Tách chiết và tinh sạch hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ chủng aspergillus niger

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HOA MAI TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ỨC CHẾ ALPHA GLUCOSIDASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS NIGER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2022 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HOA MAI Mã sinh viên: 1701365 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ỨC CHẾ ALPHA GLUCOSIDASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS NIGER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đỗ Thị Tuyên TS Đào Thị Mai Anh Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa Sinh Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể thầy giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, người dạy dỗ cho em kiến thức quý báu suốt thời gian em học tập rẻn luyện trường Em xin chân thành cảm ơn thầy mơn Hóa Sinh thầy anh chị phịng Công nghệ sinh học Enzym tạo điều kiện thuận lợi tận tình hướng dẫn em trình thực tập, nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Tuyên, người trực tiếp bảo, hướng dẫn em tận tình từ kiến thức chuyên mơn, hình thành ý tưởng nghiên cứu đến thực bước nghiên cứu thực nghiệm trình nghiên cứu khoa học Lời động viên khích lệ trình nghiên cứu tiếp thêm động lực cho em, giúp em tự tin, dũng cảm đường nghiên cứu khám phá khoa học Đặc biệt, em xin bày tỏ lịng kính trọng lịng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Mai Anh Cô không người thầy giúp em định hướng, học tập nghiên cứu khoa học, cho em lời khuyên quý báu, giúp em hình thành lối suy nghĩ nghiên cứu, mà cịn người bạn chia sẻ, truyền cảm hứng lượng tích cực cho em sống Những lời khuyên, học hành trang q giá để em tự tin, vững chãi bước đường nghiệp sống sau Để đến thời khắc thiếu giúp đỡ nhiệt tình TS Nguyễn Thị Thảo bạn Tùng, Chiến, em Linh anh chị, bạn bè phịng thí nghiệm cho cho em lời khuyên lời động viên quý giá, sát cánh đồng hàng em suốt trình nghiên cứu khoa học Em xin cảm ơn tới dự án: “Phân lập, tuyển chọn tinh số hoạt chất thứ cấp ức chế α- glucosidase định hướng ứng dụng điều trị bệnh đái tháo đường typ II từ chủng vi sinh vật phân lập Việt Nam.” Mã số: KHCBSS.01/19-21 cấp kinh phí để thực nghiên cứu Cuối em xin cảm ơn bố mẹ, người thân gia đình tất bạn bè bên cạnh tiếp sức mạnh cho em chặng đường em tiếp cho em thêm sức mạnh để bước tiếp đường chọn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Trần Thị Hoa Mai MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh Đái tháo đường 1.1.1 Khái niệm .2 1.1.2 Phân loại .2 1.1.3 Cơ chế bệnh sinh biến chứng 1.1.4 Các nguyên tắc điều trị bệnh đái tháo đường .4 1.2 Enzym α-glucosidase 1.2.1 Giới thiệu chung enzym α -glucosidase 1.2.2 Cấu trúc enzym α-glucosidase .9 1.2.3 Vai trò chế hoạt động enzym thể 1.3 Chất ức chế α-glucosidase .10 1.3.1 Khái niệm chế hoạt động chất ức chế enzym α-glucosidase 10 1.3.2 Phân loại chất ức chế enzym α-glucosidase .12 1.3.3 Nguồn gốc chất ức chế enzym α-glucosidase 12 1.4 Chủng nấm sợi Aspergillus niger 14 1.4.1 Phân loại sinh học .14 1.4.2 Các đặc điểm sinh học 15 1.4.3 Điều kiện nuôi cấy 15 1.5 Tình hình nghiên cứu nước quốc tế 15 1.5.1 Trên giới .15 1.5.2 Ở Việt Nam 17 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị .18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 18 2.1.3 Hóa chất 18 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm .19 2.1.5 Môi trường nuôi cấy 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Nuôi cấy chủng giống 20 2.3.2 Xác định hoạt tính chất ức chế α-glucosidase 20 2.3.3 Tách chiết, tinh hoạt chất ức chế enzym α-glucosidase .21 2.3.4 Xác định giá trị IC50 24 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 24 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 Kết 25 3.1.1 Nuôi cấy sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase chủng A niger VTCC-031 25 3.1.2 Tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A niger VTCC-031 25 3.1.3 Tinh hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A niger VTCC-031 27 3.1.3.1 Tinh hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A.niger VTCC-031 pha nước qua cột sắc ký lọc gel 27 3.1.3.2 Kết chọn lựa hệ dung môi pha động chạy SK cột silica gel 28 3.1.3.3 Tinh hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A.niger VTCC-03 pha dung môi qua cột sắc ký silica gel 60 30 3.1.4 3.2 Xác định IC50 mẫu có hoạt tính ức chế α-glucosidase 33 Bàn luận 35 3.2.1 Về kết tách chiết