K thu t s c ký Chromatography Technology Các k thu t phân tích Cơng ngh Sinh h c Th c ph m 31/10/2011 8:58 SA Nguyên t c c a ph Nguy n H u Trí ng pháp s c ký 31/10/2011 8:58 SA Nguyên t c c a ph Nguy n H u Trí ng pháp s c ký S phân tách ch t tan d a vào l c t ng i c a: ch t tan i v i pha di ng ch t tan i v i th n n M t ch t tan có l c i v i pha di ng l n h n so v i l c v i th n n s có xu h ng di chuy n pha so v i pha di ng Trong m t dung d ch có n ch t tan, ch t có l c v i pha di ng l n nh t s có th i gian l u nh nh t, s kh i c t s c khí s m nh t 31/10/2011 8:58 SA Các ph Nguy n H u Trí ng pháp s c ký S c ký h p th c (Adsorption chromatography) S c ký trao i ion (Ion-exchange chromatography) S c ký l c gel (Gel permeation chromatography) S c ký l c (Affinity chromatography) S c ký o pha (Reverse phase chromatography) S c ký l ng cao áp (High performance liquid chromatography) 31/10/2011 8:58 SA 31/10/2011 8:58 SA Nguy n H u Trí Nguy n H u Trí Kỹ thuật sắc ký M u (sample): c n c l c tr c ch y s c ký Buffer: l c nh m lo i b t p nhi m tr c s d ng Pha ng (mobile phase): Dung môi b m t reservoir vào c t (column) s c ký Nhi u h n m t reserovoir, pha ng c b m vào Mixer (máy tr n) tr c vào c t Pha t nh (stationary phase): c gi l i c t b i môt mi ng th y tinh áy c t Các phân t sinh h c c tách t i c t s c ký Trong HPLC, Guard column c s d ng nh m b o v c t s c ký Detector: UV b c sóng 280 nm detect h u h t protein UV 205 220 detect c nh ng protein hay peptide c u t có m ch vịng 31/10/2011 8:58 SA Nguy n H u Trí Sắc ký lỏng (liquid chromatography) Thành ph n c b n Partition coefficient: Cs: n ng Cm: n ng 31/10/2011 8:58 SA Nguy n H u Trí m u pha t nh (Stationary phase) m u pha ng (Mobile phase) 31/10/2011 8:58 SA Nguy n H u Trí Sắc ký lỏng 31/10/2011 8:58 SA Nguy n H u Trí sinh h c Rf 31/10/2011 8:58 SA Resolution (R): Thông s dùng ánh giá m c tách phân t sinh h c m u W: 11 Nguy n H u Trí Nguy n H u Trí Thơng s s c ký l ng Thông s s c ký l ng Retention time (tR): th i gian phân t kh i c t s c ký tính t lúc n p m u retention volume(VR): 10 31/10/2011 8:58 SA r ng c a áy beat 31/10/2011 8:58 SA 12 Nguy n H u Trí Pha t nh (stationary phase) 13 31/10/2011 8:58 SA Nguy n H u Trí Open column chromatography (low performance liquid chromatography) S d ng áp su t khí quy n, phân tách th p ng kính c a h t pha t nh t ng i l n C t s d ng v t li u r ti n Vd: plastic - phân tách th p 15 31/10/2011 8:58 SA S Nguy n H u Trí h th ng HPLC Tách r a kh i c t (elution) Mobile phase: ng ch m, có pH, l c liên k t ion, tính phân c c thay i theo dãy Gi m h s K M i phân t sinh h c m u có kh n ng l c riêng i v i pha t nh 14 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA S c ký l ng hi u n ng cao (High performance liquid chromatography HPLC) • Phase động bơm vào hệ thông với tốc độ dòng chảy cao (high flow rate) áp suất cao (55 Mpa) • Đường kính hạt pha tónh nhỏ, chứa lỗ nhỏ li ti giúp phân tử sinh học vào, đặc biệt chịu áp suất cao (các hạt phải rắn hạt dùng open column chromatography) • Việc tách rửa tốt tốc độ pha động ổn định • Trong HPLC, pha động thường hỗn hỡp hai phần nhiều -> mixer • Đường ống cột sắc ký làm thép không ró • Dung môi phải khử khí lọc trước sử dụng 31/10/2011 8:58 SA 16 Nguy n H u Trí S c ký l c gel (gel filtration) Size exclusion chromatography hay gel filtration Phân t sinh h c c gi pha dung mơi su t q trình s c ký Tách l c phân t sinh h c d a kích th c hình dáng 31/10/2011 8:58 SA 