ĐỀ CƯƠNG HÓA PHÂN TÍCH 2 NĂM 2021 VITAMIN DƯỢC TEAM HỌC TẬP TND 2 MỤC LỤC Phần Quang Chương 2,3,4,5 3 Phần Điện hóa Chương 12,13 13 Phần Sắc ký Chương 8,9,10,14 28 Trong quá trình soạn đề cương có thể.
ĐỀ CƯƠNG HĨA PHÂN TÍCH NĂM 2021 MỤC LỤC Phần Quang: Chương 2,3,4,5 Phần Điện hóa: Chương 12,13 13 Phần Sắc ký: Chương 8,9,10,14 28 Trong trình soạn đề cương có vài sai sót, mong bạn thông cảm ibox Page để ad cập nhật lại 😊 Chúc bạn ôn tập tốt!!! #From_ad_with_love VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND CHƯƠNG 2: ĐẠI CƯƠNG VỀ PHÂN TÍCH QUANG HỌC I BẢN CHẤT, CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG CỦA BỨC XẠ ĐIỆN TỪ Tính chất sóng xạ điện từ Các đại lượng đặc trưng: - Bước sóng λ (m, 𝜇𝑚, 𝑛𝑚) - Tần số sóng υ (Hz, kHz, MHz) 𝑐 υ=𝜆 - Số sóng ῡ (cm-1) ῡ=𝜆 - Trong môi trường khác nhau, vận tốc lan truyền xạ khác nhau, giá trị bước sóng λ số sóng ῡ bị thay đổi xạ truyền từ môi trường sang mơi trường khác Riêng đại lượng tần số sóng υ không thay đổi - Một số miền xạ điện từ tần số chúng Tên xạ điện từ Sóng radio vi sóng Ánh sáng quang học Miền Tần số (Hz) 103- 1012 Hồng ngoại xa Hồng ngoại gần Khả kiến Tử ngoại gần Tử ngoại xa 1012- 1014 1014- 4.1014 4.1014- 7.1014 7.1014- 15.1014 15.1014- 1017 Tia Rơnghen 1017- 1026 Tia gamma Trên 1026 ứng dụng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ cộng hưởng từ e Phổ IR Phổ UV- VIS phổ hấp thụ phát xạ nguyên tử phổ huỳnh quang Pp tia X trực tiếp, hấp thụ tia X, huỳnh quang tia X… Phổ tia gamma Tính chất hạt xạ điện từ ∆𝐸 = ℎ𝑐 λ = ℎυ Trong đó: ∆𝐸: ℎ𝑖ệ𝑢 𝑐ủ𝑎 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑐á𝑐 𝑚ứ𝑐 𝑛ă𝑛𝑔 𝑙ượ𝑛𝑔 h: số Planck (h=6,63.10-34 J.s) c: vận tốc ánh sáng (3.108 m.s) λ: bước sóng ánh sáng (m) HIỆN TƯỢNG HẤP THỤ ÁNH SÁNG - Định lượng hấp thụ ánh sáng: Giả sử có mơi trường đồng tính giới hạn mặt phẳng song song với bề dày l, chùm sáng cường độ Io rọi vng góc lên mặt trước cường độ ánh sáng mặt sau I Ta có: I = Io.e-kl II VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND Định luật hấp thụ ánh sáng (định luật Lambert): độ dày lớp môi trường tăng theo cấp số cộng cường độ ánh sáng giảm theo cấp số nhân - Phổ hấp thụ: đường cong biểu diễn phụ thuộc khả hấp thụ chất theo bước sóng (tần số hay số sóng) III SO SÁNH HẤP THỤ NGUYÊN TỬ VÀ HẤP THỤ PHÂN TỬ Hấp thụ nguyên tử Điều kiện - Có bước sóng phù hợp - dạng nguyên tử tự Dạng phổ Phổ vạch (không liên tục) - phổ hấp thụ nguyên tử AAS - phổ phát xạ nguyên tử AES - phổ phát xạ plasma - phổ huỳnh quang nguyên tử - dùng định lượng kim loại Ứng dụng Hấp thụ phân tử - có bước sóng phù hợp - không cần dạng tự (đo dạng dung dịch) Phổ dải (liên tục) - phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) - phổ hồng ngoại (IR) - phổ huỳnh quang phân tử - dùng định lượng, định tính hợp chất hữu VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND CHƯƠNG 3: QUANG PHỔ HẤP PHỤ PHÂN TỬ I - QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (UV-VIS) Vùng tử ngoại xa (50-200nm) Ít dùng lượng cao dễ phá vỡ liên kết phân tử, Hầu hết dung môi hấp thụ mạnh chí hóa dung mơi O2 khơng khí hấp thụ (λ=180nm) Thạch anh hấp thụ tia Vùng tử ngoại gần khả kiến (VIS) Tử ngoại gần: 200-400nm khả kiến: 400-800nm Thạch anh không hấp thụ tia tử ngoại dùng để đo phổ vùng tử ngoại Với tia nhìn thấy dùng cốc thủy tinh Sự chuyển mức lượng e với hấp thụ xạ UV-VIS Các e tham gia vào hiệu ứng này: + e σ lk đơn C-H, C-C + e π lk bội, hệ thông thơm… + e n cặp e tự không tham gia lk O, N, halogen… Trong phân tử có nhiều lk đơi hấp thụ chuyển lên bước sóng dài hơn, đặc biệt với hệ liên hợp Định luật Lambert- Beer 𝐼𝑜 A = -logT = log = ε.l.C 𝐼 ε: hệ số hấp thụ phụ thuộc vào chất dung dịch, bước sóng chùm tia đơn sắc l: bề dày dung dịch (cm) C: nồng độ dung dịch (M) - 𝐼 Độ truyền qua T = 𝐼𝑜 𝑥100(%) Độ hấp thụ A = -logT độ hấp thụ A gọi mật độ quang D độ tắt E - Các hệ số hấp thụ: + l = 1cm, C = 1M A = ε nên ε gọi hệ số hấp thụ mol + C tính theo phần trăm (kl/tt) l tính theo cm E1%1cm gọi hệ số hấp thụ riêng - Điều kiện áp dụng: + Thiết bị phải có khả tạo chùm tia có độ đơn sắc định Độ đơn sắc cao tốt + chất thử phải bền dd tác dụng tia UV-VIS + Dung dịch phải nằm khoảng nồng độ thích hợp + Dung dịch phải suốt Các yếu tố ảnh hưởng đến khả hấp thụ UV-VIS a, Các yếu tố thuộc cấu trúc phân tử chất tan - Nhóm mang màu: phân tử có chưa nhóm hấp thụ xạ có bước sóng 200nm + chuyển n → π* =C=O, -N=O - VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND - - - - - + chuyển π → π* -N=N-, =C=C=, -C=C-, =C=S + nhóm mang màu: Alken dien Carbonyl đơn giản Enon polyen Dẫn chất benzen lần, lần… Carbonyl thơm Đa vịng thơm, dị vịng… Nhóm trợ màu: nhóm tự có khả hấp thụ UV-VIS lại làm ảnh hưởng khả nhóm khác Halogenua: -Br, -Cl, -I Alkyl: -CH3, -C2H5, Amin: -NH2, -NH-, Alcol, ester: -OH, -OR + Tăng λmax: chuyển dịch bathochromic + Giảm λmax: chuyển dịch hypsochromic + Tăng ε: hiệu ứng hyperchromic + Giảm ε: hiệu ứng hypochromic ảnh hưởng vị trí khơng gian + Vị trí lk + Hướng lk b, yếu tố dung mơi Ngồi việc dựa vào độ tan chất cần phân tích cịn phải tính đến khả hấp thụ ánh sáng dung môi (chọn dm có λcutoff thấp để giảm khả hấp thụ dm) Khi sử dụng dung môi phân cực mà chất tan phân cực làm xuất tương tác lưỡng cựclưỡng cực→ khoảng cách π-π* ngắn lại làm cho cực đại hấp thụ chuyển dịch phía bước sóng dài Ngược lại làm cho chuyển dịch n-π* dài Lk hydro dung môi e n tác động qua lại làm cực đại chuyển dịch phía có bước sóng ngắn ảnh hưởng pH nồng độ chất tương tác khác dung dịch c, Yếu tố thuộc thiết bị (cấu tạo máy quang phổ UV-VIS) nguồn- đơn sắc hóa- buồng đo- phận phát hiện- xử lí liệu - - - nguồn sáng: + UV: đèn D2 + VIS: vonfram đơn sắc hóa + Kính lọc (1 bước sóng) + Lăng kính: dùng + Cách tử: chủ yếu cách tử phản xạ buồng đo phận tiếp nhận + Tế bào quang điện VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND + Ống nhân quang: đo bước sóng + Mảng diod: máy DAD đo nhiều bước sóng, quét phổ ỨNG DỤNG Định tính Độ chọn lọc khơng cao, khơng định tính khẳng định Dựa vào λmax, tỉ lệ λmax, chồng phổ Định lượng dung dịch thành phần Kĩ thuật đường chuẩn: + chuẩn bị số dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau, đo mật độ quang để vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ mật độ quang nồng độ + đểhạn chế phải ngoại suy nồng độ dung dịch cần đo phải nằm khoảng nồng độ dãy chuẩn→ phải biết trước khoảng nồng độ dung dịch cần đo + Nếu dung dịch không thật tuân theo định luật Lambert- Beer phải chọn vùng có hệ số tương quan r>0.99 - So sánh điểm 𝐴𝑥 𝐶𝑥 𝐴𝑥 𝐶𝑐 = → 𝐶𝑥 = 𝐴𝑐 𝐶𝑐 𝐴𝑐 Cx gần nồng độ dung dịch chuẩn kết xác - Kĩ thuật thêm đường chuẩn + đo mật độ quang dung dịch chưa thêm chuẩn dung dịch có thêm chuẩn + vẽ đường biểu diễn mối quan hệ mật độ quang nồng độ chất chuẩn thêm Giao điểm đường với trục nồng độ giá trị nồng độ dung dịch cần đo - Xác định nồng độ biết hệ số hấp phụ yêu cầu: + máy phải chuẩn hóa bước sóng giá trị mật độ quang + dung dịch cần đo phải suốt nồng độ nằm khoảng áp dụng định luật II - VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND Chuẩn độ đo quang áp dụng khi: + khơng tìm chất thị + khơng chuẩn độ đo + dung dịch có màu (nhưng không qua đậm) Định lượng dung dịch nhiều thành phần - Tính cộng tính độ hấp thụ ánh sáng: At = A1 + A2 +… - Các cách tiến hành: + đo mật độ quang nhiều bước sóng khác + quang phổ đạo hàm III QUANG PHỔ HỒNG NGOẠI Đặc điểm phổ IR - Là phổ dao động - Có lk nhóm nguyên tử dải hấp thụ→ đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm chức - Cường độ hấp thụ khơng quan trọng nên dùng để định lượng Ứng dụng - Định tính + nhận nhóm chức đặc biệt phân tử Tuy nhiên, trừ chất đơn giản, phổ hồng ngoại tất chất phức tạp nên cần phải biện giải phổ để xác định nhóm chức + định tính chất cách chồng phổ - Định lượng: dùng Máy quang phổ hồng ngoại - Cấu tạo máy quan phổ hồng ngoại Nguồn xạ: Ống Nernst (ceri oxyd), Globar (cacbua silic) Detector: Cặp nhiệt điện/pin nhiệt điện Máy hồng ngoại chuyển hóa Fourier Khơng dùng lăng kính/cách tử: modul hóa tín hiệu Độ nhạy độ phân giải cao, thu tín hiệu nhanh - Máy