Sản xuất ethanol sinh học thế hệ thứ ba từ Sargassum spp sử dụng công nghệ áp suất cao để tiền xử lý và phân đoạn sinh khối. Nguyên tắc: Sử dụng dung dịch nước như một hệ thống phản ứng Bình phản ứng kín Nhiệt độ cao Áp suất cao Thay đổi thành phần cấu trúc hóa học trong sinh khối
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH – CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM *** Sản xuất ethanol sinh học hệ thứ ba từ Sargassum spp sử dụng công nghệ áp suất cao để tiền xử lý phân đoạn sinh khối Giáo viên hướng dẫn: : TS Phạm Tuấn Anh Học viên : Lê Thị Thùy Dung Ngô Văn Thịnh HÀ NỘI 2022 MỤC LỤC I GIỚI THIỆU II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thu thập chuẩn bị sinh khối Sargassum 2.2 Đặc trưng hóa lý sinh khối Sargassum 2.3 Công nghệ tiền xử lý áp suất cao (xử lý thủy nhiệt) sinh khối Sargassum8 2.4 Thủy phân enzyme 10 2.4.1 Enzyme 10 2.4.2 Đánh giá trình thủy phân enzym sinh khối Sargassum qua tiền xử lý 10 2.5 Lên men chất rắn qua xử lý sinh khối Sargassum 11 2.5.1 Chuẩn bị chủng cấy 12 2.5.2 Q trình tiền đường hóa tới lên men đồng thời (PSSF) sinh khối Sargassum qua tiền xử lý 12 2.6 Phương pháp phân tích 13 III KẾT QUẢ 13 3.1 Đặc điểm hóa lý Sg 13 3.2 Tiền xử lý Sargassum spp áp suất cao 14 3.3 Thủy phân sinh khối Sargassum qua tiền xử lý enzyme 16 3.4 Lên men sinh khối Sargassum qua tiền xử lý 21 3.4.1 Chiến lược tiền đường hóa tới lên men đồng thời 21 IV KẾT LUẬN 23 V TÀI LIỆU THAM KHẢO i DANH MỤC HÌNH Hình 1: Sự phân bố tảo biển giới Hình 2: Tảo Sargassum Hình 3: Sơ đồ sản xuất ethanol sinh học sử dụng sinh khối Sargassum spp cơng nghệ áp suất cao Hình 4: Profile nhiệt trình tiền xử lý áp suất cao thí nghiệm 15 Hình 5: Động học trình thủy phân enzyme sinh khối qua tiền xử lý chưa tiền xử lý sử dụng Cellic CTec2 Cellic HTec2 1% glucan 15 FPU cellulase a) Nồng độ glucose (g/L) b) Hiệu suất glucose (%) 18 Hình 6: Kết thủy phân enzyme mức hàm lượng chất rắn cao sinh khối Sg tiền xử lý nồng độ enzyme thấp sử dụng Cellic CTec2 Cellic HTec (tỷ lệ 1: 2) 20 Hình 7: Profile động học trình sản xuất ethanol sinh học sử dụng chiến lược tiền đường hóa tới lên men đồng thời chất sinh khối Sg qua tiền xử lý 22 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Thành phần carbohydrate loài tảo biển [2] Bảng 2: Thiết kế thí nghiệm điều kiện hoạt động để xử lý thủy nhiệt Sargassum spp: Đặc trưng hóa học pha rắn lỏng 10 I GIỚI THIỆU Ước tính dân số tồn cầu đạt 10 tỷ người vào năm 2050 làm tăng nhu cầu nhiên liệu Người ta ước tính nguồn cung cấp nhiên liệu hóa thạch cạn kiệt vào kỷ này, cần có thay nguồn lượng tương lai gần Hiện nay, ethanol sinh học nguồn nhiên liệu thay tiềm tính chất tái tạo lượng khí thải carbon thấp Tuy nhiên, nguyên liệu làm ethanol sinh học hệ thứ thứ hai cạnh tranh đất với trồng khác làm hạn chế khả phát triển chúng Các nguồn sinh khối tái tạo, sinh trưởng nhanh tảo biển, thu hút ý tìm kiếm giải pháp thay Tảo biển nguyên liệu cung cấp cho hệ thứ ba đầy hứa hẹn để sản xuất ethanol sinh học tốc độ tăng trưởng nhanh, bền vững khơng có cạnh tranh đất đai với loại trồng [1] Các loại tảo biển (Macroalgae or Seaweeds) gắn vào cấu trúc khác như đáy biển Tuổi thọ chúng bị giảm