đã khử trùng, nuôi cấy lắc ở 37°C trong 16-18h
Tiến hành: Dùng micropipet hút 100gl dịch vi khuẩn (mật độ tế bảo 10% CFU/ml), sau đó chang đều trên mặt đĩa thạch (50ml môi trường LB/ đĩa thạch) đã khô ổn định, chờ khô bề mặt Sau đó tiến hành cho dich cl
đục lỗ sau khi cấy vi khuẩn Chuyển các đĩa petri vào tủ lạnh khoảng 4 - 8h dé dich
chiết nắm khuếch tán ra thạch Sau đó đem nuôi ở 37°C trong 16 - 18h Đọc kết quả và
ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn (D-d) được xác định bằng đường kính vòng ngoài trừ đi đường kính lỗ thạch (em)
2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu
ìm đầy giếng thạch đã được
Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần Số liệu được xử lí thống kê theo
Trang 30CHUONG 3
KET QUA NGHIEN CUU VA THAO LUAN
3.1 Ảnh hưởng của một số nhân tố môi trường đến sự sinh trưởng sinh khối sợi
nắm Vân Chỉ trong quá trình sản xuất giống
3.1.1 Ảnh hướng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của
sợi nắm Vân Chỉ
Dinh dưỡng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của nắm Trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau, tốc độ tăng trưởng của sợi là khác nhau Nhu cầu dinh dưỡng cho sinh tổng hợp các chất tạo sinh khối sợi phụ thuộc vào mỗi loại nấm và điều kiện nuôi cấy Nguồn dinh dưỡng carbon khác nhau có ảnh hưởng
trực tiếp đến khả năng phân giải và hấp thụ dinh dưỡng của tế bào Nguồn dinh dưỡng nitrogen được sử dụng cho sự tăng trưởng sợi nất là amoniac, muối amoni, axit amin
và nitrogen hữu cơ phức tạp Kết quả thí nghiệm về sự sinh trưởng của sợi nắm Vân Chi trong các môi trường dịch thể có thành phần dinh dưỡng bổ sung khác nhau được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của
sợi nắm Vân Chỉ
Môi trường dinh Khả năng sinh trưởng sinh khối nấm Vân Chỉ Số lượng mẫu
dưỡng nghiên cứu — Khổilượngtưi Khổiượngkh (g/50ml) (g/50m)) 145° 0,07° 10 5,77 0,49" 10 530° 040% 10 Agaricus 5,27 0,40° 10 Czapek 1,04° 0,04° 10 Chú thích: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa
thống kê với độ tin cậy 95%
Trang 3123
các nguồn dinh dưỡng tự nhiên nên sợi nấm phát triển kém, sinh khối thu được rất thấp Sinh khối khô thu được ở hai môi trường này lần lược là 0,07 g va 0,04 g
b)
©) d) e)
Hình 3.1: Sinh trưởng của sợi nắm Vân Chỉ nuôi cấy trên các môi trường
a) Czapek, b) Raper, c) PG cải tién, d) BTH, e) Agaricus
Theo nghiên cứu Bolla và cộng sự (2010) khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy
sinh khối sợi nắm Vân Chỉ nguồn đạm thì sinh khối của sợi nắm là lớn nhất Kết quả
chứng minh casein và cao nắm men là nguồn đạm thích hợp cho sinh khối sợi nắm 'Vân Chỉ sinh trưởng tốt sau 7 ngày nuôi cấy Từ kết quả này cho thấy ở hàm lượng
nhất định thì cao nắm men và pepton là nguồn đạm giúp sinh khối sợi tăng trưởng
dang ké va các nguồn dinh dưỡng bồ sung tự nhiên từ khoai tây cũng cũng rất thích
hợp cho sợi nắm phát triển [32] Nitrogen hữu cơ được sử dụng rộng rãi nhất cho hằu
hết các loại nấm và cho hiệu quả sinh trưởng của sợi nấm trong môi tường dịch thể cao hơn nguồn vô cơ Nghiên cứu khác của Shil và es (2007) va Vladimir (2012) cho rằng nitrogen hữu cơ phù hợp cho sinh trưởng của sợi nắm
