Kinh nghiệm lựa chọn: Sắc ký cột

Kinh nghiệm lựa chọn: Sắc ký cột – Phần Sắc ký cột kỹ thuật phổ thông phịng thí nghiệm Phương pháp đơn giản phân lập hợp chất khỏi hỗn hợp cách nhanh chóng Tuy nhiên, giống nhiều kỹ thuật hóa học thực hành khác, để thiết lập chạy cột sắc ký nhanh hiệu lại cần đến nhiều năm kinh nghiệm Bài viết có đề cập đến số cách giúp bạn tối ưu hóa thơng số thí nghiệm để bạn phân tách tốt hợp chất Các cột sắc ký thường dùng phịng thí nghiệm vơ hữu để loại bỏ nguyên liệu không phản ứng ban đầu phân lập sản phẩm mong muốn khỏi sản phẩm phụ sau phản ứng hoàn thành Để làm điều này, hỗn hợp phản ứng qua ống thủy tinh thẳng đứng, bên có nhồi hạt silica alumina, chất thu lại thành phần nhỏ hay phân đoạn nhỏ đầu cột Các thành phần khác mẫu phân tách thành loại hợp chất khác tương tác hỗn hợp với silica Các hợp chất phân cực tương tác với silica mạnh với hợp chất không phân cực nên khỏi cột (hoặc rửa giải) sau hợp chất khơng phân cực Khi mẫu có chưa hợp chất có độ phân cực tương tự nhau, việc phân tách chúng phần nhỏ thu hồi mẫu khó khan Việc nhồi cột xác cho yếu tố thực nghiệm quan trọng nhất, bên cạnh số yếu tố khác tối ưu để đạt khả phân tách tốt thời gian ngắn Sau số hướng dẫn lựa chọn dung môi cách tính lượng silica nhồi cột kích thước cột phù hợp I/ Lựa chọn hệ dung môi Đây lựa chọn khó quan trọng Trong phịng thí nghiệm hóa hữu có nhiều dung môi để lựa chọn Sắc ký cột, đặc biệt sắc ký cột nhanh, thường tiến hành với hỗn hợp dung môi dùng làm pha động: dung môi phân cực dung mơi khơng phân cực Đơi dùng dung môi hỗn hợp dung môi khác Nhiều người tự xây dựng hệ dung mơi u thích thường bắt đầu chạy với chúng, sau điều chỉnh tỷ lệ cần Bảng 1: Hệ thống dung môi hệ dung môi thường dùng sắc ký cột sắc ký cột nhanh Muốn phân tách sản phẩm tạp chất tốt dùng tiết kiệm dung mơi, bí kiểm tra hệ dung môi định sử dụng trước đưa lên cột sắc ký Để làm điều cần chạy mẫu sắc ký mỏng (TLC) – nhơm kính phủ silica (thường nhơm rẻ hơn) II Phương pháp sắc ký mỏng: Cần có: Bản mỏng TLC Kéo/dụng cụ cắt Bút chì Bình triển khai (bình thủy tinh) nhỏ cốc có mỏ, quan sát được, có nắp đậy Hệ dung môi muốn kiểm tra Ống mao quản (Capilary) chấm mỏng TLC micropipette (xem thêm: Cách chấm mỏng) Kẹp gắp mỏng Đèn UV Dụng cụ để phun thuốc thử KMnO4 để quan sát Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa sấy mỏng sắc ký đồ, để sấy nóng số phản ứng phát Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ cho phép chấm nhanh nhiều lần dung dịch pha lỗng chất cần phân tích Một máy ảnh thích hợp (với ống kính Macro) chụp lưu giữ sắc ký đồ ánh sáng ban ngày với khoảng cách 30-50 cm Phương pháp thực hiện: Cắt mỏng thành nhỏ kích thước khoảng cm x cm Cho mỏng khô mặt vào tủ sấy sấy 105 – 110 oC 30 phút Ðể nguội bảo quản bình hút ẩm Khi dùng, cần hoạt hóa lại cách sấy 105-110 0C cạo bỏ dải mỏng chất hấp phụ dọc hai bên cạnh kính Kẻ đường bút chì mặt phủ silica, cách cạnh đáy khoảng 0.5cm Khơng sử dụng bút mực, mực hịa