17 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 18 Nguy n H u Trí S c ký l c gel (gel filtration) Protein nh vào h t bead c gi l i C t th y tinh Các h t gel polysaccharide Các protein l n b l kh i h t kh i c t s c ký tr c protein nh h n 19 31/10/2011 8:58 SA Nguy n H u Trí S c ký l c gel (gel filtration) 20 Nguy n H u Trí S c ký l c gel (gel filtration) ng d ng: Xác nh kh i l ng phân t Lo i b phân t có kích th c nh không c n thi t Vd: Lo i b mu i kh i dung d ch protein tr c th c hi n s c ký trao i ion Tinh s ch protein Pha t nh g m h t gel ch a nhi u kho ng không nh (x p) Protein nh , d vào h t gel c gi lâu h n Protein tách r a kh i c t theo th t kh i l ng phân t gi m d n 21 31/10/2011 8:58 SA 31/10/2011 8:58 SA Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA S c ký h p ph 22 Nguy n H u Trí Sắc ký trao ñoåi ion Trong s c ký h p ph , ch t tan pha ng tranh v trí g n pha t nh Pha t nh có c u trúc m giúp protein d dàng thâm nh p vào h t ti n v v trí g n k t (binding site) Tùy vào ki u liên k t gi a protein pha t nh: S S S S c ký trao i ion c ký l c c ký k n c c ký ng c pha 31/10/2011 8:58 SA 23 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 24 Nguy n H u Trí Sắc ký trao đổi ion Protein thay th counterion Na+, Cl g n vào pha t nh b ng l c hút t nh i n Khi ó Na+, Clc g i Ion exchange group hay ion Exchanger S g n k t hoàn toàn-> trung hịa i n i n tích protein thay pH mơi tr ng i theo i n tích protein i n tích m ch nhánh (R side chain) c ut môi tr ng pH nh t nh quy t nh T i pH acid, h u h t Protein tích i n d ng ng c l i 31/10/2011 8:58 SA 25 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 26 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 27 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 28 Nguy n H u Trí Các nhóm tích i n Ion exchanger Có lo i ion exchanger: Cation exchanger: có kh n ng g n k t ion d ng Anion exchanger: có kh n ng g n k t ion âm M ch nhánh tích i n g n vào: cellulose, Agarose, dextran, hay silica (HPLC) 31/10/2011 8:58 SA 29 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 30 Nguy n H u Trí Tách r a Một số ion exchanger thông dụng Gradient n ng NaCl KCl c dùng tách r a protein kh i c t s c ký (C ng có th dùng gradient pH c a buffer) 31/10/2011 8:58 SA S c ký k n 31 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 32 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 34 Nguy n H u Trí c (hydrophobic chro.) Non polar side chain: Ala, Val, leu, Ile, Trp, Met, Phe, Pro Th ng tâp trung t i lõi protein Có th tìm th y b m t protein protein khác có tính k n c b m t khác c s c a s c ký k n c 31/10/2011 8:58 SA 33 Nguy n H u Trí Các lo i ligand 31/10/2011 8:58 SA 35 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 36 Nguy n H u Trí Normal phase chromatography Tách r a Protein c n p vào c t s c ký ch a nhóm octyl phenyl v i s hi n di n 2M (NH4)2SO4 Tách r a: dùng gradient n ng gi m d n (2M 0) (NH4)2SO4 37 31/10/2011 8:58 SA S c ký ng Nguy n H u Trí Pha t nh: phân c c Pha ng: gradient nông dung moi phân c c t ng d n Protein phân c c h n s kh i c t sau ng c l i 31/10/2011 8:58 SA 38 Nguy n H u Trí S c ký ng c phase (reversse phase chro.) c pha Pha t nh: nhánh hydrocarbon (C-4, C8, C-18) c g n lên pha t nh M u c cho vào dung môi phân c c nh : n c, methanol, acetronitrile ho c h n h p Proteins s g n vào pha t nh theo t ng tác k n c theo m c kh c Tách r a: s dung gradient n ng t ng d n acetonitrile gradient n ng n c gi m