Trong nghiên cứu của chúng tôi, môi trường PG cải tiến là môi trường tốt nhất đề
nuôi sợi nắm Vân Chỉ trên môi trường dịch thể
3.1.2 Ảnh hướng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của sợi nắm Vân Chỉ
trong môi trường dịch thể
Trang 32Bố trí thí nghiệm ở hai mức nhiệt độ: 22°C; 30C Kết quả khối lượng của sợi nắm 'Vân Chỉ ở hai mức nhiệt độ được trình bày ở bảng 3.2 như sau:
Bảng 3.2: Ảnh hướng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của sợi nắm Vân Chỉ trong môi trường dịch thể a Son à Nhiệt độ nghiên — Khả năng sinh trưởng của sợi nấm Vân Chỉ `” Trựng mâu nghiên cứu ca Khối lượng tươi (g) ze = Khối lượng khô (g) z = 22°C 4,26 0,36" 10 30°C 5,91" 0,53° 10 Chú ý: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ÿ' nghĩa thẳng kê
với độ tin cậy 95%
4) b)
Hình 3.2: Sinh trưởng của sợi nắm Vân Chỉ nuôi cấy ở nhiệt độ: (a)22°C và (b)3ŒC
Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng sinh hóa bên trong tế bào, kích thích hoạt động của các chất sinh trưởng, các enzyme và chỉ phi toàn bộ hoạt động sống của nắm Nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ thích hợp sẽ làm cho sợi nắm sinh trưởng chậm lại hoặc chết hẳn [3], [15] Trong môi trường dịch thể có nhiệt độ 22°C,
mật độ sợi nắm Vân Chỉ sinh trưởng thấp, chưa ăn hết bề mặt môi trường tại thời điểm
thu sinh KI
mặt môi trường, mật độ sợi dày, sinh khối thu được cao Qua kết quả thực tế cho thấy,
Cũng trong môi trường dịch thể đó ở nhiệt độ 30°C, sợi nắm lan hết bề môi trường nuôi cấy có nhiệt độ 30°C, ta thu được lượng sinh khối cao hơn so với nuôi cấy ở 22°C Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Sukumar và cộng sự
(2008), chỉ ra rằng sợi nắm Vân Chỉ phát triển tốt nhat tai nhiét 46 30°C
3.1.3 Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng của sợi nắm
Vân Chỉ trong môi trường dịch thể
Trang 3325
cấy Độ pH môi trường có ảnh hưởng đến chức năng của màng tế bào, hình thái và cấu trúc tế bào, độ hòa tan của các muối, các ion, sự hấp thụ các chất dinh dưỡng và quá
trình sinh tổng hợp các chất khác nhau Các tế bảo chỉ có thể phát triển trong một
phạm vi pH nhất định và sự hình thành chuyển hóa các chất cũng chịu ảnh hưởng của gid tri pH
Sợi nắm được nuôi cấy trên môi trường PG cải tiến Bồ trí pH ở các mức 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8 Sau 15 ngày tiến hành thu sinh khối Khả năng sinh trưởng của sợi nắm Vân Chỉ thu được trong điều kiện pH môi tường khác nhau được trình bày qua hình 3.4 @ bề -05 8 06 @ š 04 Ễ 03 ã r02 Khối lượng tươi Rw Ro Ol : sSinh khôi khô 0 (g50mD) 4S 5 5S 6 65 7 75 § pH ~#Sinh khối tươi (g/50ml)
Hình 3.3: Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng của sợi nắm Vân Chỉ trong môi trường dịch thể
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi nuôi cấy nắm Vân Chỉ trên môi trường có giá trị pH = 4,5 và pH = 7,5 ta thu được lượng sinh khối thấp Tuy nhiên khi nuôi cấy nắm trong điều kiện pH từ 5 — 7, ta thu được lượng sinh khối là lớn nhất Sinh khối sợi cao nhất thu được khi nuôi cấy trong môi trường có độ pH = 5,5 (0,50 g/50 ml) Khi nuôi cấy ở các giá trị pH = 6, pH = 6,5 va pH =