tan dung mơi hữu tách ra, che lấp làm nhiễu kết Đổ (hệ) dung mơi muốn kiểm tra vào bình triển khai Ðậy kín nắp bình để n nhiệt độ 20 – 25oC Dung môi phải ngập khoảng 2-3 mm, không để điểm chấm mẫu vạch chìm dung mơi Điều đảm bảo việc mẫu khơng bị hịa tan vào dung mơi chạy mỏng với dung môi Sử dụng ống mao quản micropipette để chấm mẫu: chấm mẫu chấm nhẹ lên mỏng đủ để mẫu từ ống mao quản chuyển sang mỏng Tốt chấm khoảng 2-3 lần với lượng nhỏ, thời gian lần >1 giây để giữ mẫu mỏng lâu Đường kính điểm chấm mẫu khoảng 1-2mm Lượng chất lớn làm cho vết sắc ký lớn kéo dài, đó, vết chất có trị số Rf gần bị chồng lấp Lượng chất nhỏ q khơng phát độ nhạy thuốc thử không đủ (thông thường độ nhạy thuốc thử 0,005 mg) Lượng mẫu thông thường cần đưa lên mỏng 0,1 – 50 mg dạng dung dịch Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml trường hợp đưa mẫu lên mỏng dạng điểm Ðối với dung dịch có nồng độ lỗng làm giàu trực tiếp mỏng cách chấm nhiều lần vị trí sấy khô sau lần chấm Đặt mỏng thẳng đứng bình triển khai chưa dung mơi Đợi kiểm tra thường xuyên Không làm dịch chuyển hay chạm vào bình triển khai gây dao động dung mơi làm cho thay đổi q trình dung mơi chạy lên mỏng Khi dung mơi chạy cịn cách đỉnh mỏng từ 0.5 – 1cm, cẩn thận nhấc mỏng khỏi bình triển khai kẹp Để dung môi mỏng bay hơi, sau soi mỏng đèn UV phun thuốc thử KMnO4 Dùng bút chì đánh dấu vị trí đốm có màu mạnh (khi dùng KMnO 4), để tránh việc chúng bị mầu dần theo thời gian từ khó đo giá trị Rf đèn UV Bây xác định xem liệu thành phần mẫu tách dung môi lựa chọn chưa Nếu kết phân tách kém, sử dụng hệ dung môi khác thử lại lần III/ Thế phân tách tốt? Từ sắc ký mỏng TLC thu gì? Kết cuối hệ dung môi tách hợp chất mong muốn với tỷ lệ khoảng 1/3 đường dung môi (giá trị Rf khoảng 0.25 – 0.35, Hình 1) Hình Hình ảnh mỏng TLC điển hình cách xác định giá trị R f Một hệ dung môi cho giá trị R f khoảng 0.25 - 0.35 dung môi tách tốt đưa lên cột tách cấu tử mong muốn Khơng nên tìm kiếm dung mơi có giá trị R f cao – đặc biệt bạn kiểm tra hệ dung mơi – làm chất rửa giải tạo thành tạp chất dạng vết chấm khác (hình 2) Hình Lựa chọn dung môi rửa giải nhanh (trái) dung môi làm vết tạp chất (phải) Mặc dù có chấm cho giá trị R f cao, ngược lại hợp chất mong muốn vết chấm rửa giải sau Điều hồn tồn với chấm lên chậm (Rf thấp) Hình cho thấy chấm sản phẩm mong muốn tách rời vạch xuất phát tạp chất xa Có thể bạn lựa chọn dung mơi để tránh nguy tạp chất gây phân tách có giá trị Rf cao Điều chứng minh thường không Các hợp chất nằm cột lâu, chúng dễ bị phân hủy thu hồi sản phẩm Cố gắng phân tách chất có giá trị R f thấp nhiều thời gian tốn dung môi Trong trường hợp này, tốt cố gắng phân tách hỗn hợp sử dụng nhiều mỏng (xem thêm dưới) Hình So sánh dung môi phân tách rõ (bên trái) dung môi rửa giải nhanh (bên phải) trường hợp sản phẩm vết chấm thứ Khi bạn tìm thấy hệ dung môi phân tách phù hợp, bạn cần xem lại hình dạng vết sau chạy mỏng Nếu lý tưởng, vết có hình trịn xa vết khác (Hình 