d n -> s t ng d n c a tính k n c pha ng 31/10/2011 8:58 SA 39 Nguy n H u Trí S c ký l c (affinity chro.) 31/10/2011 8:58 SA 40 Nguy n H u Trí S c ký l c (affinity chro.) Enzyme nh n bi t g n v i c ch t m t d ng l c -> lý thuy t xây d ng s c ký l c Pha t nh: Affinity ligand c c pha t nh 31/10/2011 8:58 SA 41 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 42 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 43 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 44 Nguy n H u Trí M t s ví d s c ký l c Antigen ligand -antibody Protein A cc nh pha t nh IgG (immunoglobulin)s g n v i protein A t i vùng Fc: n ng mu i cao, Ph cao Tách r a: pH 2-4; IgG 1; IgG 2a; IgG 2b c phân tách kh i c t d a vào s khác c a vùng Fc 31/10/2011 8:58 SA 45 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 46 Nguy n H u Trí Qui trình ELISA 47 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 S SAC., R L Hodinka and S A Young Clinical Virology Manual, Third Edition ASM Press, 2000 Modified from Specter, 31/10/2011 Figure 5.20: 8:58 HIVSA ELISA test 48 © Hank Morgan/Science Photo Library/Photo Researchers, Inc Nguy n H u Trí K thu t ELISA gián ti p C ng h p E R R E A 37 °C M u XN C ch t A 30 phút, T th 37 °C ng Ng ng ph n ng c k t qu M u xét nghi m K thu t ELISA SANDWICH A X Nguy n H u Trí 30phút/ To phịng 30 phút, T th ng Y ? R M u XN A X Y C ch t Ng ng ph n ng c k t qu A Nguy n H u Trí K thu t ELISA phát hi n ng th i Kháng nguyên Kháng th Y R C ng h p c chât 50 M u xét nghi m 37 °C A X 30 phút/ 37 °C 31/10/2011 8:58 SA K thu t ELISA c nh tranh E R Ng ng ph n ng c k t qu 450nm Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể 49 E E C ng h p 30 phút/ 37 °C Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng theå 31/10/2011 8:58 SA + R KN g n gi ng + KN & KT B c 1: 60 phút/ 37 °C + E R E C ng h p B c : 30 phút/ To phòng A X + c chât 30phút/ To phịng Phản ứng màu tỷ lệ nghịch với nồng độ kháng thể 31/10/2011 8:58 SA - 51 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA Tách chi t nucleic acid nh tính nh l ng c b n Các ph ng pháp tách chi t nucleic acid Ph ng pháp tách chi t DNA Ph ng pháp tách chi t RNA toàn ph n mRNA Ly tâm Ph ng pháp s c ký Các ph ng pháp nh tính nh l ng thơ nucleic acid Ph ng pháp o b ng quang ph k Ph ng pháp i n di 31/10/2011 8:58 SA 53 Nguy n H u Trí 52 Nguy n H u Trí Tách chi t DNA thu nh n DNA tinh s ch c n lo i b nh ng thành ph n t p nhi m, mà quan tr ng nh t protein S tách chi t DNA d a nguyên t c hòa tan khác c a phân t khác (nucleic acid/protein) hai pha khơng hịa tan (phenol, chloroform/n c) M c ích thu c phân t nucleic acid tr ng thái nguyên v n t i a, không b phân h y b i tác nhân c h c hay hóa h c Các nucleic acid c n c tách chi t i u ki n nhi t th p c ch ho t ng c a enzyme n i bào (DNase RNase) Sau công o n tách chi t, nucleic acid tinh s ch n m m t th tích dung d ch l n S t a k t h p v i ly tâm cho phép thu nh n nucleic acid d i d ng c n t a d b o qu n c n có th hịa l i n c theo n ng mong mu n 31/10/2011 8:58 SA 54 Nguy n H u Trí Tách chi t DNA Tách chi t DNA B B B c 1: phá màng t bào, màng nhân c 2: lo i protein c 3: thu h i nucleic acid 55 31/10/2011 8:58 SA Nguy n H u Trí Phá màng t bào, màng nhân: nghi n t bào, mô m t h n h p ch t t y (SDS) proteinase phá v màng t bào, màng nhân, gi i phóng DNA mơi tr ng ng th i phân h y protein liên k t v i DNA Ch t t y phân t l ng c c, s k t h p v i protein màng phân t phospholipid làm phá v c u trúc