hoạt chất AGIs từ chủng A.niger VTCC-031 36 3.2.2 Về kết tinh AGIs từ chủng A.niger VTCC-031 37 CHƯƠNG KẾT LUẬN 39 CHƯƠNG KIẾN NGHỊ .39 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ADA AGIs DNJ American Diabetes Association Alpha-glucosidase inhibitors 1-deoxynojirimycin Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ Các chất ức chế α-glucosidase 1-deoxynojirimycin ĐTĐ Diabetes mellitus Đái Tháo Đường DC ĐC Cắn n-butanol hòa tan CHCl3 Đối chứng EtOAc HPLC Ethyl acetat High-performance liquid Ethyl acetat Sắc ký lỏng hiệu cao IC50 chromatography The half maximal inhibitory Nồng độ ức chế 50% concentration IDF International Diabetes Federation n-BuOH n- Butanol Hiệp hội Đái tháo đường giới n- Butanol OD405 Optical density at 405nm TLC Thin layer chromatography Mật độ quang học mẫu bước sóng 405nm Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Mục tiêu điều trị cho BN ĐTĐ người trưởng thành, khơng có thai Bảng 1.2 Các thuốc điều trị ĐTĐ đường uống Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng 18 Bảng 2.2 Thành phần loại đệm dung dịch 19 Bảng 2.3 Thiết bị thí nghiệm 19 Bảng 3.1 Kết xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase dịch lên men Bảng 3.2 Tóm tắt bước đầu trình tinh thu nhận hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A.niger VTCC 031 Bảng 3.3 Hoạt tính ức chế α-glucosidase nồng độ khác mẫu TLC2 Bảng 3.4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase nồng độ khác mẫu acarbose tinh khiết 25 32 33 34 DANH MỤC CÁC HÌNH Thứ tự Tên hình Hình 1.1.Cơ chế tác dụng thuốc điều trị ĐTĐ typ Hình 1.2 Lược đồ lựa chọn thuốc phương pháp điều trị ĐTĐ typ Hình 1.3 Cấu trúc tiểu phần N tận (A) C tận (B) phân tử α-glucosidase [44], [49] Hình 1.4 Vai trò thuốc ức chế men α-glucosidase Trang 10 việc kiểm soát tăng đường huyết sau ăn Hình 1.5 Cấu trúc hoạt chất acarbose, miglitol, voglibose Hình 1.6 Cấu trúc dẫn chất monosaccharide Hình 1.7 Aspergillus niger 12 14 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 20 Hình 2.2 Khảo sát bước đầu tinh hoạt chất ức chế enzym α-glucosidase từ pha nước 22 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình 2.3 Các bước tiến hành tinh hoạt chất ức chế αglucosidase từ chủng A niger VTCC 031 Hình 3.1 Kết ức chế α-glucosidase pha dung môi khác chiết lỏng-lỏng với dịch lên men Hình 3.2 Kết ức chế α-glucosidase pha nước sau chiết lỏng-lỏng với dung môi khác Hình 3.3 Hoạt tính ức chế α-glucosidase phân đoạn từ 410 sau qua cột sephacryl S-200 Hình 3.4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase phân đoạn từ 410 sau qua cột sephadex G-100 Hình 3.5 Hoạt tính ức chế α-glucosidase phân đoạn từ 410 sau qua cột sephadex G-25 Hình 3.6 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra khả tách phân đoạn có hoạt tính ức chế α-glucosidase sau qua cột sephacryl S-200, sephadex G100, sephadex G-25 Hình 3.7 Khả tách chất mẫu dịch chiết sử dụng hệ dung mơi khác Hình 3.8 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh phân đoạn qua cột silica gel lần thứ Hình 3.9 Mẫu vết sau cạo kiểm tra TLC Hình 3.10 Kiểm tra độ tinh trình TLC 11 23 26 26 27 28 28 29 30 31 32 33 21 22 Hình 3.11 Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế αglucosidase mẫu TLC2 Hình 3.12 Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế αglucosidase acarbose tinh khiết 34 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Những năm gần đây, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường (ĐTĐ), bệnh rối loạn chuyển hóa mạn tính, tăng nhanh liên tục khiến cho bệnh trở thành vấn đề sức khỏe toàn cầu gánh nặng kinh tế cho nhiều quốc gia toàn giới Năm 2021, theo báo cáo Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế (IDF) số người trưởng thành mắc đái tháo đường 537 triệu người xu hướng tăng lên 783 triệu người vào năm 2045 [31], [12], [27] ĐTĐ xem đại dịch không lây nhiễm với tỷ lệ tử vong xếp hàng thứ sau bệnh ung thư tim mạch Theo nghiên cứu gần đây, ĐTĐ coi yếu tố làm tăng nguy nhiễm trùng máu mà thúc đẩy tiến triển nhanh chóng nguy tiên lượng nặng bệnh nhân mắc COVID-19 [4] Các chất ức chế alpha glucosidase (AGIs) sử dụng rộng rãi lâm sàng để điều trị ĐTĐ typ với mục đích làm giảm đường huyết sau ăn, bảo vệ bệnh nhân tránh khỏi biến chứng tim mạch giảm tỷ lệ tử vong bệnh nhân ĐTĐ biến chứng nguy hiểm Mặc dù, AGIs truyền thống acarbose voglibose kiểm sốt tốt đường huyết sau ăn, nhiên tác dụng không mong muốn thuốc phần hạn chế việc sử dụng chúng lâm sàng Do đó, thập kỷ gần đây, nhà khoa học nỗ lực để tìm kiếm AGIs