4, vị trí 1) Các vết với dài mỏng dải rộng có khả hợp chất bị chồng lên chạy cột Nếu bạn cố thử số hệ dung môi khác khơng tìm hệ cho chấm trịn đẹp khơng cần lo lắng Miễn việc phân tách vết tốt đưa lên cột tách tốt (Hình 4, vị trí 2) Trong vị trí hình 4, thu mẫu hợp chất cùng, đương nhiên bạn bị bớt lượng sản phẩm bị dinh vào dải sản phẩm cột Vì sử dụng không quan tâm đến việc thu hồi sản phẩm Hình Các khả xảy mỏng TLC IV/ Một số yếu tố khác cần xem xét lựa chọn hệ dung môi Đôi bạn gặp trường hợp có 2, nhiều hệ dung mơi cho phân tách tốt có trường hợp dung môi lựa chọn lại dung mơi khơng cho tách tốt Vậy điều khác ảnh hưởng tới lựa chọn bạn? Có yếu tố khác cần xem xét đến: giá thành điểm sôi Giá thành Nếu hệ dung môi cho hiệu phân tách tương đương nhau, đương nhiên nên lựa chọn dung mơi khơng bị halogen hóa rẻ Điển hình hỗn hợp dung mơi hexan:etyl axetat Nếu bạn không chắn giá thành tương đối dung mơi, cách tốt so sánh kích thước bình chứa Thơng thường dung mơi rẻ bán với đóng gói lớn so với dung môi đắt tiền khác Điều đáng ý số dung môi rẻ hexan hay ete dầu hỏa đặc biệt đựng chai/bình nhựa, thường chứa hydrocacbon bão hịa, khó tách gây khó khan cho việc giải phổ NMR, dải – 1.5ppm Trong trường hợp này, dung môi cần cất loại trước sử dụng (tốn thời gian) sử dụng dung mơi tốt (đắt tiền hơn) Điểm sôi Lập luận để lựa chọn hệ dung mơi có hiệu tách tương đương có nhiệt độ khác xa đơn giản: thường lựa chọn dung mơi có nhiệt độ sơi thấp Bạn tiết kiệm nhiều thời gian cơng sức phải tiến hành thí nghiệm lâu dung mơi có nhiệt độ sơi cao tốn thời gian để bay cần nhiệt cao hay áp suất thấp để loại bỏ, bạn cố gắng thu hồi lại sản phẩm bạn từ dung mơi V/ Lựa chọn xác kích thước cột Một số người cho yếu tố không quan trọng việc lựa chọn cột Thật vậy, mặt lý thuyết dùng cột nhỏ dài chưa silica cột lớn với chiều dài ngắn cho hiệu (Hình 5) Hình Lựa chọn kích thước cột khơng quan trọng việc tính tốn lượng silica sử dụng Tuy nhiên, thực tế, hầu hết người sử dụng chọn cột có kích thước cho phép họ lượng silica cần thiết từ 1/3 tới ½ cột – khơng bao gồm chỗ chưa dung mơi (Hình 6) Điều này, đương nhiên phụ thuộc vào lượng silica mà bạn sử dụng Hình Hướng dẫn chọn đường kính cột sơ VI/ Lượng silica cần thiết bao nhiêu? Lượng silica bạn cần xác định lượng mẫu mà bạn cần tách Tỷ lệ silica/mẫu không cần phải xác, cần tương đối để khơng làm lãng phái thời gian mẫu, dung mơi Có thể cân silica đo thể tích, tỷ trọng silica thay đổi tùy loại Một yếu tố khác ảnh hưởng tới lượng silica yêu cầu việc tách hỗn hợp dễ hay khó Điều xác định chạy sắc ký mỏng Việc phân tách khó tỷ lệ lượng silica so với mẫu lớn Bảng Hướng dẫn tỷ lệ silica/mẫu phụ thuộc vào khả tách mỏng VII/ Vậy yếu tố ảnh hưởng tới sắc ký cột? Một bạn chọn hệ dung môi phân tách, tính lượng silica bạn cần tìm cột phù hợp, bước bạn nhồi cột (phần 2) Đương nhiên, cột lúc cho kết tách lý tưởng lý thuyết Trong xem xét đến việc giải vấn đề thường gặp cách để xử lý chạy sắc ký cột (phần 3) Tác giả: Sarah Millar Kinh nghiệm lựa chọn: Sắc ký cột – Nhồi cột - Phần Sắc ký cột kỹ thuật phổ thông phịng thí nghiệm Phương pháp đơn giản phân lập hợp chất khỏi hỗn hợp cách nhanh chóng Tuy nhiên, giống nhiều kỹ thuật hóa học thực hành khác, để thiết lập chạy cột sắc ký nhanh hiệu lại cần đến nhiều năm kinh nghiệm Bài viết có đề cập đến số cách giúp bạn tối ưu hóa thơng số thí nghiệm để bạn phân tách tốt hợp chất Một bạn chọn hệ dung mơi phân tách, tính lượng silica bạn cần tìm cột phù hợp (xem "Kinh nghiệm lựa chọn: Sắc ký cột – Phần 1" ), bước bạn nhồi cột Trong cột tiêu biểu (Hình 1), pha tĩnh – chất hấp thụ rắn thường silica gel (SiO 2) alumina (Al2O3) nhồi cột thủy tinh thẳng đứng Pha động – dạng lỏng, rót vào từ đỉnh cột chảy xuống cột nhờ tác dụng trọng lực áp suất bên (trong sắc ký cột nhanh – flash chromatography) Quá trình phân tách chất đạt nhờ khả hấp thụ khác tương tác pha động pha tĩnh Hình Thiết lập cột nói chung Chất lượng trình phân tách phụ thuộc vào nhiều yếu tố tối thiểu để tránh tạo thành bóng khí pha tĩnh Để tránh tạo thành bóng khí, việc nhồi cột cách quan trọng Lựa chọn Silica hay Alumina cho Pha tĩnh Silica alumina chất hấp phụ phân cực nên cấu tử phân cực hỗn hợp bị giữ lại mạnh pha tĩnh khỏi cột sau Silica dùng cho hầu hết hợp chất, lại có tính axit nhẹ, thích hợp với hợp chất có tính bazơ Alumina có tính kiềm nhé, nên lực liên kết với hợp chất có tính axit mạnh phù hợp để tách hợp chất phân cực yếu trung bình tinh chế amin Kích thước hạt hấp phụ bị ảnh hưởng dung môi chảy cột Silica alumina có nhiều loại kích thước Kích thước tính giá trị mesh – số lỗ lọc tạo thành đơn vị silica, để lựa chọn chất hấp phụ Vì giá trị mesh cao chẳng hạn “silica gel 230–400” có nhiều lỗ lọc đơn vị diện tích đương nhiên kích thước hạt nhỏ loại "silica gel 60" Thông thường, loại silica gel 70-230 mesh thường dùng sắc ký cột thường (tách trọng lực) silicagel 230-400 mesh dùng sắc ký cột nhanh Alumina có loại I, II III Phân loại dựa hàm lượng nước có alumnia, loại I có nước loại III nhiều Hàm lượng nước có nghĩa có nhiều hạt phân cực alumina tự liên kết với hợp chất hữu hơn, hợp chất phân cực giữ lại cột lâu Alumina loại II III, kích thước 150 mesh thường dùng nhiều Kỹ thuật nhồi cột mô tả sử dụng pha tĩnh silica, áp dụng với alumina Chuẩn bị cột Một số cột có lớp lọc thủy tinh frit (hình 2, bên trái) để tránh thất thoát pha tĩnh từ đáy cột; loại khác khơng có cần phải có lớp đệm bơng thủy tinh vải đáy cột Dùng loại tùy bạn Đặt thêm lớp vải thủy tinh hay lớp bơng vải nghe lạ với lỗ lọc thủy tinh frit khó làm gây nhiễm tạp, chẳng hạn silica rị rỉ qua lỗ lọc frit vào phân đoạn thu hồi Để tránh tượng cho thêm lớp cát lỗ lọc frit silica Mật độ, kích thước lỗ lọc frit khơng giống Nghĩa tốc độ dịng dung mơi cột khác khác Loại lớp lọc frit lớn làm rò rỉ nhiều silica hơn, loại lỗ nhỏ cho tốc độ dịng thấp – thấp – dẫn đên tạo áp lực sắc ký cột nhanh Hình Cột có lớp lọc frit (trái) khơng có lớp