màng Ch t t y ion hóa có tác d ng phá màng m nh, ch t t y khơng ion hóa có tác d ng phá màng nh h n Lo i protein: l c m u dung d ch phenol:chloroform bi n tính protein ng th i khơng hịa tan nucleic acid Protein b bi n tính khơng hịa tan pha n c có ch a nucleic acid sau li tâm s t a thành m t l p n m gi a pha n c pha phenol:chloroform Thu h i nucleic acid pha n c T a nucleic acid: nh m thu nh n nucleic acid d i d ng cô c b o v chúng kh i s phân h y c a enzyme c n có th hịa l i n c theo n ng mong mu n Có th t a ethanol ho c isopropanol Sau ó li tâm thu nh n l i nucleic acid C n t a c r a ethanol 70% lo i b mu i ho c d u v t c a isopropanol Tách chi t DNA Ly tâm ng t tr ng (isopycnic) phân tách ph n t h n h p d a t tr ng c a chúng Th i gian l c ly tâm chung cho nhóm ph n t Dung d ch ly tâm có t tr ng v i giá tr i t th p n cao h n t tr ng c a ph n t c n phân tách Ly tâm gradient liên t c CsCl: trình ly tâm, dung d ch CsCl s t ng hình thành m t gradient ng t tr ng v i t tr ng t ng d n t mi ng ng xu ng áy ng D i tác ng c a l c ly tâm, nucleic acid di chuy n ng n v trí có t tr ng b ng v i t tr ng c a s ng ng l i hình thành m tl pc nh ng L p c thu nh n l i sau ly tâm 57 Ph Nguy n H u Trí ng pháp s c ký S c ký l c: poly U-Sepharose hay oligodTcellulose, dùng tinh s ch mRNA S c ký l c gel dùng phân tách nucleic acid nucleotic t sau q trình t o m u dị (probe) ánh d u S c ký trao i ion vi c t thu h i nh ng l ng r t nh DNA S c ký l ng hi u su t cao: có phân gi i r t cao, c dùng tinh s ch oligonucleotide t ng h p, plasmid, phân tách o n DNA 31/10/2011 8:58 SA Nguy n H u Trí Tách chi t DNA Ly tâm phân o n (a) phân o n vùng (b) phân tách trình t h n h p d a kh i l ng c a chúng Th i gian l c ly tâm c xác nh cho t ng nhóm ph n t Dung d ch ly tâm có t tr ng th p h n ph n t c n phân tách 31/10/2011 8:58 SA 56 31/10/2011 8:58 SA 59 Nguy n H u Trí 58 31/10/2011 8:58 SA Nguy n H u Trí Các ph ng pháp nh tính nh l ng thơ nucleic acid i n di: - Gel agarose - Gel polyacrylamide Quang ph density) 31/10/2011 8:58 SA k : o m t quang (OD 60 Optical Nguy n H u Trí 10 Ph M c tiêu: nh tính: s hi n di n, c u hình phân t , kích th c nh l ng: hàm l ng t ng i so v i thang hàm l ng Chu n b : thu h i o n DNA (dùng t o dòng, ) Nguyên t c: d a vào c tính c u trúc c a nucleic acid: tích i n âm ng u kh p b m t c a m t i n tr ng nên s di chuy n v c c d ng c a i n tr ng Tính linh ng c a phân t di chuy n i n tr ng ph thu c vào kh i l ng phân t n ng ch t c u thành gel Ki u i n di: Agarose, polyacrylamide, i n di tr ng xung(PFGE - Pulse Field Gel Electrophoresis) 31/10/2011 8:58 SA i n di - Electrophoresis ng pháp i n di 61 Nguy n H u Trí Chu n b m u, gel (agarose, polyacrylamide ), b n i n di, buffer, dung d ch i n di N pm u Ch y i n di Nhu m gel 62 31/10/2011 8:58 SA i n di gel Nguy n H u Trí Ch t nh m gel - Stain Chu n b m u, gel (agarose, polyacrylamide ), b n i n di, buffer, dung d ch i n di N pm u Ch y i n di Nhu m gel 31/10/2011 8:58 SA 63 Nguy n H u Trí Gel agarose lo i gel thơng d ng nh t, th ng dùng phân tách nh ng o n có kích th c 0,5-20 kb i n di theo ph ng n m ngang phân gi i thay i n ng agarose hay lo i agarose thay i Phát hi n b ng phóng x t ghi, nhu m ethidium bromide Ch t có kh n ng g n xen vào gi a base c a nucleic acid s phát hu nh quang d i tia t ngo i ng d ng: phát hi n trình t DNA, phân tích h n h p trình t DNA (Southern blot), chu n b nguyên li u 65 64 Nguy n H u Trí i n di bi n tính (Denaturing