mới, vừa có tác dụng điều trị tốt mà lại tác dụng khơng mong muốn Bên cạnh nguồn tổng hợp Hóa Dược, xu hướng giới Việt Nam quan tâm trọng việc nghiên cứu phát triển loại thuốc hạ đường huyết có nguồn gốc sinh học, đặc biệt sinh tổng hợp chất từ nấm vi khuẩn Trong số vi sinh vật tiềm năng, nấm Aspergillus chủng nghiên cứu sinh tổng hợp chất ức chế enzym α-glucosidase ứng dụng để điều trị bệnh ĐTĐ [19] Mặc dù vậy, Việt Nam, nghiên cứu cứu hợp chất ức chế enzym α-glucosidase từ chủng Aspergillus hạn chế, có số nghiên cứu Phạm Minh Hồng (2020) [5], Bùi Hồng Sơn (2021) [6], bước đầu nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger Chính vậy, đề tài “Tách chiết tinh hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ chủng Aspergillus niger” tiến hành để mở rộng nghiên cứu chủng nấm tiềm Việt Nam, giúp mở hướng điều trị ĐTĐ an toàn, hiệu Đề tài tiến hành nhằm đạt mục tiêu sau: Lựa chọn dung môi tách chiết hợp chất ức chế α-glucosidase từ chủng A niger VTCC-031 Lựa chọn điều kiện tinh chế hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A niger VTCC-031 Tiến hành chạy sắc ký mỏng (TLC) phân đoạn từ 5-10 để xác định độ tinh phân đoạn với hệ dung môi isopropanolol: acid acetic: nước = 4:1:1, màu thuốc thử ninhydrin 2% để xác định vết có hoạt chất có hoạt tính ức chế α-glucosidase Kết trình bày Hình 3.6 Chú thích: DLC: Pha nước S5-S10: phân đoạn có hoạt tính sau qua cột sephacryl S-200 G5-G10: phân đoạn có hoạt tính sau qua cột sephadex G100 G4-G11: phân đoạn có hoạt tính sau qua cột sephadex G-25 Hình 3.6 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra khả tách phân đoạn có hoạt tính ức chế α-glucosidase sau qua cột sephacryl S-200, sephadex G100, sephadex G-25 Từ kết chạy TLC kết hợp với kết đo hoạt tính phân đoạn sau khảo sát qua cột có kích thước khác cho thấy cột sephadex G-25 có khả tách loại tạp, cho vết rõ ràng gọn hai cột sephacryl S-200, sephadex G-100 3.1.3.2 Kết chọn lựa hệ dung môi pha động chạy sắc ký cột silica gel Để lựa chọn dung môi pha động cho cột sắc ký silica gel G60 cho bước tinh Tiến hành chạy sắc ký mỏng (TLC) với hệ dung môi khác Kết TLC thu chạy song song mẫu dịch chiết n-butanol (n-Bu) dịch lên cột (DLC), màu iod, kết chụp ảnh ánh sáng trắng trình bày Hình 3.7 29 Chú thích: (I): n- BuOH: acid acetic: H2O = 3:1:1 (II) n- BuOH: acid acetic: H2O = 5:1:4 (III) n- BuOH: acid acetic: EtOAc: H2O = 3:1:3:1 (IV) n- BuOH: acid acetic: EtOAc: H2O = 3:1:5:1 (V) Hexan: EtOAc: acid acetic = 1:4:2 Hình 3.7 Khả tách chất mẫu dịch chiết sử dụng hệ dung môi khác Từ kết Hình 3.7 cho thấy hệ dung mơi cho khả tách chất Tuy nhiên hệ dung môi (I) (II) cho khả tách chất không rõ ràng bị kéo vết, hệ (III), (IV), (V) có khả tách chất tốt cho vết gọn hơn, hệ (III) hệ (V) tách tốt hệ (IV) Mặc dù hệ (V) cho kết tách nhiều vết gọn rõ ràng nhất, n-hexan dung môi phân cực nên khơng kéo tồn chất lên theo dung mơi (vị trí chấm mẫu cịn đậm) Mặt khác, n-hexan dung môi độc hại gây ảnh hưởng nhiều đến trang thiết bị môi trường nên không phù hợp với mục đích nghiên cứu nâng cao quy mơ chiết xuất tinh hoạt chất ức chế αglucosidase sau nên chúng tơi lựa chọn hệ (III) làm dung môi để tiến hành bước đầu tinh qua cột sắc ký silica gel 60 lần 3.1.3.3 Tinh hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A.niger VTCC-03 pha dung môi qua cột sắc ký silica gel 60 Sau khảo sát bước đầu qua sắc ký mỏng TLC chọn hệ dung môi phù hợp để làm pha động chạy sắc ký cột hệ (III) n- BuOH: acid acetic: EtOAc: H2O = 3:1:3:1 Tiến hành tinh sơ qua cột silica gel 60 lần theo phương pháp trình bày phần 2.3.3.2 Sau lần qua cột thứ nhất, phân đoạn chạy sắc ký mỏng với hệ dung môi (III) màu với iod Kết thu phân đoạn sau tinh hiển thị mỏng TLC trình bày Hình 3.8 30 Chú thích: DLC: cắn quay hòa tan MeOH n-BuOH: dịch chiết n-butanol 1-19: phân đoạn thu sau tinh qua cột silica gel lần thứ Hình 3.8 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh phân đoạn qua cột silica gel lần thứ Từ kết TLC nhận thấy, phân đoạn sau qua cột lần so với dịch chiết n-butanol dịch lên cột cho kết vết tách rõ gọn hơn, không bị kéo vết dài chứng tỏ qua trình chiết xuất n-butanol hịa tan chloroform, methanol loại số tạp không tan dung môi Tuy nhiên sau qua cột silica gel lần với hệ dung môi chọn cịn vết chưa tinh Do điều kiện thí nghiệm thời gian có hạn, bước đầu tinh hoạt chất AGIs để xác định vết có hoạt tính ức chế ức chế α-glucosidase, tiến hành chạy TLC song song phân đoạn số 11, lặp lại 10 lần; mỏng màu iod mỏng lại cạo vết thông qua vết màu mẫu iod