Bài viết Mức độ biểu hiện MICA/B và mối liên quan với HPV trong ung thư vòm họng được nghiên cứu này với mục đích tìm hiểu mối liên quan giữa nồng độ biểu hiện protein MICA/B và tác nhân HPV trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam.
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 517 - THÁNG - SỐ - 2022 MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN MICA/B VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI HPV TRONG UNG THƯ VỊM HỌNG Nguyễn Hồng Việt1,2, Trần Tín Nghĩa3, Lê Văn Hưng1, Nguyễn Kim Đồng1, Nguyễn Đình Thạch4, Phạm Anh Tuấn5 TĨM TẮT 14 Ung thư vịm họng loại ung thư đặc trưng cho vùng phía Đơng Nam Châu Á, bao gồm Việt Nam Nhiễm human papillomavirus (HPV) đóng vai trị yếu tố nguy cao phát triển loại hình ung thư Sự biểu protein MICA/B-kháng nguyên kích hoạt hệ thống miễn dịch tiêu diệt u tế bào, yếu tố tác động quan trọng Nghiên cứu thực nhằm tìm mối quan hệ ảnh hưởng HPV lên mức độ biểu MICA/B mơ ung thư vịm họng 84 mẫu mơ ung thư vòm họng thực xác định nhiễm HPV kỹ thuật Nested–PCR mức độ biểu protein MICA/B thực phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch Kết cho thấy, phần lớn ung thư xảy nam phân loại thể biệt hóa, chiếm tỉ lệ 70,23% 77,38% Mức độ biểu MICA/B đặc biệt giảm đối tượng dương tính với HPV (p=0,04) Đây gợi ý cho thấy rằng, lây nhiễm HPV ung thư vòm họng giúp tế bào khối u lẫn tránh hệ thống miễn dịch Vì vậy, tìm hiểu mối liên hệ biểu MICA HPV mang yếu tố tiềm giúp tìm hướng điều trị ung thư vịm họng liệu pháp miễn dịch Từ khóa: ung thư vòm họng, human papillomavirus, mức độ biểu MICA/B SUMMARY ASSOCIATION BETWEEN MICA/B EXPRESSION AND HPV IN NASOPHARYNGEAL CARCINOMA Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is one of the most commonly cancer occurred in Southern East Asia, including in Viet Nam The infection of HPV (human papillomavirus) or the expression of MICA/B- a protein responsible for stimulating immune system to kill cancer cells, both of them recently have been demonstrated that relating to many kinds of human cancers In this study, we want to figure out the relationship between HPV and MICA/B in NPC cancer We collected 84 samples of NPC cancer patients to 1Trường 2Trung Đại học Y Hà Nội tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội 3Trường Đại học Y Dược Cần Thơ 4Viện K Tân Triều- Hà Nội 5Bệnh viện Tai Mũi Họng Trung Ương Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Hồng Việt Email: hoangviet@hmu.edu.vn Ngày nhận bài: 27.5.2022 Ngày phản biện khoa học: 20.7.2022 Ngày duyệt bài: 27.7.2022 analyze by Nested-PCR and immunohistochemistry (IHC) method The results showed that 11/84 (13,1%) HPV positive Moreover, MICA/B expression was significantly decreased in positive HPV group compared to none infected by HPV Leading to a hypothesis that HPV maybe was an important reason for promoting cancer cells escape from immune system protection Therefore, understanding the affection of HPV on level of MICA/B expression may further improve treatment on patients with NPC by immunotherapy Keywords: Nasopharyngeal carcinoma, Human Papillomavirus, MICA/B expression I ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vòm họng loại ung thư ác tính, phát sinh từ biểu mơ niêm mạc vịm họng1, phổ biến có xu hướng gia tăng nước giới, đặc biệt với khu vực Đông Nam Châu Á3 Tại Việt Nam, theo Globacan thống