electrophoresis) i n di gel agarose 31/10/2011 8:58 SA 31/10/2011 8:58 SA SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE): Gel: polyacrylamide SDS: M ch 12 cacbon k n c m t u hi u n c -> che ph ph n k n c protein -> protein tích i n âm (-) Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 66 Nguy n H u Trí 11 i n di gel polyacrylamide c dùng tách o n có kích th c nh , d i 1000 c p base i n di theo ph ng th ng ng phân gi i cao, phân bi t c nh ng trình t ch cách nucleotide Ph ng pháp phát hi n: DNA phóng x t ghi, xanh methylene, ethidium bromide, protein xanh Coomassie, nhu m nitrate b c ng d ng: tinh s ch oligonucleotic t ng h p, xác nh trình t DNA, tách trình t DNA có kích th c g n b ng nhau, SDS-PAGE (phân tích protein) 67 31/10/2011 8:58 SA Ph Nguy n H u Trí ng pháp nh l ng b ng quang ph k Cho phép nh l ng t ng i n ng nucleic acid có m u Nguyên t c: d a vào s h p thu m nh ánh sáng t ngo i b c sóng 260 nm c a base Giá tr m t quang b c sóng 260 nm c a m u o cho phép xác nh n ng nucleic acid m u d a vào m i t ng quan: M t n v OD260nm t ng ng v i n ng : 50 g/ml cho m t dung d ch DNA s i ôi 40 g/ml cho m t dung d ch DNA hay RNA s i n nh tính: s ch d a t s OD260/OD280, tính ch t c a nucleic acid (m ch ôi/ n) (280 nm b c sóng ó protein có m c h p th cao nh t 31/10/2011 8:58 SA C s c as Các ph ng pháp lai phân t 69 31/10/2011 8:58 SA Nguy n H u Trí 68 Nguy n H u Trí lai phân t Khi m t phân t DNA m ch ôi c un lên m t nhi t v t nhi t nóng ch y (Tm) hai m ch s tách r i s phá v liên k t H gi a hai m ch Sau hai m ch tách r i, n u nhi t ph n ng c làm gi m t t c ng v i i u ki n thí nghi m thích h p, chúng s b t c p tr l i Hi n t ng c g i s lai phân t c i m c a s lai phân t : c hi u t i: s tái b t c p ch x y gi a hai trình t hồn tồn b sung v i Các trình t b sung có th DNA hay RNA, d n n s hình thành phân t DNA-DNA, RNA-RNA hay phân t lai DNA-RNA 31/10/2011 8:58 SA 70 Nguy n H u Trí Các ki u lai phân t Lai pha l ng Lai pha r n Lai t i ch 31/10/2011 8:58 SA 71 Lai pha l ng: Các trình t c n lai n m pha l ng, m t dung d ch m S lai phân t x y trình t g p chuy n ng nhi t nhi t môi tr ng th p h n Tm Ph ng pháp c s d ng phát hi n trình t t ng ng (gi a loài hay m t cá th ) Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 72 Nguy n H u Trí 12 Lai pha r n: M t hai trình t c n lai c c nh giá th r n (màng lai) Phát hi n phân t lai thơng qua m u dị (probe) có ánh d u ng v phóng x Ba k thu t lai pha r n thông d ng Southern blot, Northern blot, Dot blot 73 31/10/2011 8:58 SA Nguy n H u Trí Lai t i ch : Trình t nucleic acid c n tìm không c tách chi t kh i mô hay t bào Q trình lai v i m u dị ã c ánh d u phát hi n phân t lai c th c hi n nhi m s c th , t bào hay lát c t mô 31/10/2011 8:58 SA Southern blot 75 Nguy n H u Trí Southern blot Nguyên t c c a Southern blot màng lai nitrocellulose có kh n ng ti p nh n DNA ã c bi t t lâu ã c s d ng nghiên c u lai axit nucleic khác vào nh ng th p niên 1950 1960 u th p niên 1970, s i c a ph ng pháp i n di gel ã cho phép o n DNA c c t b i enzyme h n ch có th c phân tách d a c s kích th c c a chúng T ó b c phát tri n ti p theo c a ph ng pháp chuy n o n DNA phân tách t gel lên màng lai nitrocellulose Ph ng pháp c E M Southern mô t t i Ð i h c Edingburgh vào n m 1975 31/10/2011 8:58 SA 74 Nguy n H u Trí Southern blot bao g m b c c b n sau: C t DNA b ng enzyme h n ch thích h p Ði n di s n ph m c t gel agarose Làm bi n tính DNA gel, DNA s i kép s c tách thành DNA s i