Trang 34
©) 8 h) i)
Hình 3.4: Sinh trưởng sợi nắm vân chỉ trên các môi trường pH
(a) 4,5; (b) 5; (c) 5,5; (d) 6; (e) 6.5; (g) 7¿ (h) 7,5: () 8
Các nghiên cứu về ảnh hưởng của pH đến sự phát triển sợi nấm trong môi 2009) và Trần Văn Tú (2011) bước đầu đã xác ống (PDA + 10% nhộng tằm) ở pH = 5 - 6 là thích hợp đối với chủng giống nắm Đông trùng hạ thảo [16], [21] Theo báo cáo khác trường ở nước ta của Phạm Quang Thu (
định được thành phần môi trường nhân gị
của Kozhemyakina và cộng sự (2010) chứng minh rằng, nắm kim châm (F.velutipes) có thể phát triển trong một loạt các giá trị pH ban đầu từ 3 đến 7,5 Tuy nhiên sản lượng tối đa của sinh khối sợi nắm đạt được vào giá trị ban đầu của pH = 5 - 6,5 [51] Nghiên cứu ở Ấn Độ trên một chủng nám Vân Chỉ đã chỉ ra rằng, sinh khối sợi nắm
99 g/l và 4,28 g/l Khi môi trường pH = 8 thu được sinh khối sợi là 1,97 g/1, môi trường pH = 9 sinh khối sợi thu được 1,62 g/1 [66]
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, trong môi trường dịch thể sợi nắm Vân Chỉ Vân Chỉ thu được khi môi trường pH = 5 và pH = 6 l
sinh trưởng tốt ở khoảng pH 5 -7 Trong điều kiện pH = 5,5 thì sinh khối sợi nắm Vân
Trang 3527
3.2 Khảo sát các điều kiện sinh thái để xác
Nẵng
Chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện khí hậu tại thành phố Đà Nẵng đề xác
định địa điểm thích hợp cho việc nuôi trồng nắm Vân Chi Kết quả khảo sát điều kiện
khí hậu được trình bày 6 bang 3.3
Băng 3.3: Các yếu tố khí hậu các năm từ 2013 đến 2017 tại thành phé Da Ning Năm 2013 2014 2015 2016 — 2017 h vùng trồng nắm Vân Chi tai Da Chỉ tiêu khí Nhiệt độ trung bình PC) 26,2 26,3 26,7 26,6 26,5 Tổng số giờ nắng (giờ) 19755 22086 24325 21253 2046,6 Lượng mưa (mm), 2368 22241 18724 26887 22854 Độ ẩm trung bình (%) 81 81 81 81 82
Kết quả khảo sát cho thấy, vùng sinh thái Đà Nẵng được khảo sát nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa điển hình, nhiệt độ trung bình năm tương đối ôn định dao
động từ 26,2°C đến 26,7°C; độ âm tương đối cao, trung bình là 81%; lượng mưa trung bình năm cao trên 1800mm Đối chiếu với đặc điểm sinh thái của nắm Vân
Chi,
thé là 25°C Van Chi yéu cau d6 ẩm cao từ 70-75% trong giai đoạn nuôi sợi và trên 90% trong giai đoạn hình thành quả thê (Trịnh Tam Kiệt, 1986; Nguyễn Lân Dũng,
2005; Nguyễn Bá Hai, 2005) Có thể thấy, điều kiện khí hậu tại Đà Nẵng khá phù
hợp đề tiến hành nuôi trồng thử nghiệm nắm Vân Chỉ
Chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát điều kiện khí hậu tại thành phó Đà Ning trong khoảng thời gian từ tháng 4 đến tháng 7 năm 2018 Kết quả khảo sát được trình hệ sợi nấm sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 30°C, nhiệt độ tối ưu cho giai đoạn ra quả bày ở bảng 3.4
Bang 3.4: Điều kiện khí hậu từ tháng 4 đến tháng 7 năm 2018 tại Đà Nẵng
Tháng Nhiệtrung Tôngsôgiờ Lượngmưa Độâmtrung
khảo sát binh (°C) nắng (giờ) (mm) bình (%)
4 26,1 220,0 146,1 82
5 29,1 283,0 50,2 79
6 29.8 1819 150,7 14