kê năm 2021, ung thư vịm họng đứng vị trí thứ loại ung thư thường xảy nay, có 6.000 ca bệnh phát hiện, chiếm tỉ lệ tử vong cao (3.706 ca) Sự phát triển di tế bào ung thư nguyên nhân khiến việc điều trị trở nên khó khăn dẫn đến thất bại HPV virut có vật chất di truyền DNA vòng xoắn kép, khép kín, kích thước xấp xỉ 8kb có khả lây nhiễm vào tế bào biểu mô Dựa mối tương quan với bệnh ung thư, HPV chia thành nhóm Nhóm khơng gây đột biến gen (nononcogene) nguy thấp nhóm thường liên quan đến mụn cóc sinh dục xuất u nhú đường hơ hấp tái phát (respiratory papilomatosis- RRP) Nhóm thứ hai nhóm gây nhiễm trung dai dẳng có khả gây ung thư Đây nhóm đặc biệt quan trọng có yếu tố nguy cao dẫn đến phát triển ung thư, bao gồm loại như: ung thư cổ tử cung ung thư vòm họng Những nghiên cứu gần rằng, ung thư vịm họng có liên quan đến diện virut HPV, rõ bệnh nhân âm tính với HPV cho kết điều trị khả quan so với bệnh nhân có HPV dương tính4 Tuy nhiên, hiểu rõ vai trò tác động HPV ung thu vịm họng vậy, nghiên cứu hứa hẹn đóng vai trò quan trọng việc hỗ trợ đưa phác đồ điều 55 vietnam medical journal n01 - AUGUST - 2022 trị thích hợp cải thiện kết bệnh nhân MICA (Major histocompatibility complex class I chain-related peptide A) MICB (Major histocompatibility complex class I chain-related peptide B) kháng nguyên nằm bề mặt tế bào, mã hóa gene MICA MICB, có chức kích hoạt hệ thống miễn dịch tiêu diệt tế bào u Thông thường, tăng tiết MICA/B quan sát hầu hết dạng ung thư, tín hiệu cảnh báo để tế bào diệt tự nhiên NK hệ miễn dịch phát động mạnh ly giải tế bào u5 Vì vậy, MICA/B đóng vai trị quan trọng phản ứng miễn dịch chống lại ung thư, nhiên, mức độ protein ý nghĩa giai đoạn u tiến triển, kể ung thư vòm họng chưa làm rõ Tại đây, chúng tơi tiến hành nghiên cứu với mục đích tìm hiểu mối liên quan nồng độ biểu protein MICA/B tác nhân HPV bệnh nhân ung thư vòm họng Việt Nam II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng 84 mẫu mô đúc nến thu thập bệnh nhân chẩn đoán ung thư vòm họng Bệnh viện Đại học Y Hà Nội từ tháng 4/2019 đến tháng 12/2020 Những bệnh nhân chưa nhận phương pháp điều trị nào, mẫu mơ ung thư chẩn đốn lưu trữ khoa Giải phẫu bệnh, trường Đại học Y Hà Nội Phương pháp Xác định HPV DNA kỹ thuật Nested–PCR Bảng Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu STT Tên mồi GP5+ M1 - GP5+ M2 - GP5+ M3 - GP6+ M1 - GP6+ M2 - GP6+ M3 GP5+ GP6+ Trình tự 5’ - TTTRTTACTGTTGTWGATACTAC – 3’ 5’ - TGTWACTGTTGTWGATACCAC – 3’ 5’ - GT WACTGTTGTRGACACCAC – 3’ 5’ - AATTGAAAWATAAACTGTAAWTCATATTC - 3’ 5’ - GAAACATAAAYTGTAAATCAWATTC - 3’ 5’ - GAAAATYTGCAAATCAWACTC – 3’ 5’ - TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC – 3’ 5’ - GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C – 3’ Đoạn trình tự DNA có độ dài 140 bp nằm gene L1 HPV khuyếch đại kỹ thuật Nested - PCR thông qua sử dụng cặp mồi GP5+ GP6+ cải tiến Các mẫu cho kết âm tính với HPV kiểm tra lại phản ứng Nested - PCR sử dụng cặp mồi GP5+ GP6+ nguyên bản6 Trình tự đoạn mồi tổng hợp Bảng Phản ứng PCR thực theo hai vòng dựa vào nguyên lý Nested - PCR Vòng phản ứng PCR sử dụng chu trình nhiệt: 950C/5 phút; 40 chu kỳ [950C/30 giây, 450C/30 giây 720C/30 giây]; 720C/10 phút bảo quản sản phẩm phản ứng 40C Ở phản ứng PCR vòng 2, chu trình nhiệt lặp lại nhiệt độ gắn mồi nâng lên 580C 42 chu kỳ Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% kèm theo