n Ch DNA s i n m i có th chuy n lên màng lai Chuy n DNA ã bi n tính lên màng lai (màng nitrocellulose hay màng nylon) Vi c chuy n DNA th ng c ti n hành b ng ho t tính mao d n kho ng vài ti ng ho c có th dùng m t thi t b th m chân khơng Trong q trình chuy n, v trí o n DNA v n c gi nguyên không thay i Lai DNA ã c c nh màng v i m u dị (probe) DNA có ánh d u Q trình d a nguyên t c b sung gi a DNA màng lai v i m u dò Ð ánh d u ng i ta th ng s d ng P32, biotin/streptavidin ho c m t m u dò phát quang sinh h c Ð nh v phân t lai DNA-m u dò N u s d ng m u dị ánh d u phóng x dùng ph ng pháp phóng x t ghi (autoradiograph) xác nh, n u s d ng biotin/streptavidin dùng ph ng pháp so màu ho c n u s d ng m u dò phát quang sinh h c phát hi n b ng s phát quang 31/10/2011 8:58 SA 76 Nguy n H u Trí Northern blot S 31/10/2011 8:58 SA mô t ph ng pháp Southern blot 77 Nguy n H u Trí Sau E M Southern mô t ph ng pháp Southern blot vào n m 1975, ng i ta ã dùng m t ph ng pháp t ng t xác nh o n RNA c bi t g i Northern blot Northern blot bao g m b c c b n sau: RNA (RNA t ng s ho c ch mRNA) c phân tách b ng i n di gel agarose RNA sau ã phân tách c chuy n lên màng lai (các phân t RNA gi nguyên v trí nh gel) RNA c nh màng c lai v i m u dò DNA s i n (ho c RNA) có ánh d u phóng x ho c c g n v i m t enzyme (alkalin phosphatase ho c horseradish peroxidase) t o thành phân t lai RNA-DNA (ho c RNA-RNA) s i kép V trí c a m u dị c phát hi n nh k thu t phóng x t ghi n u c ánh d u phóng x Trong tr ng h p m u dò c g n v i enzyme em v i m t c ch t khơng màu Enzyme liên k t v i s bi n i thành m t s n ph m màu có th nhìn th y ho c phát ánh sáng mà s c phát hi n b ng phim X quang m t cách tr c ti p 31/10/2011 8:58 SA 78 Nguy n H u Trí 13 Ph ng pháp PCR PCR (polymerase chain reaction-ph n ng t ng h p dây chuy n nh polymease) m t nh ng ph ng pháp c s d ng r ng rãi nh t l nh v c Sinh h c phân t Ph ng pháp Kary Mullis phát minh vào n m 1985; c gi i thi u l n u tiên t i H i th o l n th 51 Cold Spring Harbor vào n m 1986 ông ã nh n c gi i th ng Nobel Hoá sinh h c vào n m 1993 Nguyên t c c a ph ng pháp PCR: d a vào c tính ho t ng c a DNA polymerase: c n s hi n di n c a nh ng m i chuyên bi t ho t ng t ng h p m t m ch DNA m i t m ch khuôn Nh v y, n u ta cung c p hai m i chuyên bi t b t c p b sung v i hai u c a m t trình t DNA, ta s ch t ng h p o n DNA n m gi a hai m i Ph ng pháp PCR cho phép t ng h p r t nhanh xác t ng o n DNA riêng bi t Ðây th c s ph ng pháp hi n i thu n ti n cho vi c xác nh s có m t c a m t gen ó t bào v i xác cao 31/10/2011 8:58 SA S mơ t ph 79 ng pháp Northern blot Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 80 Nguy n H u Trí Ba giai o n m t chu k c a ph n ng PCR Giai o n bi n tính (denaturation) Trong giai o n phân t DNA m u b bi n tính nhi t cao (th ng t 94-950C, l n h n nhi t nóng ch y c a phân t ) vòng 30 giây n phút, t t c liên k t hydro gi a hai m ch c a phân t b b gãy t o thành DNA s i n Giai o n lai (hybridization) Nhi t c h th p ( th ng t 40-700C, th p h n nhi t nóng ch y c a m i c s d ng kho ng t 3-50C) cho phép m i bám vào phân t DNA s i n, ánh d u ph n DNA c n c khuy ch i Giai o n kéo dài t 30 giây n m t phút Giai o n kéo dài (elongation) Nhi t c t ng lên n 720C giúp cho DNA polymerase xúc tác t ng h p DNA t t nh t Công vi c c a DNA polymerase di chuy n d c theo DNA s i n s d ng làm khn t ng h p s i DNA m i b sung v i DNA m u b ng cách kéo dài ph n ã c ánh d u b i m i Th i gian c a giai o n ph