Trang 36Có thể nhận thấy, trong năm 2018, từ tháng 4 đến tháng 7 có sự thay đổi về nhiệt độ và lượng mưa giữa các tháng Tháng 4 có nền nhiệt trung bình thấp, khoảng 26°C Tháng 5 có nhiệt độ trung bình cao hơn tháng 4, ở mức khoảng 29°C Nhiệt độ của tháng 4 và tháng 5 so với 2 tháng 6 và tháng 7 khá mát mẻ phù hợp cho sự phát triển của tơ nắm Nền nhiệt độ của tháng 6 cao nhất với trung bình nhiệt cao khoảng 30°C Tháng 7 có nền nhiệt thấp hơn, dao động quanh khoảng 30°C Tháng 6 và tháng 7 là hai tháng có nhiệt độ khá cao, biên độ nhiệt ngày đêm lớn Nhiệt độ trung bình cao ảnh hưởng đến độ bốc hơi của nước trong giá thể, dựa vào điều kiện nhiệt độ bắt buộc phải đưa ra chế độ chăm sóc hợp lý đề nấm phát triển tốt trong giai đoạn ra quả thể Trong bốn tháng 4, 5, 6, 7 năm 2018, tổng lượng mưa cao nhất rơi vào tháng 7 đạt 184.4mm và thấp nhất vào tháng 5 đạt 50,2 mm Tuy lượng mưa không ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng của nắm nhưng lượng mưa sẽ ảnh hưởng đến độ âm không khí và nền nhiệ
Việc nghiên cứu điều kiện thời tiết sẽ giúp xác định được một số nhân tố sinh thái thích hợp để tiến hành cấy giống và chăm sóc nắm trong từng giai đoạn sinh trưởng và phát triển Đặc biệt nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ sóng cũng như
từ đó ảnh hưởng sự sinh trưởng và phát triển của nắm Vân Chỉ
khả năng sinh trưởng và phát triển của nắm trong từng giai đoạn vườn ươm
3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các nhân tố sinh thái đến sinh trưởng, phát triển của
nam Vân Chi
Ching tdi tiến hành khảo sát một số địa điểm nuôi trồng nắm tại thành phố Da Nẵng, nhận thấy các cơ sở trồng nắm dược liệu tập trung ở quận Sơn Trà, quận Ngũ Hành Sơn và huyện Hòa Vang Do những vùng này so với các vùng trung tâm thành phố có diện tích rộng hơn, mật độ dân cư không quá đông người dân có kinh nghiệm trong nông nghiệp Chúng tôi chọn 3 khu vực tại thành phó Đà Nẵng để nuôi trồng nắm Vân Chỉ bao gồm: hợp tác xã nắm Nhơn Phước, xã Hòa Nhơn, huyện Hòa Vang; hợp tác xã số 1, phường Hòa Quý, quận Ngũ Hành Sơn; hợp tác xã nắm, phường Thọ Quang, quận Sơn Trà
3.3.1 Ảnh hưởng của cơ chất đến sinh trưởng, phát triển của nắm Vân Chỉ
trong quá trình trồng tại Đà Nẵng
Nấm Vân Chỉ được coi là một trong 25 loài nắm dược liệu chính trên toàn thế
giới Việc nuôi trồng nắm Vân Chỉ trên các loại môi trường khác nhau nhằm xác định
khả năng thích ứng và khả năng sinh trưởng của nắm
a Ảnh hưởng của cơ chất đến thời gian sinh trưởng của nắm Vân Chi
Trang 3729
Ính hưởng của cơ chất đến sinh trưởng, phát triển của nắm Vân Chỉ trong quá trình nuôi trồng
Cơchất Thời gian hệ sợi phủ kín Thời gian hình thành Tï lệ nhiễm (%) Bảng 3 bịch nguyên liệu (ngày) quả thể (ngày) CT1 4 6 2 CT2 40 33 13 CT3 45 6 2 CT4 4 s9 3 CT§ 37 50 10 CT6 44 62 37 CT7 44 60 10 CT8 4 60 37 cro 50 69 47 cT 10 48 66 30 CTII x X x CTI2 x x x
Ghi chú: X: sợi nắm dừng phát triển
Tir két qua 6 bang 3.5 cho thấy, nếu thành phần cơ chat chỉ bổ sung cám bắp thì thời gian lan tơ kéo dai hơn, sợi tơ mỏng Đối với các cơ chất có bổ sung cám gạo theo tỉ lệ 10%, 15%, 20% thì hệ sợi của nắm dày, đồng đều hơn, tốc độ lan tơ cũng nhanh hơn Tuy nhiên, khi bổ sung quá nhiều cám, đặc biệt ở cơ chất CT 11 và CT 12, tơ nắm không thể bề mặt bịch nguyên liệu, tơ dày, có màu trắng hơi ngả vàng mọc tập trung ở phần miệng bịch và không hình thành quả thể do trong môi trường chứa quá nhiều cám thì