Hình 3.8, gồm vết hiển thị rõ với iod TLC Tiến hành chạy TLC đo hoạt tính ức chế αglucosidase mẫu vừa thu (TLC1 có Rf = 0,24; TLC2 có Rf = 0,65; TLC3 có Rf = 0,94) Ba vết cạo hòa tan 1ml methanol, ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút, 4°C thu dịch chấm sắc ký với hệ dung môi pha động n-butanol: acid acetic: ethyl acetat: nước = 3:1:3:1 (Hình 3.9) 31 Hình 3.9 Mẫu vết sau cạo kiểm tra TLC Sau cạo vết kiểm tra vết TLC2 có hoạt tính ức chế α-glucosidase đạt 39,31%, hai vết cịn lại gần khơng có hoạt tính ức chế α-glucosidase Kết sở khoa học cho bước nghiên cứu tinh Kết tổng quát hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu từ dịch lên men đến vết TLC2 trình bày tóm tắt Bảng 3.2 kiểm tra trình TLC Hình 3.10 Bảng 3.2 Tóm tắt bước đầu q trình tinh thu nhận hoạt chất ức chế αglucosidase từ chủng A.niger VTCC 031 Mẫu Khối lượng cắn khơ (g) Hoạt tính ức chế αglucosidase (%) Dịch lên men (ban đầu) 2,52 67,24 Dịch n-butanol 1,23 37,5 0,0005 39,31 Vết TLC2 32 Chú thích: NC: dịch lên men n-Bu: dịch chiết n-butanol DC: cắn CHCl3 DLC: cắn Methanol 11: phân đoạn 11 sau tinh lần qua cột silicagel Hình 3.10 Kiểm tra độ tinh trình TLC 3.1.4 Xác định IC50 mẫu có hoạt tính ức chế α-glucosidase Sau cạo vết tiến hành đo hoạt tính, nhận thấy vết TLC2 có hoạt tính ức chế α-glucosidase, tiến hành pha thành mẫu C1 đến C5 với nồng độ khác DMSO Các mẫu xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase Kết thể Bảng 3.3 Bảng 3.3 Hoạt tính ức chế α-glucosidase nồng độ khác mẫu TLC2 STT Mẫu Nồng độ (µg/ml) Hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) C1 C2 333,33 666,67 2,08 3,74 C3 C4 C5 1000,00 1333,33 1666,67 5,38 8,56 10,35 Từ kết trên, tiến hành dựng đường chuẩn thể cho hoạt tính ức chế α-glucosidase vết TLC2 Hình 3.11 xác định giá trị IC50 = 7873,72 µg/ml 33 12.00 y = 0.0064x - 0.3918 R² = 0.9849 Hoạt tính ức chế (%) 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Nồng độ (µg/ml ) Hình 3.11 Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu TLC2 Đồng thời IC50 acarbose tinh khiết (Sigma) xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase Kết thể Bảng 3.4 Bảng 3.4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase nồng độ khác mẫu acarbose tinh khiết STT Mẫu Nồng độ (µg/ml) Hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) C1 C2 C3 C4 C5 10 30 50 70 90 34,18 51,20 63,32 77,27 90,31 Từ kết trên, tiến hành dựng đường chuẩn thể cho hoạt tính ức chế α-glucosidase acarbose tinh khiết (Sigma) Hình 3.12 xác định IC50 acarbose 30,83 µg/ml 34 100.00 y = 0.6917x + 28.673 R² = 0.9971 90.00 Hoạt tính ức chế (%) 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Nồng độ (µg/ml ) Hình 3.12 Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase acarbose tinh khiết Từ kết quả, ta thấy giá trị IC50 mẫu TLC2 (7873,72 µg/ml) so với đối chứng dương acarbose tinh khiết (30,83 µg/ml) cao nhiều 3.2 Bàn luận Trong năm trở lại đây, với phát triển kinh tế, tỷ lệ bệnh nhân mắc ĐTĐ tăng cao liên tục nhiều quốc gia toàn giới Thực tế đáng buồn đặt thách thức cho nhà khoa học việc tìm thuốc ứng dụng điều trị ĐTĐ Theo báo cáo, nhóm thuốc điều trị ĐTĐ typ sử dụng lâm sàng biguanid, sulfonylure, chất ức chế DPP-4, chủ vận SGLT2, meglitinid, thiazolidin, chất ức chế alpha-glucosidase, chất chủ vận amylin, [11] Mặc dù nhóm ức chế α-glucosidase (AGIs) chưa xem nhóm thuốc lựa chọn đầu tay điều trị ĐTĐ typ chúng có tầm quan trọng đáng kể việc kiểm soát bệnh với vai trị kiểm sốt tốt đường huyết sau ăn, không gây hạ đường huyết, không làm tăng trọng lượng thể nhóm thuốc khác [32] Tuy nhiên, AGIs sử dụng lâm sàng gây tác dụng không mong muốn đường tiêu hóa đầy hơi, chướng bụng, khó chịu, tiêu chảy,… Thậm chí có số báo cáo trường hợp tổn thương gan tăng transaminase gan (AST ALT) liên quan đến sử dụng AGIs bệnh nhân ĐTĐ typ [15], [17] Để hạn chế tác dụng không mong muốn việc tìm AGIs ln thu hút nhà khoa học Hiện nay, AGIs tổng hợp nhiều đường khác như: chiết xuất từ thực vật, tổng hợp đường hóa học đường sinh học nhờ vi sinh vật Trong xu hướng sinh tổng hợp AGIs từ vi sinh vật nhận nhiều quan tâm vi sinh vật nguồn nguyên liệu phong phú có sẵn từ tự nhiên, chứa hợp chất hoạt tính sinh học dễ sản xuất (bởi khả sinh 35 trưởng nhanh) hiệu kinh tế đường khác Cho đến có nhiều công bố phát chất ức chế α-glucosidase sinh tổng hợp từ chi Aspergillus chủng: A flavus, A niger, A terreus, A awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae Khơng nằm ngồi xu hướng này, Phịng Cơng nghệ Sinh học Enzyme, viện Công