thang marker 100bp chuẩn (Invitrogen 100bp DNA ladder, 15628 -19) với mẫu chuẩn dương HPV để phát mẫu dương tính với DNA HPV Nhuộm hóa mơ miễn dịch Sự biểu MICA/B đánh giá phương pháp hóa mơ miễn dịch nhuộm thiết bị BenchMark XT Mảnh sinh thiết vùi parafin cắt thành tiêu có độ dày μm trải lên lam tĩnh điện Theo sau trình khử 56 Độ dài khuyếch đại 140 bp parafin xylen khử nước cồn 100%, 90% 80% Tiếp theo, tiêu ủ đệm Citrate (pH=9) 950C Men peroxidase nội sinh bất hoạt ultraVIEW Universal DAB (Ventana, Cat#2534291) phút 370C Sau rửa lần đệm PBS (phosphate-buffered saline), tiêu ủ với kháng thể đa dòng MICA/B kháng thỏ (tỉ lệ pha loãng 1:100, Abcam, 203679) 32 phút 370C Chứng âm chứng dương thực song song với mẫu nghiên cứu Trong đó, chứng dương sử dụng mẫu mô ung thư biểu mô phổi theo hướng dẫn nhà sản xuất Chứng âm mẫu nghiên cứu không phủ kháng thể Tiếp theo, mẫu rửa lại lần PBS đem ủ với ultraVIEW Universal HRP Multimerto (Ventana, Catalog number 253-4290) phút 370C Tiếp tục rửa với PBS lần, tiêu quan sát thông qua kết tủa màu nâu, tạo HRP bổ sung ultraVIEW Universal hydrogen peroxide (Ventana, Cat#2534293) kit nhuộm ultraVIEW Universal DAB (Ventana, Cat#253-4292) phút 370C DAB đổi màu thêm vào ultraVIEW Universal Copper (Ventana, Cat#253-4294) phút 370C Sau đó, mẫu bệnh phẩm TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 517 - THÁNG - SỐ - 2022 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm nhóm nghiên cứu Bảng 2: Đặc điểm đối tượng nghiên cứu Giới tính (%) Tuổi (trung bình ± độ lệch chuẩn) Phân loại tế bào học Nam Nữ 59(70,23%) 25(29,77%) 52,81± 12,32 Ung thư thể biệt hóa Ung thư thể tế bào vảy 65 (77,38%) 19 (22,62%) Tổng số 84 84 mẫu bệnh phẩm chẩn đoán ung thư vòm họng Bệnh viện Đại học Y Hà Nội chọn để tham gia nghiên cứu Trong đó, tỉ lệ nam giới chiếm phần lớn so với nữ giới, cụ thể 70,23% 29,77%, với độ tuổi trung bình 52,81 ± 12,32 tuổi Bên cạnh đó, tỉ lệ ung thư vịm họng phát chủ yếu thể biệt hóa với tỉ lệ 77,38% so với thể tế bào vảy (22,62%) Phân loại tỉ lệ nhiễm HPV nghiên cứu Bảng 3: Tỷ lệ nhiễm HPV phát nghiên cứu Tổng số (N) 84 HPV âm tính 73 (86,9%) HPV dương tính 11 (13,1%) Chúng tơi phát 11 mẫu dương tính với HPV (chiếm 13,1%) tổng số 84 mẫu bệnh phẩm khảo sát Đánh giá liên quan mức độ biểu MICA/B HPV p=0.04* Biểu MICA/B nhuộm hematoxylin II (Ventana, Cat#7902280) ủ với Bluing Reagent (Ventana, Cat#790-2037) điều kiện Cuối cùng, mẫu rửa hỗn hợp nước rửa khử nước cồn, làm xylen, bao phủ Richard-Allan Scientific Mounting Medium (ThermoFisher Scientific, ID 4112) quan sát kính hiển vi Định lượng mức độ biểu protein MICA/B mô Protein MICA/B biểu hiển bề mặt tế bào biểu mô Mức độ biểu MICA/B xác định việc đánh giá cường độ nhuộm tỉ lệ dương tính tế bào biểu mô Cường độ nhuộm chấm điểm theo hệ thống chấm điểm Allred: âm tính (0); yếu (+); trung bình (++) mạnh (+++) Tỉ lệ dương tính tế bào mô chấm điểm là: âm tính (0P); < 1% (1P); - 10% (2P); 11 - 33% (3P); 34 - 66% (4P) > 67% (5P) Mức độ biểu MICA/B tổng thể tính tốn cách tính tổng cường độ tỉ lệ phần trăm kết quả, giá trị nằm khoảng từ đến Cuối cùng, 84 mẫu bệnh phẩm đánh mù đánh giá tính điểm chuyên gia mô bệnh học độc lập trường Đại học Y Hà Nội Kết không ghi nhận thấy khác biệt bên Phân tích thống kê Sự biểu khác MICA/B HPV (-) (+) nhóm bệnh nhân ung thư vòm họng thống kê Student’s T-test Trong tất kết phân tích, p