hồng ngoại gần - Chuẩn bị mẫu: - - Mẫu lỏng/khí: Cuvet KBr Dung mơi CCl4, CS2 Mẫu rắn: Ép phim chất phân tích phân tán KBr Chú ý đo: o Phổ có độ phân giải cường độ thích hợp o Chất đo tinh khiết o Thiết bị chuẩn hóa o Thực kĩ thuật o Chú ý đỉnh yếu để ghi lại nồng độ cao VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND CHƯƠNG 4: QUANG PHỔ HẤP THỤ VÀ PHÁT XẠ NGUYÊN TỬ PHẦN 1: QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ (AAS) I NGUYÊN TẮC Nguyên tắc: - Khi nguyên tử trạng thái hấp thụ xạ có bước sóng xác định Phổ hấp thụ nguyên tử phổ vạch - Muốn đo quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) cần: - Chọn điều kiện, trang thiết bị phù hợp để chuyển mẫu phân tích thành trạng thái nguyên tử tự - Chiếu chùm tia sáng thích hợp qua đám nguyên tử Các nguyên tử nguyên tố cần phân tích hấp thụ phần xạ tạo phổ hấp thụ nguyên tử Phần xạ bị hấp thụ phụ thuộc vào nồng độ nguyên tố môi trường hấp thụ - Nhờ máy quang phổ, người ta thu, phân ly, chọn lọc vạch phổ nguyên tố cần nghiên cứu đo cường độ Cấu tạo máy AAS Bức xạ cộng hưởng Nguyên tử hóa mẫu Đơn sắc hóa Xử lý 2.1 Nguồn phát xạ cộng hưởng a Đèn catod rỗng (HCL): *Cấu tạo: - Thân đèn: + Vỏ đèn: thủy tinh, thạch anh chịu nhiệt + Cửa sổ: thủy tinh, thạch anh tùy theo xạ phát thuộc vùng + Giá đỡ điện cực: - Khí chứa đèn: Khí trơ: He, Ar, N với áp suất thấp, độ cao → Không phát phổ Điện cực: + Anod dây dẫn: kim loại trơ, bền với nhiệt: vonfram + Catod: Dạng ống rỗng, làm kim loại cần phân tích với độ tinh khiết cao Nguyên tắc hoạt động: - - Đèn đốt nóng nhờ nguồn điện chiều ổn định (250-400V, 3-50mA) Đèn hoạt động, catod bị nung đỏ xảy phóng điện liên tục → Các ion sinh công vào bề mặt catod bị nung đỏ → Một số nguyên tử bề mặt bị hóa thành nguyên tử tự tác dụng nhiệt độ, chúng bị kích thích phát phổ phát xạ → Phổ vạch kim loại làm catod rỗng Trong mơi trường khí trơ áp suất thấp, phổ phát xạ gồm vạch nhạy kim loại b Đèn phóng điện khơng điện cực (EDL) VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND - Là ống phóng điện mơi trường khí có chứa ngun tố cần phân tích với nồng độ định - - Là ống thạch anh chịu nhiệt quanh cuộn dây cao tần công suất 200-400W, chứa vài mg kim loại/muối kim loại dễ bay để cho đèn nhiệt độ 200-4000C áp suất kim loại khoảng 1-1.5mmHg - c Đèn phát phổ liên tục bị biến điệu (D2-lamp, W-lamp)… - - Đèn hydro nặng, đèn xenon áp suất cao, đèn halogen… phát phổ UV-VIS liên tục biến điệu lọc giao thoa nên chùm sáng phát xạ bị biến điệu lượng tử hóa thành chùm sáng khơng liên tục có phổ dạng cưa - - Ưu điểm: dễ chế tạo, rẻ tiền, độ bền cao, áp dụng với nhiều nguyên tố - - Nhược điểm: độ đơn sắc, độ chọn lọc đèn HCL 2.2.Bộ phận nguyên tử hóa mẫu - Nguyên tử hóa mẫu lửa: Mẫu phân tích chuẩn bị dạng dung dịch Sau đó, dung dịch mẫu dẫn vào lửa đèn khí để nguyên tử hóa mẫu thực phép đo Q trình gồm bước: Chuyển dung dịch thành hạt sương với khí mang khí cháy → Hạt sol khí – aerosol: + Phun khí: Mẫu ống mao dẫn luồng khí mang đưa vào buồng aerosol hóa, va đập vào bi tạo hạt, đánh tung quạt trộn với khí đốt Phần dung dịch thừa không tạo hạt, hạt ngưng lại dẫn ngồi + Siêu âm: Lực siêu âm truyền qua pha rắn hay lỏng đến dung dịch aerosol hóa → Dung dịch bị đánh tơi thành hạt nhỏ trộn với khí đốt Chuyển hỗn hợp aerosol hóa hỗn hợp khí đốt vào đèn để ngun tử hóa - Ngun tử hóa mẫu khơng dùng lửa + Nguyên tử hóa mẫu thời gian ngắn nhờ lượng dịng điện cơng suất lớn mơi trường khí trơ Q trình gồm bước: + Sấy khơ mẫu: để đảm bảo dung mơi hịa tan mẫu bay nhẹ nhàng hoàn toàn khơng làm mẫu + Tro hóa luyện mẫu: đốt cháy hợp chất hữu mùn mẫu đồng thời, nung luyện mẫu đến nhiệt độ thích hợp → Thuận lợi cho giai đoạn nguyên tử hóa mẫu đạt hiệu suất cao ổn định + Nguyên tử hóa: thực thời gian ngắn (3-6s) với tốc độ tăng nhiệt độ lớn, đạt đến nhiệt độ nguyên tử hóa mẫu + Làm cuvet luồng khí trơ 2.3.Bộ phận đơn sắc hóa - Đặt sau phận nguyên tử hóa mẫu - Mục đích: chọn vạch cộng hưởng, từ nguồn phát xạ nhiều vạch loại bỏ vạch nhiễu lửa phát - 2.4 Bộ phận phát hiện: Bộ phận phát xử lý tín hiệu thu tương tự máy quang phổ khác II - ỨNG DỤNG Định lượng hầu hết nguyên tố kim loại số kim As, B có nguồn xạ cộng hưởng Ngành Dược: + Xác định nguyên tố vi lượng dịch sinh học: huyết tương, máu, dịch não tủy… VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 10 CHƯƠNG 9: SẮC KÍ KHÍ MỤC TIÊU Trình bày chất, đặc điểm pha dùng sắc kí khí Trình bày ngun tắc hoạt động detector: FID Phân biệt loại cột dùng sắc ký khí Giải thích kỹ thuật chuẩn hóa diện tích sắc ký khí I GIỚI THIỆU VỀ SẮC KÍ KHÍ Phân loại - Sắc kí khí- lỏng (GLC): Pha tĩnh chất lỏng Là sắc kí phân bố - Sắc kí khí- rắn (GSC): Pha tĩnh chất rắn Là sắc kí hấp phụ Nguyên tắc - Tách chất có khả bay bền với nhiệt hỗn hợp phân tích + Các hợp chất có điểm sơi lên tới 400oC + Các hợp chất không bị phân hủy nhiệt độ hóa chúng + Các hợp chất bị phân hủy nhiệt độ hóa chúng, luôn -> Gọi nhiệt phân GC - Các hợp chất khơng thể phân tích khó phân tích GC: + Các hợp chất không bay (KL vô cơ, ion muối) + Các hợp chất phản ứng cao hợp chất không ổn định mặt hóa học (acid hydrofuoric acid mạnh khác, ozone, Nox, hợp chất khác) + Các hợp chât hấp phụ cao (các hợp chất chứa carboxyl, nhóm hydroxyl, nhóm amin, lưu huỳnh) + Các hợp chất mà mẫu chuẩn khó thu (khó khăn cho định tính định lượng) - Quá trình tách phụ thuộc vào khả bay chất tan – tức điểm sôi - Hệ sô phân bố x/p phụ thuộc Po hệ số hoạt độ Nếu dung dịch lý tưởng, tuân theo định luật Raoult: p = x.Po Po: áp suất chất tan tinh khiết x: phân số mol chất tan dung dịch p: áp suất chất tan dung dịch Dung dịch thực cần thêm hệ số hoạt độ cho x: p = x.γ.Po Ở nồng độ thấp, γ const nên x/p hệ số phân bố 𝑥 K=𝑝 = γPo Thể tích lưu thời gian lưu VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 34 VR = tR.F VM = tM.F F tốc độ dịng trung bình pha động 𝑇 𝑃−𝑃𝐻2𝑂 𝑇 𝑃 F = Fm 𝑐 Tc T nhiệt độ cột MT (oK) Fm tốc độ đo sau qua cột P PH2O áp suất cuối cột nước - Vai trị chương trình nhiệt độ Nhiệt độ cột thơng số tác động đến hệ số phân bố chất tan Khi nhiệt độ tăng 20oC, hệ số phân bố giảm lần tR giảm tương ứng Chương trình nhiệt độ kiểu rửa giải gradient: tăng nhiệt độ từ từ để tăng độ phân giải cho hỗn hợp Sắc kí đẳng nhiệt k cho kết tốt pic rửa giải sớm (nhiệt độ cao) pic rộng, không cân đối tR dài (nhiệt độ thấp) → chương trình nhiệt độ tối ưu xác lập qua thực nghiệm II MÁY SẮC KÝ KHÍ - Pha động: Khí mang đưa mẫu qua cột - Hệ thống tiêm mẫu: Đưa mẫu vào cột - Pha tĩnh: Cột sắc kí đặt lị cột - Detector: Phát chất phân tích mẫu Hệ thống cấp pha động: - Pha động chứa bom khí, kèm có van giải áp đồng hồ kiểm tra lưu lượng khí - Pha động thường khí trơ như: Heli, argon, nito, khí cacbonic khí Hydro - Lựa chọn khí trơ cịn phụ thuộc vào loại detector cột sử dụng (Cột nhồi thường dùng heli nito, heli cho pic hẹp chuyển khối nhanh hơn, cột mao quản hay dùng heli, hydro) -Yêu cầu pha động: + Trơ với pha tĩnh, vật liệu làm cột chất phân tích + Khơng độc khơng dễ cháy, rẻ tiền + Phảm đảm bảo khơ, tinh khiết • Khí mang qua phận bẫy để loại nước, khơng khí oxy, Vì: nước: ảnh hưởng đến số pha tĩnh rắn lỏng hoạt động Detector Khơng khí oxy 10 ppm, oxy hóa hỗn hợp mẫu PT Pha tĩnh lỏng (đặc biệt nhiệt độ cột cao) VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 35 • Áp suất vào cột dao động khoảng 10-50psi (0,7 – 3,5 bar) đảm bảo tốc độ dòng – 50 ml/phút tùy thuọc vào loại cột Hệ tiêm mẫu: - Có nhiều kỹ thuật tiêm mẫu khác mẫu lỏng: + Kỹ thuật tiêm khơng chia dịng + Kỹ thuật tiêm mẫu chia dòng + Kỹ thuật tiêm trực tiếp vào cột + Bay nhanh Cột sắc ký khí – lỏng: - Cột nhồi: • Dài 1-3m • Đường kính 2-3mm • Lớp pha tĩnh lỏng bao quanh: 0,05-1μm • Hạt nhồi: chất mang (hạt rắn) 150-250 μm bao quanh lớp pha tĩnh lỏng 0,05-1 μm • Hiệu lực cột tăng nhanh khi: Giảm kích thước hạt bề dày lớp pha tĩnh lỏng • Đánh giá cột nhồi: Cột nhồi thường bị ảnh hưởng khuyếch tán xoáy, kt dọc, chuyển khối pt Van Deemter Nên hiệu lực cột giảm độ phân giải so với cột mao quản - Cột mao quản: • • • • Dài 10-100m Đường kính: 0,1-0,7 mm Được bao lớp pha tĩnh