nghệ Sinh học thực chuỗi đề tài nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn tinh số hoạt chất thứ cấp ức chế α- glucosidase định hướng ứng dụng điều trị bệnh đái tháo đường typ từ chủng vi sinh vật phân lập Việt Nam từ chi Aspergillus Phạm Minh Hồng (2020) [5] lựa chọn chủng giống Aspergillus niger VTCC-031 có khả sinh tổng hợp chất ức chế α- glucosidase từ 30 chủng A.niger Là phần chuỗi đề tài lớn thực hiện, đề tài lựa chọn dung môi tách chiết xây dựng bước đầu tinh hoạt chất AGIs từ chủng Aspergillus niger VTCC-031 Kết xác định hoạt tính ức chế α- glucosidase dịch nuôi cấy Aspergillus niger VTCC-031 kết nghiên cứu tương tự trước [5] chứng minh vi sinh vật nội địa nguồn cung cấp AGIs đầy tiềm 3.2.1 Về kết tách chiết hoạt chất AGIs từ chủng A.niger VTCC-031 Năm 2016, Singh cộng khảo sát ảnh hưởng dung môi khác (dietyl ete, butanol, ethyl acetat, cloroform hexan) để xác định dung môi tốt để chiết AGIs từ chủng A.awamori, kết chọn ethyl acetat cho hiệu chiết tốt thu pha nước [50] Cùng năm Dewi cộng sử dụng ethyl acetat để chiết AGIs từ chủng A.aculeatus [19] Tuy nhiên chủng khác có điều kiện sinh tổng hợp AGIs khác Dựa sở nghiên cứu dung môi tách chiết trước đó, chủng A.niger, chúng tơi tiến hành khảo sát lại dung môi tách chiết dịch lên men với dung mơi có độ phân cực khác: n-butanol, ethyl acetat, cloroform, n-hexan đem đo hoạt tính dịch chiết pha phát AGIs phân bố hai pha nước dung môi Kết thu hoạt tính cao pha nước chiết với ethyl acetat, hồn tồn phù hợp với cơng bố Singh cộng (2016) hoạt tính cao pha dung mơi sử dụng n-butanol có khác biệt so với công bố Dewi (2016), điều hiểu chủng khác có sinh tổng hợp AGIs khác hiệu tác chiết khác dung môi Từ đó, chúng tơi đưa dự đốn ban đầu độ phân cực khả tách chất AGIs khảo sát dung môi để làm tiền đề cho bước tinh Ở pha nước, AGIs chất phân cực có hoạt tính ức chế αglucosidase cao đạt 64,71% Ở pha dung mơi, AGIs chất phân cực có hoạt tính ức chế α- glucosidase đạt 37,5% nên thực khảo sát nhằm tối ưu hóa hệ dung mơi với tỷ lệ khác để tìm hệ dung mơi phù hợp để tinh sơ qua cột sắc kí silica gel lần 36 3.2.2 Về kết tinh AGIs từ chủng A.niger VTCC-031 Trong trình tinh hoạt chất AGIs từ pha nước pha dung môi, nhận thấy hai pha thể hoạt tính ức chế enzym nên chúng tơi sử dụng phương pháp phù hợp để tinh hoạt chất hai pha 3.2.2.1 Tinh pha nước Trong pha nước, có nhiều tạp tan nước đường, acid amin, protein,… nên để tinh AGIs, cần lựa chọn phương pháp điều kiện phù hợp Theo số nghiên cứu trước, Kang cộng (2013) báo cáo hoạt chất ức chế AGIs có chất peptid tinh từ chủng A.oryzae N159-1 từ pha nước [30] Singh cộng (2016) công bố peptid có khối lượng 22kDa có khả ức chế kép hai enzym α-amylase α-glucosidase tách chiết từ chủng có A Awamori Từ sở chúng tơi dự đốn pha nước AGIs peptid protein phân tử lượng thấp Đây lý chúng tơi lựa chọn sắc ký lọc gel với kích thước mắt sàng khác để tinh hoạt chất AGIs từ pha nước Các phân đoạn thu sau qua ba cột sắc ký lọc gel sephacryl S-200, sephadex G-100 sephadex G-25 kiểm tra hoạt tính ức chế α- glucosidase phát phân đoạn 4-10 có hoạt tính sử dụng sắc ký mỏng để nhận biết sơ phân tách chất dùng thuốc thử ninhydrin để nhận biết có mặt peptid protein phân tử lượng thấp Đúng dự kiến, sau màu thuốc thử ninhydryn, sắc ký đồ thể vết vết bắt màu hồng màu tím, chứng tỏ dịch tinh chứa hoạt chất AGIs có chất peptid protein phân tử lượng thấp Tuy nhiên với bước đầu sơ phát tinh hoạt chất AGIs nên vết hiển thị TLC chưa thực tách rõ ràng cịn bị kéo vết với hệ dung mơi Do cần khảo sát thêm hệ dung mơi khác tìm dung mơi tối ưu để thu hiệu tốt để xác định chất hoạt chất AGIs tiến hành điện di để xác định kích thước phân tử phân đoạn cho hoạt tính cao định lượng nồng độ protein mẫu sau khảo sát qua cột Từ làm tảng để tiếp tục nghiên cứu tìm phương pháp phù hợp để tiếp tục tinh AGIs có chất peptid protein phân tử lượng thấp Do thời gian nghiên cứu có hạn nên pha nước chưa thể tiếp tục nghiên cứu sâu thêm chất tiếp tục tinh qua cột khác sắc ký trao đổi ion cột cut-off khác để thu hiệu tinh cao Mặt khác, đề tài hướng đến tìm kiếm hoạt chất thứ cấp có hoạt tính AGIs chúng tơi tập trung nghiên cứu pha dung môi 37 3.2.2.2 Tinh pha dung môi Trên sở khảo sát với dung mơi có độ phân cực giảm dần Nhận thấy hợp chất có hoạt tính ức chế α- glucosidase tập trung cao chiết với n-butanol thấp n-hexan Dựa sở chúng tơi lựa chọn hệ dung mơi có với tỷ lệ khác chạy TLC để khảo sát khả tách sơ chất mẫu Và lựa chọn hệ dung môi phù hợp để tiếp tục tiến hành chạy sắc ký