lượng mùn cưa sẽ giảm xuống làm giảm độ tơi xóp của cơ chất nên làm ảnh hưởng đến sự
lan tơ vì vậy tơ nấm không thể lan đến hết bịch
Theo Jozsef và cộng sự (201 1) sự tăng trưởng của sợi nắm phụ thuộc vào nguyên
lan
liệu, chất dinh dưỡng và các điều kiện phát triển Các kết quả nghiên cứu của họ đã chỉ ra rằng, bổ sung 5% cám lúa mì thì không thấy sự tăng trưởng rõ ràng của sợi nắm Khi
bỗ sung 10%, 15%, 20% cám, tốc độ tăng trưởng sợi nắm tăng nhanh Ở mức 30%, 35%
cám, tốc độ tăng trưởng của sợi nấm lại không đáng kể Bên cạnh tốc độ sinh trưởng thì tỉ lệ nhiễm cũng tăng dần khi lượng cám bổ sung tăng [47]
b Ảnh hưởng của cơ chất đến sinh trưởng và phát triển của quả thể nắm Vân
Chỉ
Trang 38‘Van Chi được trình bày ở bảng 3.6
Bang 3.6: Ảnh hưởng của cơ chất đến sinh trưởng và phát triển của qua thé nam Vân Chỉ Cơ chất Khối lượng của quả thé CTI 3.987 3.007 CT2 10.26° 8.57° CT3 1.94" 0.86" CT4 4439 3.178 CTS 15.03* 13.35" CT6 289° 173* CT7 13.46° 1207 CT§ 5419 3.66" CT9 3.47 220° cT 10 4.94" 3.534 Chú thích: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chi sự sai khác có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 959
Dựa vào kết quả ở bảng trên, ta thấy thành phần cơ chất khi bổ sung 15% cám gạo, khối lượng quả thê thu được lớn hơn so với khi bổ sung 10% cám gạo vào cơ chất Tuy nhiên khi tăng hàm lượng cám lên 20% và 25% thì lượng quả thể thu được có xu hướng giảm xuống Ở các môi trường chỉ bồ sung cám bắp thì lượng quả thể thu được rắt ít, kích thước quả thể nhỏ hơn nhỉ: so với các môi trường có cám gạo
Mùn cưa được sử dụng làm giá thể vì chúng có hàm lượng cacbon rất cao Tuy nhiên, mùn cưa là nguyên liệu nghèo chất dinh dưỡng Do đó, để nâng cao hiệu quả nuôi trồng nắm, ta thường bổ sung thêm các nguồn cung cấp dinh dưỡng khác như: cám gạo, cám bắp, Đối với nám Van Chi thì việc bổ sung cám gạo đem lại hiệu quả cao hơn khi bỗ sung cám bắp vì hàm lượng protein thô trong cám gạo (10 - 14%) cao hơn so với cám bắp (8 - 10%), trong cám gạo còn có chứa nhiều khoáng chất như: Ca,
P, K, Zn, Fe, và vitamin BI, B6 rất thích hợp cho sự phát triển của nắm [§]
Trang 3931
giảm đáng kể khi lượng cám gạo tăng lên mức 47,95% Trịnh Tam Kiệt (2012) cũng đã cho thấy yêu cầu vitamin trong giai đoạn sinh trưởng quả thể cao hơn giai đoạn sinh
trưởng của sợi nắm Vitamin có hoạt tính xúc tác và chức năng của nó như một
coenzyme Nhiéu loai nam có khả năng tạo ra vitamin trong những môi trường đơn giản, tuy vậy một số khác đòi hỏi phải cung cấp vitamin vào môi trường để sự sinh trưởng diễn ra bình thường Những vitamin cần cho sự sinh trưởng và hình thành quả thé nấm là vitamin BI, B2, B6, B12 và vitamin K [8]
Từ các kết quả thí nghiệm đã cho thấy, cơ chất CT 5 (83% mùn cưa, 15% cám gạo, 1% saccharose, 1% CaCO3) là cơ chất phù hợp nhất đề tiến hành nuôi trồng qua thể nắm Vân Chỉ Trên môi trường này, thời gian hệ sợi phủ kín bịch nguyên liệu là 37