lỏng 0,1-0,5 μm Cột SCOT có lớp pha tĩnh lỏng bao quanh chất mang nên hiệu lực cột cột WCOT Đặc điểm Nguyên liệu chế tạo cột Kích thước cột Pha tĩnh Hệ bơm mẫu Dung lượng mẫu Khí mang Hiệu lực cột (số đĩa/m) Cột mao quản Silica nung chảy tinh khiết (tạp kim loại < 1ppm) Dài 10-100m (cuộn tròn) đường kính 0,1-0,7mm, có áo bảo vệ polyimid nhôm Lớp chất lỏng dày 0,1-0,5μm bao mặt cột (WCOT) chất mang bao pha tĩnh (SCOT) Chia dịng, khơng chia dịng, bơm thẳng vào cột Tùy theo chiều dài dược kính cột, lượng mẫu thay đổi 0,1-10 μL Heli hydro WCOT: 1000-4000 SCOT: 600-1200 Cột nhồi Thủy tinh, thép không gỉ Dài 1-3m (cuộn trịn) đường kính 2-3mm Kích thước hạt 150-250 μm, bao lớp mỏng (dày 0,051μm) Bay nahnh, tiêm thẳng vào cột 0,1-10 μL Nito, Heli 500-1000 VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 36 Độ phân giải Phân tích nhiều thành phần: 100 chất Thấp, tốt tách với cột đường kính 20 thành phần ≤0,2mm Chất tan rửa giải nhiệt độ thấp so với cột nhồi WCOT: chia làm loại • Lớp film mỏng: Bề dày lớp film ~ 0, μm, đường kính cột 0,1-0,32mm • Lớp film dày: bề dày lớp film 1-2 μm, đường kính 0,25-0,32 mm Hai loại có tên chung cột hẹp lịng • Cột rộng lòng: Lớp film dày 2-5 μm, đường kính 0,53mm Pha tĩnh sắc ký khí – lỏng: - Yêu cầu pha tĩnh lỏng: • • • • Áp suất thấp, tức có điểm sơi cao > 100 + Tmax Bền với nhiệt độ Trơ mặt hóa học Đặc tính dung môi đảm bảo hệ số k’ α chất phân tích nằm khoảng thích hợp - Nhóm dẫn chất polydimetyl siloxan - Nhóm polyethylen glycol (PEG): pha tĩnh phân cực Detector GC - Detector chọn lọc: Đáp ứng với đặc tính riêng biệt chất phân tích - Detector vạn năng: đáp ứng với tất chất tan Các yêu cầu Detector: • Đáp ứng nhanh lặp lại có mặt chất phân tích khí mang • Giới hạn phát cao, phát nồng độ khối lượng thấp chất phân tích • Tín hiệu đo tỷ lệ thuận với nồng độ khối lượng thấp chất phân tích • Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng III NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA DETECTOR FID (ION HÓA NGỌN LỬA) - Là detector sử dụng tin hiệu liên quan đến ion hóa chất rửa giải - Các chất hữu có khí mang đốt cháy - Q trình oxi hóa lửa phá electron với ion - Sản phẩm đốt cháy electron ion làm tăng độ dẫn điện lửa - Các electron ion tập hợp điện cực góp, dịng điện tạo tỷ lệ thuận với nồng độ ion có mặt khí mang đến lửa - Ưu nhược điểm: + Vạn năng, nhạy đáp ứng với tất chất hữu (trừ fomaldehyd, acid fomic chất halogen hóa hết) + Khoảng tuyến tính rộng, rộng detector sắc kí khí + Khơng đáp ứng với chất vơ (hơi nước, CO2, H2S, ) chúng khơng cháy IV KĨ THUẬT CHUẨN HĨA DIỆN TÍCH VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 37 - Hàm lượng % chất mẫu phân tích xác định tỉ số (%) diện tích pic thành phần tổng diện tích tất thành phần có mặt mẫu (trừ oic dm, thuốc thử thành phần có hàm lượng nhỏ giới hạn phát hiện) %A = - 𝑆𝐴 𝑆1 +𝑆2 +⋯+𝑆𝑛 100 Yêu cầu sử dụng pp này: + Tất thành phân mẫu phân tích phải rửa giải, xuất sắc kí đồ + Detector thiết bị phảo có đáp ứng với tất thành phần có mặt mẫu → khó đáp ứng, khơng đáng tin cậy → dùng hệ số đáp ứng detector với tùng thành phần mẫu Hệ số đáp ứng fi = nồng độ/diện tích Si Nồng độ thành phần j = diện tích pic Si x fj %A = V 𝑆𝐴 𝑓𝐴 𝑆1 𝑓1 +𝑆2 𝑓2 +⋯+𝑆𝑛 𝑓𝑛 100 ỨNG DỤNG SẮC KÍ KHÍ- LỎNG Định tính - So sánh thời gian lưu tR chất phân tích với chất chuẩn đối chiếu đk sắc kí Việc so sánh đáng tin cậy thực cột sắc kí có độ phan cực khác - So sánh sắc kí đồ chất phân tích vs mẫu phân tích thêm chuẩn đối chiếu - Kết nối máy sắc kí với IR vs MS Định lượng - Lập đường chuẩn với chất chuẩn đối chiếu mẫu thử - Thêm chuẩn đối chiếu vào mẫu phân tích - Nội chuẩn - Chuẩn hóa diện tích VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 38 CHƯƠNG 10: SẮC KÍ LỎNG MỤC TIÊU Trình bày sơ đồ hệ thống HPLC vai trò phận Trình bày chế tách pha dùng Sắc ký phân bố (Sắc ký phân bố pha thuận sắc ký phân bố pha đảo) Trình bày ứng dụng HPLC Nêu chế tách đánh giá phạm vi ứng dụng Sắc ký lớp mỏng I HỆ THỐNG HPLC Hệ thống cấp pha động: - Pha động HPLC thường dung dịch