silica gel lần nBuOH: acid acetic: EtOAc: H2O = 3:1:3:1 Dịch rửa giải sau qua cột silic gel lần phân đoạn 7-15 xuất vết thử lại TLC, thấy hệ dung môi khảo sát lựa chọn chưa cho kết tách tốt Nên cần tiếp tục tiến hành khảo sát hệ dung môi khác để tiến hành qua cột silica gel lần Do hạn chế mặt thời gian đề tài chưa thể tiến hành khảo sát hệ dung môi qua cột lần nên phân đoạn 11 (sau sơ tinh qua cột silica gel lần 1) cạo vết để xác định vết chứa hoạt tính ức chế α- glucosidase cao với mục tiêu xác định giá trị IC50 mẫu để so sánh với acarbose chuẩn Từ giá trị IC50 cho thấy hoạt tính ức chế α- glucosidase mẫu nghiên cứu thấp nhiều so với acarbose tinh khiết Do đề tài này tiến hành tinh qua cột silica gel lần sử dụng phương pháp truyền thống cạo vết để xác định chất có hoạt tính ức chế α- glucosidase nên lượng mẫu thấp, mặt khác chưa thực thí nghiệm xác định độ tinh mẫu nên tạp chất mẫu TLC2 ảnh hưởng đến kết IC50 Để nâng cao hiệu trình tinh cần tiếp tục nghiên cứu thêm điều kiện ảnh hưởng đến thí nghiệm q trình tiến hành tinh Bên cạnh đó, sau q trình tách chiết tinh có giảm hoạt tính ức chế qua giai đoạn Ở mẫu ban đầu dịch lên men hoạt tính lên đến 67,24% đến mẫu TLC2 39,31% giảm hoạt tính ức chế α- glucosidase dự đốn dịch lên men ban đầu có nhiều chất có hoạt tính ức chế α- glucosidase Do đó, sau q trình tinh sơ loại tạp loại số chất có hoạt tính ức chế α-glucosidase Do cần tối ưu hóa quy trình tiếp tục khảo sát quy trình khác để thu hiệu cao thu hoạt chất sau tinh cho hoạt tính ức chế α-glucosidase cao 38 CHƯƠNG KẾT LUẬN Từ kết thí nghiệm số liệu thu được, đưa kết luận sau: Đã chọn dung môi tách chiết thu pha có hoạt tính ức chế αglucosidase: dịch lên men sau chiết với ethyl acetat thu pha nước cho hoạt tính AGIs đạt 64,71% chiết với n-butanol thu pha dung mơi cho hoạt tính AGIs đạt 37,50% Lựa chọn cột sephadex G-25 dùng q trình tinh chất có hoạt tính AGIs có chất protein phân tử lượng thấp Với pha dung môi lựa chọn hệ dung môi để lên cột silica gel lần n-butanol: acid acetic: ethyl acetat: nước = 3:1:3:1 Kết đồng thời thu vết TLC2 có giá trị IC50 7873,72 µg/ml CHƯƠNG KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu lựa chọn hệ dung môi phù hợp tối ưu để kiểm tra khả tinh sau qua cột sắc ký lọc gel cột silica gel Với pha nước sử dụng số cột cut off nhỏ 5kDa để tìm kiếm hoạt chất AGIs có chất peptid Và xác định nhận dạng hoạt chất AGIs cách chạy điện di, định lượng hàm lượng protein đọc khối phổ Bên cạnh kết hợp sử dụng thêm cột sắc ký khác Với pha dung môi tiến hành tính qua cột silica gel lần sử dụng thêm sắc ký pha đảo HPLC 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2020), Hướng dẫn chẩn đoán điều trị đái tháo đường típ 2, Quyết định số 5481/QĐ-BYT Đỗ Quý Hải (2006), Giáo trình cơng nghệ sinh học enzyme, Đại học Khoa học, Đại học Huế, Việt Nam, tr 69-73 Mai Văn Hiên (2020), Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp, tinh bước đầu xác định cấu trúc hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp phân lập Việt Nam, Luận văn Thạc sĩ Dược Học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Việt Nam, tr.56 Nguyễn Đức Hoàng, Nguyễn Hữu Dàng (2021), "Bệnh Đái Tháo Đường Và Covid19", Nội Tiết Đái tháo đường, tr.22 Phạm Minh Hồng (2020), Sàng lọc nghiên cứu điều kiện để nâng cao khả sinh tổng hợp hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A niger, Khóa luận tốt nghiệp Đại học, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Việt Nam, tr.38 Bùi Hồng Sơn (2021), Nghiên cứu điều kiện tách chiết hoạt chất ức chế glucosidase từ chủng Aspergillus Niger, Khóa luận tốt nghiệp Đại học, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Việt Nam, tr.52 Hà Thị Tâm Tiến (2013), Nâng cao khả sinh tổng hợp tinh hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes SP KCTC 9161, Luận văn Thạc sĩ, Đại học khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội, tr.60 Đỗ Thị Tuyên, Vũ Văn Hạnh, et al (2013), Tách chiết, tinh hoạt chất DNJ (1deoxynojirimycin) ức chế α- glucosidase từ chủng B subtilis VN phân lập Việt Nam, Hội nghị Khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2013, Hà Nội, tr 550-554 Tiếng Anh Anderson M.S, Bluestone J.A (2005), "The NOD mouse: a model of immune dysregulation", Annual Review of Immunology,, 23(1), pp 447-485 10 Asp N.G, Gudmand-Höyer E., et al., Distribution of disaccharidases, alkaline phosphatase, and some intracellular enzymes along the human small intestine, in Scandinavian journal of gastroenterology 1975, ISSN: 0036-5521 p 647-651 