CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN MỘT SỐ KỸ THUẬT ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN NGƯỜI

CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN MỘT SỐ KỸ THUẬT ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN NGƯỜI GV Trần Anh Minh tranminh1703gmail com ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC CƠ BẢN BỘ MÔN SINH HỌ.

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC CƠ BẢN BỘ MÔN SINH HỌC MỘT SỐ KỸ THUẬT ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN NGƯỜI GV: Trần Anh Minh tranminh1703@gmail.com MỤC TIÊU HỌC TẬP • SV hiểu phát biểu số kỹ thuật nghiên cứu, phân tích di truyền người cấp độ tế bào phân tử NỘI DUNG A MỘT SỐ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN TẾ BÀO Phân tích nhiễm sắc thể Phân tích chất nhiễm sắc giới tính B MỘT SỐ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ Phản ứng chuỗi trùng hợp - Polymerase Chain Reaction (PCR) Kỹ thuật điện di (Electrophoresis) Cắt giới hạn Enzyme Tạo dòng gen mục tiêu (Gene cloning) Lai phân tử (blotting) Giải trình tự DNA (DNA sequencing) A MỘT SỐ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN TẾ BÀO PHÂN TÍCH NHIỄM SẮC THỂ PHÂN TÍCH CHẤT NHIỄM SẮC GIỚI TÍNH A MỘT SỐ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN TẾ BÀO CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN TẾ BÀO: • Đóng vai trị quan trọng di truyền y học: – Chẩn đoán bệnh lý di truyền – Nghiên cứu thối hóa tổ chức mơ  nguyên nhân gây bệnh bên bên – Cung cấp thông tin xây dựng đồ gen người – Phân tích cấu trúc hiển vi hệ gen người A MỘT SỐ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN TẾ BÀO CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN TẾ BÀO: • Một số kỹ thuật/phương pháp nghiên cứu di truyền tế bào thường gặp: – Phương pháp phân tích NST: Nhuộm & phân tích NST, FISH,… – Phân tích chất nhiễm sắc giới tính: Vật thể Barr, vật thể dùi trống, vật thể Y PHÂN TÍCH NHIỄM SẮC THỂ • Giúp phát bất thường số lượng cấu trúc NST người – Xét nghiệm NST cách nhuộm giemsa nhuộm band, quan sát KHV quang học lập NST đồ (karyotyping)  Rút kết luận – Xét nghiệm FISH (Fluorescence in situ hybridization – lai chỗ phát huỳnh quang)  kiểm tra đột biến cấu trúc NST PHÂN TÍCH NHIỄM SẮC THỂ 1.1 XÉT NGHIỆM NST BẰNG NST ĐỒ • Chỉ định xét nghiệm Karyotype: bệnh nhân nghi ngờ bị rối loạn di truyền, dị tật bẩm sinh, chậm phát triển tâm thần, vô sinh – muộn, sẩy thai liên tiếp … q11.2 Human Chromosome 22 PHÂN TÍCH NHIỄM SẮC THỂ 1.1 XÉT NGHIỆM NST BẰNG NST ĐỒ • Ngun tắc chung: Phân tích NST từ kỳ nguyên phân Tế bào phân chia mạnh (VD: TB tủy xương, phôi…) Nuôi cấy tế bào Kích thích TB nguyên phân Bạch cầu Ngăn cản hình thành thoi phân bào Phá màng TB Cố định hình dạng NST Nhuộm NST (Giemsa, Band) Chẩn đốn trước sinh bệnh di truyền lập NST đồ Kết điện di đoạn pt DNA cắt enzyme khác B MỘT SỐ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ TẠO DÒNG GEN MỤC TIÊU (GENE CLONING) - Là kỹ thuật chuyển gen mục tiêu vào vector chuyển vào tế bào chủ nhằm mục đích tạo nguồn gen  Nghiên cứu chức gen  Giải trình tự đoạn DNA mục tiêu  Tạo protein tái tổ hợp  Biểu protein mục tiêu  vaccine 1- Cắt DNA mục tiêu vector 2- Gắn DNA mục tiêu vào vector chuẩn bị tế bào khả nạp 3- Biến nạp vào TB chủ Cấu trúc vector • MCS – Multiple cloning site – Vùng có nhiều vị trí nhận biến R-Enzyme • Promoter để tạo TB chủ biểu gen • Gen kháng kháng sinh dùng để chọn lọc TB biến nạp Các hệ thống vector tế bào chủ • Tùy vào mục đích tạo dịng gen biểu gen mà sử dụng loại vector khác • Tùy thuộc vào kích thước gen mục tiêu mà chọn vector vật chủ thích hợp B MỘT SỐ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ LAI PHÂN TỬ (BLOTTING) - Là kỹ thuật chuyển đoạn DNA, RNA protein lên màng lai dùng mẫu dị (probe) để xác định có diện phân tử mục tiêu hay không - Ứng dụng phát gen, protein bệnh; biểu gen thời điểm, vị trí điều kiện định B MỘT SỐ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ LAI PHÂN TỬ (BLOTTING) - Có nhiều kỹ thuật lai phân tử, kỹ thuật sau: • • • • • Southern blot – Lai DNA Northern blot – Lai RNA Western blot – Lai protein ELISA – phát kháng nguyên, kháng thể FISH Southern blot Southern blot - Ứng dụng phát gen mục tiêu (bệnh) Kết hợp với RFLP, VNTR, STRs, SNPs… xác định huyết thống, pháp y, xác định hài cốt… ELISA - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay - Ứng dụng phát kháng nguyên bệnh kháng thể thể sinh tiếp xúc với kháng nguyên B MỘT SỐ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ GIẢI TRÌNH TỰ DNA • phương pháp giải trình tự: Phương pháp enzyme hay phương pháp dideoxynucleotide (Sanger - 1977) Phương pháp hóa học (Maxam & Gilbert 1977) • Hiện nay: Giải trình tự tự động, dựa theo phương pháp Sanger Chuỗi DNA đích Giải trình tự tự động Vector tái tổ hợp - Nhiều vector tái tổ hợp, primer, dNTP, dideoxyNu đánh dấu huỳnh quang trộn lẫn - Bổ sung DNA polymerase  PCR - Các dideoxyNu gắn vào mạch kéo dài làm ngừng phản ứng trùng hợp Kết phân tích máy tính Phân tách đoạn điện di gel ... hiển vi hệ gen người A MỘT SỐ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN TẾ BÀO CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN TẾ BÀO: • Một số kỹ thuật /phương pháp nghiên cứu di truyền tế bào thường gặp: – Phương pháp phân tích... sequencing) A MỘT SỐ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN TẾ BÀO PHÂN TÍCH NHIỄM SẮC THỂ PHÂN TÍCH CHẤT NHIỄM SẮC GIỚI TÍNH A MỘT SỐ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN TẾ BÀO CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN TẾ BÀO:... biểu số kỹ thuật nghiên cứu, phân tích di truyền người cấp độ tế bào phân tử NỘI DUNG A MỘT SỐ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN TẾ BÀO Phân tích nhiễm sắc thể Phân tích chất nhiễm sắc giới tính B MỘT