đệm, nước tinh khiết - MP hỗn hợp dung mơi hịa tan vào thành phần đong theo thể tích, trộn kĩ lọc bỏ tiểu phân > 0,45 μm - Có bọt khí -> giảm hiệu lực cột, biến dạng pic, nhiễu đường - Trước sử dụng cần lọc đuổi khí hòa tan pha động cách chạy siêu âm, sục khí trơ heli để tránh làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường - Hai chế độ dung mơi: • Chế độ đẳng dịng (isocratic): Thành phần pha động khơng thay đổi q trình sắc ký • Chế độ Gradient: Pha động hỗn hợp nhiều dung môi, thường 2-4 loại đựng bình khác Tỷ lệ thành phần thay đổi trình sắc ký theo chương trình định (chương trình dung mơi) - Có kiểu chương trình dung mơi: VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 39 + Chương trình dung mơi áp suất thấp Dung mơi Dung mơi Bộ phận hịa trộn Van mẫu Bơm Dung môi Ưu điểm: cần dùng bơm Nhược điểm: hệ thống van lấy dung môi phức tạp tốn + Chương trình dung mơi áp suất cao Dung mơi Bơm Dung môi Bơm Dung môi Bơm Bộ phận hòa trộn Van mẫu Ưu điểm: độ độ lặp cao Nhược điểm: tốn cồng kềnh loại hòa trộn áp suất thấp Hệ thống bơm Tạo áp suất cao để đẩy pha động với tốc độ dòng định Yêu cầu: • • • Hoạt động áp suất cao > 5000psi Đảm bảo lưu lượng lặp lại Không bị ăn mịn Các loại bơm: • • • Bơm đẩy pittong Bơm làm đầy nhanh Bơm kép đẩy kéo Hệ tiêm mẫu VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 40 - Dùng van tiêm mẫu - Tiêm mẫu tự động Cột sắc ký pha tĩnh • Cột nhồi: 3,5,10 μm • Cột bảo vệ • Pha tĩnh Detector - Dựa vào đáp ứng chọn lọc với chất phân tích: Detector UV-VIS, huỳnh quang - Dựa vào tính chất chung chất phân tích pha động: Detector số khúc xạ, độ dẫn điện - Yêu cầu Detector: - Đáp ứng nhanh lặp lại - Độ nhạy cao - Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng - Khoảng tuyến tính rộng - Ít thay đổi theo nhiệt độ tốc độ dòng - Một số loại detector chủ yếu: - Detector hấp thụ UV-VIS - Detector huỳnh quang - Detector số khúc xạ - Detector tán xạ bay - Detector đo dòng - Detector độ dẫn Detector hấp thụ UV-VIS - Dựa hấp thụ xạ UV-VIS chất phân tích cấu hình detector hấp thụ UV-VIS: + Detector đo bước sóng cố định: Nguồn sáng đèn thủy ngân đèn Wonfram cùn kính lọc để chọn số bước sóng 254, 280, 334, 436nm Kém linh hoạt rẻ + Detector đo bước sóng thay đổi: chọn bước sóng khoảng UV-VIS , cho phép lựa chọn bước sóng tối ưu detector chất phân tích Hệ thống tạo bước sóng đơn sắc bao gồm nguồn sáng đèn D2, đèn Wonfram, thiết bị đơn sắc hóa kết nối với ống nhân quang + Detector mảng diod (DAD): có mảng diod để nhận xạ tán sắc cách tử kẻ vạch lase Các loại detector khác: huỳnh quang, tán xạ bay hơi, đo dòng Bộ phận xử lý số liệu - Máy ghi - Máy tích phân - Máy tính phần mềm điều khiển II SẮC KÍ PHÂN BỐ - SẮC KÍ HẤP PHỤ VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 41 Sắc kí phân bố hiệu cao - Phân thành dạng phụ thuộc vào pha tĩnh + Sắc kí lỏng- lỏng: pha tĩnh chất lỏng bao quanh hạt chất rắn Chất phân tích liên quan đến phân bố pha lỏng + Sắc kí pha liên kết: pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang rắn (pha tĩnh phổ biến silica có nhóm OH liên kết với dẫn chất clorosilan tạo dẫn chất siloxan, gọi pha tĩnh liên kết) - Hiện sắc kí pha liên kết phổ biến nên nghiên cứu sắc kí pha liên kết a, Pha tĩnh - Loại pha tĩnh phổ biến chế tạo từ silica Bề mặt silica - Dẫn chất clorosilan Dẫn chất siloxan Tính chất phân cực pha tĩnh phụ thuộc vào gốc R + pha tĩnh không phân cực: R -CH2-(CH2)16-CH3: gốc octadecyl (C18) Tính khơng phân cực giảm dần -CH2-(CH2)6-CH3: gốc octyl (C8) -CH2-(CH2)2-C6H5: gốc phenyl propyl - Pha tĩnh phân cực: R -CH2-(CH2)2-CN: cyano -CH2-(CH2)-NH2: amino -CH2CH2OCH(OH)CH2OH: diol Độ phân cực tăng dần b, Sắc kí pha thuận pha đảo phụ thuộc vào độ phân cực tương đối pha động pha tĩnh: - Sắc kí pha thuận: pha tĩnh phân cực pha động Sắc kí pha đảo: pha động phân cực pha tĩnh (phổ biến hơn) c, Chọn pha tĩnh pha động - Để tách sắc kí phân bố thành cơng cần chọn điều kiện để cân lực tương tác pha động, pha tĩnh chất phân tích Độ phân cực thành phần tiêu mô tả định tính lực tương