11 Association American Diabetes (2015), "Standards of Medical Care in Diabetes", Diabetes care, 38, pp 51 – 593 12 Association American Diabetes (2020), "Classification and Diagnosis of Diabetes: Standards of Medical Care in Diabetes-2021", Diabetes Care, 44(Supplement_1), pp S15-S33 13 Bluestone JA., Herol K, et al (2010), "Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type diabetes", Nature medicine;, 464(7293), pp 1293-1300 14 Burton A.R., Vincent E., et al (2008), "On the pathogenicity of autoantigen-specific T-cell receptors", Diabetes, 57(5), pp 1321-1330 15 Carrascosa M., Pascual F., et al (1997), "Acarbose-induced acute severe hepatotoxicity", Lancet (British edition), 349(9053), pp 698-699 16 Chen Y.G , Li P (2013), "α-Glucosidase inhibitory effect and simultaneous quantification of three major flavonoid glycosides in Microctis folium", Molecules, 18, pp 4221-4232 17 Coniff R.F., Shapiro J.A., et al (1995), "Multicenter, placebo-controlled trial comparing acarbose (BAY g 5421) with placebo, tolbutamide, and tolbutamide-plus1 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 acarbose in non-insulin-dependent diabetes mellitus", The American journal of medicine, 98(5), pp 443-451 Devendra D., Jasinski J., et al (2005), "Interferon-α as a mediator of polyinosinic: polycytidylic acid–induced type diabetes", Diabetes, 54(9), pp 2549-2556 Dewi R T., Suparman A , et al (2016), "Identification of a New Compound as αGlucosidase Inhibitor from Aspergillus aculeatus", Annales bogorienses, 20(1), pp 19-23 Dewi R.T., Tachibana S., et al (2015), "α-Glucosidase inhibitor compounds from Aspergillus terreus RCC1 and their antioxidant activity", Med Chem Res 24, pp 737– 743 DiLorenzo T.P, Serreze D.V (2005), "The good turned ugly: immunopathogenic basis for diabetogenic CD8+ T cells in NOD mice", Immunological Reviews, 206, pp 336 Drucker D.J., Nauck M.A (2006), "The incretin system: glucagon-like peptide-1 receptor agonists and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in type diabetes", The Lancet, 368(9548), pp 1696-1705 Girdhar S., Verma S.K., et al (2015), "Plant derived alkaloids in major neurodegenerative diseases: from animal models to clinical trials", Journal of Ayurvedic and Herbal Medicine, 1.3, pp 91-100 Greeley S.A.W., Katsumata M., et al (2002), "Elimination of maternally transmitted autoantibodies prevents diabetes in nonobese diabetic mice", Nature medicine, 8(4), pp 399-402 Han B., Serra P., et al (2005), "Developmental control of CD8+ T cell–avidity maturation in autoimmune diabetes", The Journal of clinical investigation, 115(7), pp 1879-1887 Harjutsalo V., Sjöberg L., et al (2008), "Time trends in the incidence of type diabetes in Finnish children: a cohort study", The Lancet, 371(9626), pp 1777-1782 Holt R.I.G., Peveler R.C., et al (2004), "Schizophrenia, the metabolic syndrome and diabetes", Diabetic Medicine, 21(6), pp 515-523 Hossain U., Das A.K., et al (2020), "An overview on the role of bioactive αglucosidase inhibitors in ameliorating diabetic complications", Food chemical toxicology, 145, pp 111738 Hu C., Rodriguez-Pinto D., et al (2007), "Treatment with CD20-specific antibody prevents and reverses autoimmune diabetes in mice", The Journal of clinical investigation, 117(12), pp 3857-3867 Information National Center for Biotechnology (2022), "PubChem Enzyme Summary for Enzyme 3.2.1.20, Alpha-glucosidase (EC 3.2.1.20).", Retrieved, from https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/protein/EC:3.2.1.20 International Diabetes Federation (2021), IDF Diabetes Atlas, ISBN: 978-2-93022998-0, pp Johnston Peter S, Lebovitz Harold E, et al (1998), "Advantages of α-glucosidase inhibition as monotherapy in elderly type diabetic patients", The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 83(5), pp 1515-1522 Kang M.G., Yi S.H., et al (2013), "Production and characterization of a new αglucosidase inhibitory peptide from Aspergillus oryzae N159-1", Mycobiology, 41(3), pp 149-154 Kim YM., Wang MH., et al (2004), "A novel α-glucosidase inhibitor from pine bark", Carbohydrate research, 339(3), pp 715-717 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 Krentz A.J., Bailey C (2005), Oral antidiabetic agents, pp 385-411 Liu B., Chen N., et al (2021), "A new benzophenone with biological activities purified from Aspergillus fumigatus SWZ01", Natural Product Research, 35(24), pp 5710-5719 Liu Z.Y., Ma S.T (2017), "Recent Advances in Synthetic α‐Glucosidase Inhibitors", ChemMedChem, 