lọc frit (phải) Cột có lớp lọc frit Chọn cột có kích thước phù hợp, rửa thật sạch, tráng với nước cất sấy khơ Kẹp cột thẳng đứng lên giá đóng van phía cột lại (trên hình 2) Cho vào lớp cát mỏng (khoảng 0,5cm, muốn) Cột khơng có lớp lọc frit Miếng đệm bơng vải sợi thủy tinh cần đủ rộng để che đáy cột, không rộng chặt q làm cản trở dịng chảy dung mơi (hình 3) Một mảnh có kích thước ngón tay út đủ dùng Vị trí miếng đệm hay sợi thủy tinh phải đảm bảo nằm chắn phần hẹp cột cách dùng đũa thủy tinh dụng cụ khác nén xuống Kẹp cột thẳng đứng lên giá đóng van phía cột lại (trên hình 2) Dịch biên tập BioMedia VN Kinh nghiệm lựa chọn: Sắc ký cột – Xử lý cố - Phần Sắc ký cột kỹ thuật phổ thơng phịng thí nghiệm Phương pháp đơn giản phân lập hợp chất khỏi hỗn hợp cách nhanh chóng Tuy nhiên, giống nhiều kỹ thuật hóa học thực hành khác, để thiết lập chạy cột sắc ký nhanh hiệu lại cần đến nhiều năm kinh nghiệm Bài viết có đề cập đến số cách giúp bạn tối ưu hóa thơng số thí nghiệm để bạn phân tách tốt hợp chất mình: xử lý số cố trình thực sắc ký cột Khi chạy cột Chúng ta có trước cách nhồi cột cách lựa chọn cột dung môi Sau thiết lập hệ cột rồi, đến giai đoạn chuyển mẫu chạy cột Việc đưa mẫu lên cột liên quan đến trình đưa mẫu trực tiếp lên cột để mẫu hấp phụ lên silica Đưa mẫu lên cột - Phương pháp đưa mẫu ướt: Hòa tan mẫu vào lượng dung môi tối thiểu (5-10 giọt) Một dung môi phân cực dung môi bạn chạy cột sau dùng giúp hịa tan mẫu Nếu cần dung môi diclometan dung mơi mạnh phương pháp đưa mẫu khơ (mơ tả dưới) phù hợp Sử dụng pipet xylanh với đầu kim lớn, bơm mẫu vào trực tiếp đưa lên cột sắc ký Cố gắng không làm ảnh hưởng đến bề mặt silica Tốt mẫu phân bố đồng khắp bề mặt để tạo thành mặt phẳng ngang mỏng Khi toàn mẫu đưa lên cột, để cột khô để mức dung môi chạm vào bề mặt lớp silica Nhẹ nhàng thêm lớp cát vào (khoảng 2-5mm) Thêm cát vào tránh cho bề mặt lớp silica bị ảnh hưởng có dung môi thêm vào Sử dụng pipet thêm từ từ dung môi vào cột để mức dung môi đạt khoảng 10mm phía lớp cát Để dung mơi chảy xuống tới mức dung mơi cịn lại từ 1-2mm lớp cát Lặp lại bước thêm 1, lần để đảm bảo toàn mẫu hấp thụ lên silica Cuối cùng, thêm lượng dung môi yêu cầu cột bạn bắt đầu chạy Lưu ý: Phải đảm bảo bạn có đủ thời gian để chạy cột trước bạn đưa mẫu lên Một đưa mẫu lên cột khơng nên dừng cột q phút Không ngừng cột lần Khi cột chạy rồi, việc dừng cột phút dẫn tới dải bị mở rộng điều nên tránh Không để cột chưa chạy xong qua đêm qua thời gian dài (nghỉ trưa, giải lao)!!! Nếu hợp chất bạn có độ tan hệ dung môi cho phân tách tốt nhất, bạn nên chọn phương pháp đưa mẫu khô lên cột Đưa mẫu lên cột - Phương pháp đưa mẫu khơ Dụng cụ: Bình đáy trịn Silica khơ Một dung mơi có khả hịa tan mẫu hồn tồn Máy quay chân khơng Cách làm: Hịa tan mẫu dung mơi thích hợp Chuyển hỗn hợp vào bình đáy trịn Thêm silica khơ vào dung dịch (khoảng gấp từ 10-20 lần khối lượng mẫu) Lắc khuấy nhẹ để đảm bảo tất silica phân bố đồng dung dịch Sử dụng máy cô quay