tác Với pha tĩnh: dựa vào nhóm R dẫn chất siloxan VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 42 - - Với pha động: dựa vào trị số P’ (bảng 10.2- t181) Với chất phân tích: dựa vào nhóm chức Độ phân cực nhóm chức tăng dần theo thứ tự: Hydrocacbon mạch thẳng < olefin < hydrocacbon thơm < dẫn chất halogen < sulfid < ether < dẫn chất nitro < ester ≈ aldehyd ≈ ceton < alcol ≈ amin < sulfon < sulfoxid < amid < aicd cacboxylic < nước Để tách sắc kí người ta chọn nguyên tắc sau: + Độ phân cực chất phân tích hợp với độ phân cực pha tĩnh khác xa độ phân cực pha động + Độ phân cực chất phân tích hợp với độ phân cực pha động khác xa độ phân cực pha tĩnh ** nguyên tắc xác suất thành công cao Nguyên tắc pha tĩnh khó cạnh tranh chất phân tích với pha động làm cho thời gian lưu ngắn d, Tính cân đối pic sắc kí Để đảm bảo cho pic sắc kí nhọn cân đối: - - Cột sắc kí: nên dùng cột bảo vệ để loại tạp chất có mặt mẫu pha động Pha động: cần dung dung môi tinh khiết Để giảm thiểu tượng kéo đi, với sắc kí base amin nên thêm vào pha động trietylamin 30mM, chúng liên kết với số vị trí hoạt động silisca nên ngăn chặn chất phân tích bị lưu giữ vị trí Giảm thể tích ngồi cột thể ticha bé pic bị giãn e, Triển khai sắc kí pha đảo chọn điều kiện cho sắc kí pha đảo: Xác định vài thơng số sắc kí: k’ từ đến Rs ≥ 0.9 ≤ AF≤ 1.5 Áp suất vận hàng không lớn - Chọn dung môi pha động: thường dùng MeCN, MeOH, THF - Nhiệt độ Sắc kí hấp phụ hiệu cao - Pha tĩnh: chất thường dùng phổ biến silica alumina (nhôm oxyd) + silica: nguyên liệu chất nhồi cho sắc kí pha thuận Có ưu điểm hấp phụ mạnh ổn định khoảng pH hẹp + alumina: có độ ổn định pH cao - Pha động: để rửa giải chất bị hấp phụ, ngta dùng dùng pha động có sức rửa giải khác Trị số eo lớn, sức rửa giải mạnh (bảng 10.5- T189) - Chất phân tích tranh chấp với pha động vị trí hấp phụ bề mặt pha tĩnh Chất phân tích bị lưu giữ tác dụng lực hấp phụ III ỨNG DỤNG CỦA HPLC - VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 43 Thử tinh khiết Định tính - Dựa vào tR - Kết hợp Detector DAD chồng phổ chất chuẩn chất thử Định lượng Nồng độ chát phân tích tỉ lệ với diện tích chiều cao pic 𝐶𝑥 𝑆𝑥 ℎ𝑥 = = 𝐶𝑐 𝑆𝑐 ℎ𝑐 IV SẮC KÍ LỚP MỎNG Nguyên tắc: - Là hệ sắc ký lỏng rắn - Cơ chế tách: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion, loại cỡ - Đặc trưng hệ số lưu giữ Rf 𝑅𝑓 = 𝑑𝑅 𝑑𝑀 dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích dM: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động Rf = (0-1) - Pha tĩnh: o Kích thước hạt: 10-30 μm o Bề dày: 250 μm o Kích thước mỏng: 5-20cm - Pha động Dung mơi có độ tinh khiết cao Cần điều chỉnh sức rửa giải MP cho 0,2 < Rf < 0,8 Chất phân tích dạng ion hay phân cực rửa giải tốt dung môi phân cực Khi dùng silicagen chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực pha động định tốc độ di chuyển chất phân tích vị trí Rf chúng Ứng dụng: a Định tính: - Dựa vào trị số Rf mẫu thử mẫu chuẩn chạy sắc ký điều kiện - Đôi đo sắc ký liên tục không xác định tuyến dung môi pha động, người ta dùng hệ số lưu giữ tương đối Rr o o o o 𝑑 𝑅𝑟 = 𝑑𝑅,𝑥 𝑅,𝑐 𝑑𝑅,𝑥 : đườ𝑛𝑔 đ𝑖 𝑐ủ𝑎 𝑐ℎấ𝑡 𝑝ℎâ𝑛 𝑡í𝑐ℎ (𝑐𝑚) 𝑑𝑅,𝑐 : Đườ𝑛𝑔 đ𝑖 𝑐ủ𝑎 𝑐ℎấ𝑡 𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛 (𝑐𝑚) 𝑅𝑟 : 𝑐à𝑛𝑔 𝑔ầ𝑛 𝑐ℎấ𝑡 𝑝ℎâ𝑛 𝑡í𝑐ℎ 𝑣à 𝑐ℎấ𝑡 𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑐à𝑛𝑔 đồ𝑛𝑔 𝑛ℎấ𝑡 b Thử tinh khiết: thể vết lạ sắc ký đồ VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 44 c Định lượng: cách - Tách chiết chất phân tích vết sắc ký dung mơi thích hợp (ít dùng, có nhiều trở ngại, nhiều thời gian) - Định lượng trực tiếp mỏng CHƯƠNG 14: KĨ THUẬT XỬ LÍ MẪU MỤC TIÊU Giải thích nguyên tắc phân hủy mẫu nhiệt kết hợp với chất oxi hóa Trình bày kỹ thuật loại chất cản trở xử lý mẫu: Chiều lỏng-lỏng, chiết lỏng-rắn, chiết pha rắn Nêu ứng dụng kỹ thuật xử lý mẫu phục vụ phân tích Dược Làm tập liên quan tới Chiết xuất NGUYÊN TẮC PHÂN HỦY MẪU BẰNG NHIỆT KẾT HỢP VỚI CÁC CHẤT OXI HÓA I Khi phân hủy mẫu vơ tỏng bình hở thường dùng acid mạnh nhiệt độ điểm sôi thuốc thử Trong q trình phân hủy mẫu diễn