thu c vào m u, th ng kéo 81 kích th c c a DNA Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA dài t 30 giây n nhi u phút Ð th bi u di n m i quan h gi a th i gian nhi t m t chu k c a ph82n ng PCR Nguy 31/10/2011 8:58 SA Các thành ph n c a ph n Sau m i chu k , s b n c a DNA m u l i c t ng g p ôi Ðây s nhân b n theo c p s nhân Nh v y c phân t DNA m u, sau ph n ng PCR v i n chu k s t o thành 2n b n phân t DNA 31/10/2011 8:58 SA 83 Nguy n H u Trí n H u Trí ng PCR Primer (m i): M i nh ng o n DNA s i n ng n c n thi t cho vi c xúc ti n ph n ng dây chuy n t ng h p DNA Chúng b t c p b sung v i m t u c a DNA m u t o v trí b t u tái b n Các m i có chi u ng c nhau, bao g m m t m i xuôi (forward primer) m t m i ng c (reverse primer) M i m t ch tiêu quan tr ng c a ph n ng PCR quy t nh tính c tr ng hi u qu c a ph n ng Do ó vi c thi t k m i c n c tuân th m t s nguyên t c nh t nh: dài kho ng 18-24 base; Tm c a m i g n nhau; thành ph n nucleotic c a m i c n b ng tránh c p GC l p i l p l i nhi u l n; m i ph i c tr ng cho trình t DNA c n khuy ch i; khơng hình thành primer dimer, khơng ph i trình t l p l i DNA b n m u (DNA template): hàm l ng nh ng không cao, tinh s ch không ch a ch t c ch ph n ng (SDS, ch t c ch t m u (hemoglobin, s c t , heparin, ) PCR v n cho k t qu t t v i DNA thu nh n tr c ti p t t bào hay nh ng m u DNA không c b o qu n t t N ng MgCl2: c n cho ho t ng c a Taq polymerase, hàm l ng cao s t o nhi u s n ph m ký sinh, th p làm gi m hi u qu nhân b n c a enzyme N ng t i u ph i c xác nh cho t ng ph n ng qua nhi u th nghi m 31/10/2011 8:58 SA 84 Nguy n H u Trí 14 Các thành ph n c a ph n dNTP: thành ph n lo i dNTP ph i cân b ng, s m t c n b ng làm t ng l i chép c a polymerase; hàm l ng th ng khơng i nh ng có th thay i tùy i u ki n th c t Enzyme polymerase ch u nhi t Tag-polymerase DNA polymerase ch u nhi t s d ng cho ph n ng PCR l n u tiên c bán th tr ng Tag-polymerase c nhà Vi sinh v t h c Thomas Brock phát hi n Thermus aquaticus m t loài vi khu n phát tri n m nh nhi t cao Enzyme ch u nhi t giúp gi i quy t v n c a enzyme bi n tính sau m i chu k T ó n nay, m t s vi sinh v t ch u nhi t khác ã c khám phá ng i ta ã tách chi t thêm c DNA polymerase ch u nhi t s d ng cho ph n ng PCR nh Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis), Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus), Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus), UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima) S l ng chu k ph n ng tùy thu c vào s l ng b n m u ban u, thông th ng s l ng chu k nh h n 40 cho m t ph n ng PCR Th i gian c a t ng chu k ph thu c thi t b kích th c s n ph m Thi t b d ng c cho ph n ng PCR: c n áp ng c nhu c u thay i nhi t th t nhanh xác Nh ng c i ti n máy luân nhi t quan tâm n microtiler plate 96 gi ng, block nhi t riêng bi t máy, block dùng cho lam kính ti n hành in situ PCR 31/10/2011 8:58 SA 85 Các ng d ng c a ph ng PCR Nguy n H u Trí ng pháp PCR Hi n thành t u c a PCR m nhi u tri n v ng cho sinh h c phân t , v i nhi u ng d ng sinh h c, y khoa, nông nghi p, M t s ng d ng có tính t ng qt: S n xu t m u dò: PCR giúp s n xu t nhanh m t l ng l n m u dò ánh d u th c hi n ph n ng v i c p m i chuyên bi t nucleotide ánh d u Khuy ch i s l ng RNA: s d ng k thu t ph i h p RT-PCR (k t h p enzyme phiên mã ng c Taq polymerase; ho c s d ng Tth polymerase) RT-PCR cho phép nghiên c u mRNA thông tin t n t i v i hàm l ng r t th p, không th phát hi n b ng ph ng pháp c i n nh