chân không để bay nhẹ dung môi tới silica khô tơi Nếu cịn dinh vào nhau, thêm tiếp silica vào lặp lại bước Rót từ từ dung môi vào cột để mức dung môi cao mức silica cột từ 2-3 cm Dùng pipet để đảm bảo không ảnh hưởng tới bề mặt silica Đổ silica khơ bão hịa mẫu vào cột để lắng xuống Phải đảm bảo mức dung mơi ln phía silica khơng có bóng khí tạo thành Cách tốt thêm thật chậm silica khô vào Lặp lại bước từ 4-8 phương pháp đưa mẫu ướt để mẫu hấp phụ toàn lên silica cột Hứng phân đoạn Để bắt đầu hứng phân đoạn, đặt bình hứng thích hợp phía cột mở van cột Mỗi cột có tốc độ dòng tối ưu Chỉnh van để điều chỉnh tốc độ dung môi chảy Nếu tốc độ chậm trình khuếch tán dẫn đến làm rộng dải thu mẫu (Hình 1, a) Nếu q nhanh khơng đủ thời gian cân hợp chất bị chảy xuống nhanh, để lại vết dài phía sau (Hình 1, c) Với cột có đường kính nhỏ, tốc độ tối ưu thấp so với cột có đường kính thấp Do đó, cột có đường kính lớn chạy nhanh với tốc độ lớn so với cột nhỏ Hình Sự thay đổi tốc độ dịng thay đổi chất lượng trình phân tách Tốc độ tối ưu đạt (b) Không lúc để mức dung môi mức silica cột (hiện tượng “chạy khô”) Dung môi nên bổ sung thường xuyên trước điều xảy Nạp dung môi mức dung môi lớp cát bảo vệ khoảng 2cm Thêm dung mơi sớm dung mơi cịn cột giảm thiểu việc bề mặt silica bị xáo trộn liên kết phía đỉnh cột bị phá vỡ Sẽ có thể tích chết mà khơng chứa mẫu Dung tích phụ thuộc vào kích thước cột hợp chất tách Có thể xem xét dải dung mơi phân cực tương ứng sử dụng để hòa tan mẫu Đây cơng cụ hỗ trợ bổ ích bắt đầu hứng phân đoạn Nếu bạn tìm thấy dải dung mơi phân cực, đánh dấu mức dung môi bắt đầu lên cột bút không trôi Đánh dấu điểm thứ hai cột phía điểm khoảng 2/3 chiều dài cột silica (Hình 2) Khi mức dung mơi xuống điểm thứ 2, lúc thích hợp bắt đầu hứng phân đoạn Nếu cịn nghi ngờ vị trí hợp chất cột, hứng phân đoạn sớm lúc Lưu ý: Hứng lấy lượng dung mơi thuộc vùng “thể tích chết” vào bình chứa Sau đó, mẫu bạn sớm dự kiến, bạn thu hồi lại từ bình Cũng nên cô lượng dung môi kiểm tra trước xử lý (bỏ) Hình Cách ước tính thể tích chết Dung tích phân đoạn Với cột lớn, không cần thiết phải thu nhiều phân đoạn nhỏ: sau lại dồn với Tuy nhiên, thu nhận vài phân đoạn thu phân đoạn giống nhau, đặc biệt dải dung môi thu hồi khỏi cột sát tạo vết dài, để thu phân đoạn lý tưởng tham khảo hướng dẫn sơ Bảng Bảng Dung tích ước tính phân đoạn thu nhận cho kích cỡ cột Dự đốn phân đoạn thu hồi có chứa mẫu? Chấm vài giọt phân đoạn lên mỏng TLC phát triển kiểm tra bắc sắc ký mong Cắt mỏng lớn bình thường (khoảng x cm), kiểm tra từ 5- 10 phân đoạn Xem Cách chạy sắc ký mỏng Sắc ký cột nhanh Nếu chạy cột nhanh, có thơng số cần kiểm soát: áp suất Áp suất phổ biến giữ mức – psi Có thể cao (2 – psi) sử dụng silica siêu mịn Có thể sử dụng dung mơi có độ nhớt butanol nước áp suất tách cao psi Giới hạn áp suất cho cột thủy tinh psi!!! Đầu khí vào cột giữ tay kẹp nhựa chúng bị bật áp suất cao Cách khác để giữ đầu vào ổn định khơng nên dùng Đầu khí vào cột vỡ áp