phản ứng oxy hóa, thủy phân cắt liên kết ester, amid, II CÁC KĨ THUẬT XỬ LÍ MẪU Kết tủa - Thường dùng để tách chất phân tích khỏi mẫu phục vụ định lượng - Điện kết tủa: + Dùng mạch điện phân + Kim loại dễ bị khử tách điện cực làm việc + Những KL dễ bị khử Zn (KL kiềm, kiềm thổ, Al, Be) thường tách điện cực thủy ngân + Có thể phân tích khối lượng cách cân điện cực trước sau điện phân - Kết tủa protein + Kết tủa acid: thường dùng acid tricloracetic, cịn dùng HclO4 + Kết tủa dung mơi hữu cơ: thường dùng Metanol, Etanol acetonitril Cất Dùng để tách thành phần hệ số phân bố pha hơi- dung dịch chúng khác nhiều Chiết lỏng- lỏng - Là kĩ thuật xử lĩ mẫu phổ biến - Dùng để chuyển chất phân tích hịa tan dung mơi sang dung mơi khác khơng hịa tan dung mơi thứ VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 45 a, Nguyên tắc - Hằng số phân bố D: tỉ số hoạt độ (nồng độ) chất A pha nước pha dung môi D= [𝐴]𝑠 [𝐴]𝑛 [A]s: nồng độ chất A pha dung môi [A]n: nồng độc chất A pha nước - Hệ số phân bố d: tỉ số tổng nồng độ chất A pha dung môi tổng nồng độ chất A pha nước d= - ∑[𝐴]𝑠 ∑[𝐴]𝑛 Hiệu suất chiết R: đặc trung quan trọng cho q trình chiết Giả sử có ao milimol chất A hòa tan Vn ml nước Chiết từ dung dịch Vs ml dung môi Khi cân lại a1 milimol pha nước ao-a1 milimol pha dung môi 𝑟 Với r = Vn/Vs, ta có a1 = (𝐷+𝑟)ao Tương tự, với n lần chiết Vs ml dung mơi ta có an = ( 𝑟 𝐷+𝑟 )𝑛 ao Sai số sau n lần chiết: ∆𝑛 = 𝑎𝑛 𝑟 𝑛 =( ) 𝑎𝑜 𝐷+𝑟 Rn = - ∆ 𝑛 - Để hiệu suất chiết cao nhất: + Diện tích tiếp xúc bề mặt pha lớn + Thời gian tiếp xúc đủ lâu + Hằng số D lớn + Tỉ lệ Vs/Vn đủ lớn (r nhỏ) VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 46 b, Chiết acid - Khi lắc HA phân li nước N với dung môi S, tồn cân bằng: N HA n S HAs H+ + A- ka = [𝐻+]𝑛 [𝐴−]𝑛 [𝐻𝐴]𝑛 [𝐻𝐴] DHA = [𝐻𝐴] 𝑠 𝑛 - Trước chiết, nồng độ toàn phần CHA dung dịch acid: CHA = [HA]n + [A-]n Sau chiết dung môi S: CHA = [HA]n + [A-]n + [HA]s/r Hiệu suất chiết sau lần 1: R1 = [𝐻𝐴]𝑠 𝑟 - [𝐻𝐴]𝑠 /𝑟 + [𝐻𝐴]𝑛 + [𝐴−]𝑛 = 𝑟 𝑘𝑎 1+ (1+[𝐻+] ) 𝐷 Hiệu suất chiết acid tỉ lệ thuận với số D, tỉ lệ nghịch với pH dung dịch nước Sai số chiết: 𝑟 𝑛 ∆𝑛 = ( ) 𝑑+𝑟 - Hiệu suất chiết sau n lần: Rn = - ∆ 𝑛 = − ( 𝑟 𝑑+𝑟 )𝑛 c, Chiết base yếu - Xây dựng công thức tương tự với chiết acid R1 = 𝑟 𝑘𝑏 1+ (1+[𝑂𝐻−]) 𝐷 d, Chiết cặp ion: Nguyên tắc: Khi cho ion tác dụng với ion trái dấu, chuyển động nhiệt dung dịch, pH thích hợp hình thành cặp ion giống phân tử trung hòa điện chiết dung môi hữu A- (n) + B+ (n) A-B+ (n) A-B+ (s) A- gọi đối ion B ngược lại - Đối với anion: có tính kỵ nước đủ mạnh • • • Heliantin dạng base Chất diện hoạt natri laurylsulfat Tetraphenylborat - Đối với cation: thường dùng amonium bậc 3,4 • Muối amoni bậc mạch dài VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 47 • • Dẫn chất amin có phân tử lượng cao Dẫn chất phẩm màu base: dẫn xuất azo (vàng metyl), dẫn xuất phenothoiazin (xanh metylen) - Điều kiện cần tạo chiết cặp ion: pKa – ≤ pH ≤ 16-pKb - Điều kiện tối ưu để chiết cặp ion: pKa + ≤ pH ≤ 12 – pKb Ưu tiên lựa chọn điều kiện pH để chất phân tích ion hóa nhiều nhất, chất màu thường dùng dư nhiều trình tạo cặp e Các kĩ thuật chiết xuất: - Chiết gián đoạn: chiết bình chiết lần hay nhiều lần từ mẫu chiết Chiết liên tục: dung môi liên tục qua mẫu chiết dạng rắn lỏng Chiết ngược dịng: dung mơi chiết mà mẫu chiết ngược chiều nhau, pha liên tục tiếp xúc với nhau, pha trộn vào VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 48 ... Ag+ Điện cực Hydro : Pt, H2|H+ 2H+ + 2e ↔ H2 → E2H+/H2 = (0,059 /2) lg([H+ ]2/ pH2) Nếu : PH2 = atm : E2H+/H2 = - 0,059 pH → dùng làm điện cực thị đo pH Điện cực loại 2: + Cấu tạo : gồm kim loại... phenyl propyl - Pha tĩnh phân cực: R -CH2-(CH2 )2- CN: cyano -CH2-(CH2)-NH2: amino -CH2CH2OCH(OH)CH2OH: diol Độ phân cực tăng dần b, Sắc kí pha thuận pha đảo phụ thuộc vào độ phân cực tương đối pha... cần phân tích (do phản ứng với chất phân tích) , Phát anion cation VITAMIN DƯỢC - TEAM HỌC TẬP TND 14 CHƯƠNG 12 PHÂN TÍCH ĐO ĐIỆN THẾ MỤC TIÊU HỌC TẬP Giới thiệu mạch điện hóa nguyên tắc phân tích