ngày, thời gian nuôi tơ đến khi thu quả thể là 50 ngày và khối lượng quả thể tươi là 15.03 g/bich (khối lượng khô là 13.35 g/bịch)
3.3.2, Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm ở các khu vực nuôi trằng khác nhau
đến tỉ lệ nhiễm nắm dại
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và độ âm ở các khu vực trồng khác nhau
đến sinh trưởng, phát triển của nắm Vân Chi chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và độ âm đến tỉ lệ nhiễm nắm đại, thời gian phủ kín bịch nguyên liệu, tốc độ lan sợi, sinh khối quả thể nắm
Tỉ lệ nhiễm nấm dại của bịch nắm Vân Chỉ được theo dõi trong giai đoạn ươm
sợi được theo dõi trong 4 tuần có kết quả ở bảng 3.7
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nuôi trồng khác nhau đến tỉ lệ nhiễm nắm dại Khu vực Nhiệt độtrung Độâm trung Tilệ nhiễm nấm binh (°C) bình (%) đại (%)
Tồa Nhơn - Hòa Vang 293 3 37
Hòa Quý - Ngũ Hành Sơn 315 86 13,33
Tho Quang ~ Sơn Trà 29,1 9 120
Trang 40
3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm ở các khu vực nuôi trằng khác nhau đến khả năng lan sợi trên cơ chất trồng
Thời gian phủ kín bịch nguyên liệu, tốc độ lan sợi của nắm Vân Chỉ trong giai
đoạn ươm sợi được theo dõi và có kết quả ở bảng 3.8
Băng 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ âm ở các khu vực nuôi trồng khác nhau đếm khả năng lan sợi trên cơ chất trồng
Khu vực Nhiệ độ Độâm Thờigianphủ Tốc độ mọc
trungbình trungbình kínbịh củasợinấm
cc) (%) nguyên liệu (mm/ngày)
(ngày)
Hoa Nhon — Hoa Vang 293 85 3122 054
Hoa Quy — Ngũ Hành Sơn 315 86 37,35" 0,46"
Thọ Quang - Sơn Trà 29,1 93 35,68° 0,48"
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trong cùng 1 cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,05
Thời gian phủ kín bịch nguyên liệu ở các khu vực khác nhau là khác nhau dao
động từ 31,22 đến 37,68 ngày Trong đó khi nuôi trồng nắm Vân Chỉ tại khu vực Hòa
Nhơn - Hòa Vang thì thời gian phủ kín bịch nguyên liệu là ngắn nhất đạt 31,22 ngày Tại khu vực Hòa Quý - Ngũ Hành Sơn có thời gian phủ kín bịch nguyên liệu là 37,35 ngày, dài nhất trong 3 khu vực Từ đó tính tốc độ mọc của sợi nấm, ta thu được kết quả tốc độ mọc của sợi nấm ở khu vực Hòa Nhơn - Hòa Vang là nhanh nhất đạt 0,54
mm/ngày Tốc độ mọc của sợi nắm ở 2 khu vực còn lại chậm hơn và không có sự sai
luot 0,46 va 0,48 mm/ngay
Theo nghiên cứu của Sukumar và cộng sự, 2008, hệ sợi nắm Vân chỉ sinh trưởng tốt nhất tại nhiệt độ 30°C Nguyễn Thị Bích Thùy (2014) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của sợi nắm Vân Chỉ Trong đó khoảng nhiệt độ 30°C la a
vi này sinh khối sợi thu được là lớn nhất Nhiệt độ thấp hơn hoặc cao hơn thì hệ sợi sinh trưởng, phát triển kém
3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ, đến sinh trưởng của quả thể nắm Vân Chỉ
Kích thước quả thể là một chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng đến năng suất của nắm
khác nhau
thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của sợi nắm Vân Chỉ, trong phạm
lộ Ẩm ở cúc khu vực nuôi trồng khác nhau
Van Chi Kich thước của quả thể không chỉ là một chỉ tiêu đánh giá năng suất mà còn