suất làm rơi bị chạm vào vật cực Để đảm bảo an tồn, khí vào kim bơm qua vách ngăn cao su an toàn (septum) Vách ngăn cao su bật áp suất q cao khơng bị vỡ có va chạm Xử lý cố Sau xem xét cách nhồi cột lựa chọn cột, thiết bị, dung môi cần thiết Nhưng lựa chọn cột, dung mơi, chạy cột cẩn thận, xảy sai sót Vấn đề cần phải bình tĩnh, thứ khơng q nghiêm trọng vừa thấy Tiếp đó, nhớ tới kinh nghiệm xử lý vấn đề tương tự xảy tìm cách giải Sau bảng số vấn đề thường gặp cách xử ly (Bảng 2) Bảng Vấn đề thường gặp trình chạy sắc ký cột giải pháp Sắc ký mỏng hai chiều - 2D TLC Sắc ký mỏng chiều hữu dụng để xác định xem hợp chất cần tách có bền silica hay khơng với mẫu có q nhiều thành phần cấu tử Dụng cụ cần dùng: Bản mỏng TLC Dao cắt/ kéo/ dụng cụ cắt Bút chì Bình triển khai thủy tinh (có thể cốc có mỏ, đĩa petri có nắp đậy ) Dung mơi (hệ dung môi) cần kiểm tra Dụng cụ chấm mỏng (ống mao quản micro pipet) (xem thêm bài: Cách chấm mỏng ống mao quản) Kẹp gắp mỏng Đèn UV, buồng soi, bình phun thuốc thử KMnO4 Cách làm: Cắt mỏng theo hình vng, kích thước tốt cm x cm, phải đảm bảo vừa với kích thước bình triển khai Rót (hệ) dung mơi dùng để chạy cột vào bình triển khai Chiều cao chất lỏng khoảng 2-3mm để điểm chấm mẫu khơng bị chìm vào dung môi Điều đảm bảo mẫu không tan dung môi chạy mỏng dung môi Sử dụng ống mao quản micro pipet chấm số mẫu lên mỏng, phía đáy góc bên trái (hình 3, a) Chấm cách đáy cách cạnh trái khoảng từ 0.5 – 1cm có đường kính 1-2mm Kẹp đặt mỏng vào bình triển khai có dung mơi 10 11 12 13 Chờ kiểm tra mỏng TLC thường xuyên Không dịch chuyển hay chạm vào mỏng bình đựng làm dung môi bị xao động ảnh hưởng đến trình dung mơi chạy lên mỏng Khi dung mơi cách cạnh mỏng khoảng 0.5 -1 cm, gặp mỏng khỏi khỏi bình triển khai cách cẩn thận Để dung môi bay Quay mỏng góc 90o để điểm chấm ban đầu thành điểm nằm bên góc phải Các điểm chạy thu (nếu nhìn thấy mắt thường) tạo thành đường nằm ngang dọc theo cạnh đáy mỏng (hình 3, c) Đặt mỏng trở lại bình triển khai có sẵn dung môi Chờ kiểm tra mỏng thường xuyên (không xe dịch hay ảnh hưởng đến bình mỏng) Khi dung môi chạy đến điểm cách cạnh mỏng 0,5-1 cm, gắp mỏng khỏi bình Để dung môi mỏng bay hơi, sau xem mỏng đèn UV dùng bình phun thuốc thử KMnO4 Đánh dấu vị trí tất điểm bút chì Ker đường chéo từ góc chấm mẫu qua điểm chấm mẫu tới đỉnh đối diện Hợp chất bền nằm đường chéo Còn hợp chất bị phân hủy thành chất khác, điểm chạy nằm đường chéo (hình 3) Hình Qui trình chạy sắc ký mỏng chiều (2D TLC) để kiểm tra độ bền hợp chất silica Nếu hợp chất không bền silica, nên chuyển sang dùng alumina dùng kỹ thuật làm khác kết tinh chưng cất Cũng chưa thực việc làm vội, mà chuyển toàn hỗn hợp mẫu (định tách) sang bước thí nghiệm Tùy thuộc vào phản ứng sau đó, hợp chất chuyển thành dạng bền với silica dễ làm Giải pháp thay cho sắc ký cột: Chạy cột tốn nhiều thời gian lúc cần Nếu mẫu rắn, phương pháp kết tinh lại nhanh đơn giản để loại tạp chất Nếu mẫu có chứa tạp, dùng phương pháp