Northern blot, K thu t in situ RT-PCR cho phép khuy ch i RNA mô t bào nh l ng b ng ph ng pháp PCR: dùng nghiên c u trình t RNA hay DNA có s l ng b n r t th p Trình t ích c khuy ch i ng th i v i m t trình t ch ng có n ng ã bi t, sau ph n ng so sánh hàm l ng s n ph m, suy s l ng b n m u ban u 31/10/2011 8:58 SA 86 Nguy n H u Trí SYBR Green l, principe The Polymerase Chain Reaction (PCR) 31/10/2011 8:58 SA 87 Nguy n H u Trí Nguyên t c phát hi n hu nh quang 31/10/2011 8:58 SA 88 Nguy n H u Trí Molecular Beacons Nguyên t c: Dùng m i c hi u v i AND ích m t chu i oligonucleotic g n ch t hu nh quang R m t u u ch t c ch phát hu nh quang Q Khi m i g n vào chu i AND ích, R Q tách xa cho phát tin hi u màu SYBR Green I Giai đoạ n ké 31/10/2011 8:58 SAo dài Sondes d hybridation 89 Giai đoạn annealing Sondes TaqMan GiaiNguy đoạnn ké H ou dà Tríi 31/10/2011 8:58 SA 90 Nguy n H u Trí 15 RealTime PCR Sondes TaqMan reporter TaqMan Procedure quencher 91 31/10/2011 8:58 SA Nguy n H u Trí Yêu c u l n c a t t c trình ch bi n th c ph m cung c p m t s n ph m không ch a vi sinh v t nguy hi m ch t c c a vi sinh v t: cible log (F2/F1) Các tác nhân gây b nh th c ph m Listeria, Salmonella Campylobacter Các n i c t c a vi khu n y u c n l u tâm th c ph m n 31/10/2011 8:58 SA 93 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA Chu n ốn nhanh G n ây vi c s d ng immunoassay công nghi p th c ph m m i phát tri n nh ng nhanh chóng tr thành m t cơng c phân tích c cơng nh n K thu t ELISA (k thu t h p th mi n d ch liên k t v i enzyme) làm m t a 96 gi ng m t d ng c s d ng r ng rãi nh t b i nhà khoa h c th c ph m 31/10/2011 8:58 SA 95 ng c ch t 94 Nguy n H u Trí Ví d : Nh ng quy trình rút ng n th i gian h n, th ng r h n không c n òi h i k n ng cao s t o nên m t s c i ti n l n v tiêu chu n an toàn vi c cung c p th c ph m K thu t ELISA giúp ti t ki m th i gian, nhân l c v thu t thông th ng c ch Ngày v i s phát tri n c a công ngh sinh h c s d ng h th ng phát hi n kháng th công ngh m u dò DNA, RNA log (nombre de copie) n c t n m ch t M t lo t quy trình truy n th ng, t n th i gian thông th áp d ng xác nh , ki m soát, làm gi m hay lo i b nhi m Crossing Point (Cycles) log (F2/F1) Courbe standard Nguy n H u Trí Chu n ốn nhanh RealTime PCR Echantillon inconnu 92 31/10/2011 8:58 SA 1/Vi c phát hi n Salmonella th c ph m m t quy trình r t ph c t p t n n ngày n u s d ng quy trình t ng sinh truy n th ng B ng cách s d ng quy trình immunoassay s rút ng n th i gian m t ngày 2/ Các c t n m n m m c òi h i nhi u gi tách chi t, tinh s ch, cô c xác nh xác hóa ch t theo cách truy n th ng Tuy nhiên, vi c s d ng c t l c ch a kháng th c hi u v i c t tồn b q trình tách chi t, nh l ng có th ti n hành 30 phút t tr i k Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 96 Nguy n H u Trí 16 Chân thành c m n 31/10/2011 8:58 SA 97 Nguy n H u Trí 17 ... nh tính nh l ng c b n Các ph ng pháp tách chi t nucleic acid Ph ng pháp tách chi t DNA Ph ng pháp tách chi t RNA toàn ph n mRNA Ly tâm Ph ng pháp s c ký Các ph ng pháp nh tính nh l ng... gi a protein pha t nh: S S S S c ký trao i ion c ký l c c ký k n c c ký ng c pha 31/10/2011 8:58 SA 23 Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA 24 Nguy n H u Trí Sắc ký trao đổi ion Protein thay th counterion... theo th t kh i l ng phân t gi m d n 21 31/10/2011 8:58 SA 31/10/2011 8:58 SA Nguy n H u Trí 31/10/2011 8:58 SA S c ký h p ph 22 Nguy n H u Trí Sắc ký trao đổi ion Trong s c ký h p ph , ch t tan