12(11), pp 819-829 Lorenzen T, Pociot F, et al (1994), "Long-term risk of IDDM in first-degree relatives of patients with IDDM", Diabetologia, 37(3), pp 321-327 Munasaroh S., Tamat S.R., et al (2018), "Isolation and Identification of αGlucosidase Inhibitor From Aspergillus Terreus F38", Indonesian Journal of Pharmacy, 29(2), pp 74 Nguyen T C., Le T H., et al (2021), "Optimization and Purification of α-glucosidase inhibitor from Bacillus subtilis YT20 isolated in vietnam", Vietnam Journal of Science and Technology, pp 59(2),179-188 Nichols Buford L, Avery Stephen, et al (2003), "The maltase-glucoamylase gene: common ancestry to sucrase-isomaltase with complementary starch digestion activities", Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(3), pp 1432-1437 Onose S., Ikeda R., et al (2013), "Production of the α-glycosidase inhibitor 1deoxynojirimycin from Bacillus species", Food chemistry 138.1, pp 516-523 Ozougwu JC., Obimba KC., et al (2013), "The pathogenesis and pathophysiology of type and type diabetes mellitus", Journal of Physiology and Pathophysiology, 4(4), pp 46-57 Ren L.M., Qin XH., et al (2011), "Structural insight into substrate specificity of human intestinal maltase-glucoamylase", Protein & cell, 2(10), pp 827-836 Saha S., Kaviraj A (2009), "Effects of cypermethrin on some biochemical parameters and its amelioration through dietary supplementation of ascorbic acid in freshwater catfish Heteropneustes fossilis", Chemosphere, , 74(9), pp 1254-1259 Scheen A.J (2003), "Pathophysiology of type diabetes", Acta Clinica Belgica, 58(6), pp 335-341 Schuster E., Dunn-Coleman N., et al (2002), "On the safety of Aspergillus niger - A review", Applied microbiology and biotechnology, 59(4-5), pp 426-35 Serreze D.V., Fleming S.A., et al (1998), "B lymphocytes are critical antigenpresenting cells for the initiation of T cell-mediated autoimmune diabetes in nonobese diabetic mice", The Journal of Immunology, 161(8), pp 3912-3918 Sim L., Quezada-Calvillo R., et al (2008), "Human intestinal maltase–glucoamylase: crystal structure of the N-terminal catalytic subunit and basis of inhibition and substrate specificity", Journal of Molecular Biology, 375(3), pp 782-792 Singh B., Kaur A (2016), Antidiabetic potential of a peptide isolated from an endophytic Aspergillus awamori, pp Tan SY., Wong JLM., et al (2019), "Type and diabetes mellitus: A review on current treatment approach and gene therapy as potential intervention", Diabetes metabolic syndrome: clinical research reviews, 13(1), pp 364-372 Van B et al (1995), "Intestinal brush border glycohydrolases: structure, function, and development", Crit Rev Biochem Mol Biol, 30(3), pp 197-262 Wettergreen SA., Sheth S , et al (2016), "Effects of the addition of acarbose to insulin and non-insulin regimens in veterans with type diabetes mellitus", Pharmacy Practice, 14(4), pp World Health Organizatio (2019), "Classification of diabetes mellitus", pp 55 56 57 58 59 Yang JB , Tian JiY., et al (2017), "a-Glucosidase inhibitors extracted from the roots of Polygonum multiflorum Thunb", Fitoterapia, 117, pp 65-70 Ye G., Huang C., et al (2021), "Isolation, Structural Characterization and Antidiabetic Activity of New Diketopiperazine Alkaloids from Mangrove Endophytic Fungus Aspergillus sp 16-5c", Mar Drugs, 19(7), pp Yin Zh, Zhang W, et al (2014), "α-Glucosidase inhibitors isolated from medicinal plants", Food Science and Human Wellness, 3(3-4), pp 136-174 Zhu Y P., Yamaki K., et al (2010), "Purification and identification of 1deoxynojirimycin (DNJ) in okara fermented by Bacillus subtilis B2 from Chinese traditional food (Meitaoza)", J Agric Food Chem, 58(7), pp 4097-103 Zipris D., Lien E., et al (2007), "TLR9-signaling pathways are involved in Kilham rat virus-induced autoimmune diabetes in the biobreeding diabetes-resistant rat", The Journal of Immunology, 178(2), pp 693-701 ... nước Từ tiến hành bước tinh hai pha để xác định hoạt chất AGIs từ chủng A niger VTCC 031 3.1.3 Tinh hoạt chất ức chế α -glucosidase từ chủng A niger VTCC-031 3.1.3.1 Tinh hoạt chất ức chế α -glucosidase. .. chế α -glucosidase từ chủng A niger VTCC-031 25 3.1.3 Tinh hoạt chất ức chế α -glucosidase từ chủng A niger VTCC-031 27 3.1.3.1 Tinh hoạt chất ức chế α -glucosidase từ chủng A .niger VTCC-031 pha... tiêu sau: Lựa chọn dung môi tách chiết hợp chất ức chế α -glucosidase từ chủng A niger VTCC-031 Lựa chọn điều kiện tinh chế hoạt chất ức chế α -glucosidase từ chủng A niger VTCC-031 CHƯƠNG TỔNG