silica plug nhanh Nếu lượng mẫu nhỏ (trên 50mg), nên chạy cột nhỏ (micro-column) Những kỹ thuật thay không cho kết tách làm tốt sắc ký cột thường mẫu có thời gian tiếp xúc với silica Tuy nhiên, số điều kiện nêu, phương pháp tiết kiệm thời gian tiết kiệm nguyên liệu Silica Plug Phương pháp silica plug giải pháp thay thô sơ cho sắc ký cột thơng thường Nó phù hợp với mẫu có giá trị Rf cao có vài tạp bị tách ra, gần với vạch xuất phát (hình 4) Plug Hình Bản mỏng TLC ví dụ cho trường hợp mẫu thích hợp áp dụng phương pháp Silica Việc chuẩn bị phương pháp hoàn toàn tương tự với sắc ký cột có lớp lọc frit ngoại trừ việc chạy phễu lọc frit có đường nhánh bên kết nối với nguồn chân không bơm vịng nước (Hình 5) Một lớp cát mỏng cho vào đáy phễu frit để tránh silica qua lớp lọc frit Silica đổ lên lớp cát phương pháp huyền phù (xem bài: Cách nhồi cột) Sau đó, mẫu đưa lên lớp silica theo phương pháp sắc ký cột Hình Cách chuẩn bị để chạy phương pháp Silica plug Kích thước phễu lượng dung mơi thu hồi cho phân đoạn phụ thuộc vào lượng mẫu làm Các phân đoạn thu hồi lớn nhiều so với sắc ký cột Dung tích điển hình phân đoạn 100 – 200 ml Nên đổ đến khoảng nửa bình đáy trịn Nếu bình đày nửa, mẫu bị thất lực hút chân khơng bơm vịng nước Nếu sử dụng đường hút chân khơng, phải đảm bảo độ chân không không cao Giữ cho van mở phần để tránh điều Độ chân khơng cao hệ thống dẫn đến va chạm bình, mẫu qua đường chân khơng Độ chân khơng cao cịn gây khó khan rút dây chân khơng ra, làm silica bị khơ nhanh chân không không tắt kịp thời Do đó, bơm chân khơng vịng nước thích hợp cho kỹ thuật Dụng cụ sử dụng: Phễu có lớp lọc frit Một vài bình đáy trịn (4-6 bình, hơn) Dung mơi cần sử dụng Bơm chân không dây nối với nguồn chân không Cách làm: Kẹp bình cầu lên giá cho chắn đặt phễu lọc frit lên THêm lớp cát mỏng (khoảng 0.5cm) vào phễu Cho silica vào khễu dạng huyền phù (có thể dùng phương pháp nhồi mẫu khô với lượng silica độ rộng phễu, phương pháp huyền phù nhanh đơn giản Đóng nhánh bên phễu với nút đoạn ống nhựa để trình lắng silica khơng tạo bọt khí Thêm dung mơi vào phễu đến gần đầy thơi Nối nhánh bên với nguồn chân không Tắt chân không mức dung mơi cịn cao mức silica phễu từ 2-3mm Để dung môi thấm xuống tác dụng trọng lực đến chạm vào bề mặt silica Dùng dung môi rửa cách thành phễu, phải đảm bảo không làm ảnh hưởng đến bề mặt silica Đưa mẫu lên silica cách đổ lên bề mặt phễu 10 Thêm lượng dung môi vừa đủ đảm bảo silica không bị khô bước (cao mức silica khoảng 5mm đủ) 11 Đổi bình đáy trịn bình rỗng khác 12 Từ từ thêm dung môi vào mà không làm ảnh hưởng đến bề mặt 13 Nối với nguồn chân khơng tới mức dung mơi cịn cao mức silica từ 2-3m 14 Lặp lại bước 10 – 13 (Bắt buộc) 15 Kiểm tra phân đoạn TLC để xác định phân đoạn chứa sản phẩm mong muốn Lưu ý: Khi lắp xong hệ này, thường dùng tay để giữ bình phễu kẹp tháo kẹp đổi bình, dễ vừa tiết kiệm thời gian giảm việc gây xáo động silica phễu Phương pháp cột siêu nhỏ Micro-column Nếu lượng mẫu nhỏ (