chúng bị tách khỏi cấu trúc sống tảo biển trôi tự Tảo biển phân bố bốn vùng khác phía đơng Đại Tây Dương, tây Đại Tây Dương, tây Thái Bình Dương đơng Thái Bình Dương mơ tả hình Tảo biển phân thành ba nhóm tảo nâu (Phaeophyceae), tảo đỏ (Rhodophyceae), tảo lục (Chlorophyceae) Có ba thành phần tảo biển bao gồm carbohydrate, protein lipid hàm lượng thành phần khác nhiều Cấu trúc thành tế bào tảo biển thường tạo thành từ polyme galactan sunfat mạch thẳng Một số nhà nghiên cứu đề xuất tảo biển nguồn nguyên liệu hứa hẹn mà dễ dàng chuyển đổi thành ethanol sinh học, chúng biết có thành phần lignin thấp tự Tảo biển chứa khoảng 25% –60% carbohydrate, 5% –20% protein, 0,5% – 5% lipid khoảng 15% –40% tro Thành phần loại carbohydrate loại tảo thể bảng [2] [3] Hình 1: Sự phân bố tảo biển giới Hình 2: Tảo Sargassum Hiện nay, lồi tảo Sargassum (hình 2) bao gồm Sargassum natans, Sargassum fluitans Sargassum muticum, ghi nhận Biển Caribe, tây trung Đại Tây Dương vịnh Mexico, số liệu báo cáo cho thấy có khoảng 10.000 lắng đọng hàng ngày Caribe vào năm 2015, với khu vực Caribe Mexico thu trung bình 2360 m3 Sargassum km bờ biển thời kỳ Sự tràn ngập Sargassum bãi biển vịnh Caribe Mexico mô tả "cuộc khủng hoảng quốc tế" "mối đe dọa lớn vùng Caribe", tác động gây hậu tiêu cực môi trường kinh tế Sự gia tăng khơng kiểm sốt tảo Sargassum chưa hiểu đầy đủ, người ta tin gia tăng toàn cầu nồng độ CO2 biến đổi khí hậu làm tăng cường axit hóa đại dương mức nhiệt độ nước biển làm thúc đẩy phát triển mạnh mẽ Sargassum Vì vậy, nỗ lực nhằm tìm giải pháp hiệu để giảm thiểu tích tụ sinh khối Sargassum vùng bãi biển, thúc đẩy tính bền vững môi trường kinh tế vùng ven biển Nhiều nghiên cứu đề xuất sử dụng sinh khối Sargassum làm nguyên liệu thô để sản xuất ethanol sinh học Tuy nhiên nghiên cứu giai đoạn sơ khai cần khám phá thêm để phát triển phương pháp công nghệ khả thi Đặc biệt bước tiền xử lý nguyên liệu thường tốn chiếm tới 20% chi phí sản xuất Một loạt phương pháp tiền xử lý thử nghiệm, bao gồm tiền xử lý axit, enzyme nổ Mặc dù suất cao, hầu hết phương pháp có chi phí cao, yêu cầu điều kiện phản ứng khắc nghiệt tạo sản phẩm phụ ức chế q trình lên men Do đó, phát triển cơng nghệ tiền xử lý chi phí thấp khơng tạo thành sản phẩm phụ ức chế trình lên men bước quan trọng việc phát triển quy trình sản xuất ethanol sinh học chi phí thấp từ sinh khối Sargassum [4] [5] Phương pháp tiền xử lý công nghệ áp suất cao để phân tách sinh khối công nghệ đầy hứa hẹn, giúp mở rộng quy mơ quy trình cơng nghiệp lớn Q trình tiền xử lý áp dụng sinh khối tảo làm tăng khả tiếp cận enzym thủy phân với polysaccharide thành tế bào Sau thủy phân enzyme, monosaccharide giải phóng chuyển đổi thành ethanol sinh học thông qua sử dụng vi sinh vật lên men Bên cạnh đó, chiến lược tiền xử lý công nghệ áp suất cao cho xử lý sinh khối chiến lược tiền đường hóa tới lên men đồng thời - Pre-Simultaneous Saccharification and Fermentation (PSSF) phát triển để kết hợp lợi ích quy trình xử lý 'thủy phân lên men tuần tự’ theo truyền thống 'đường hóa lên men đồng thời' (SSF) PSSF kết hợp thời gian tiền đường hóa trước giai đoạn SSF Do đó, trình thủy phân thực điều kiện tối ưu thời gian tương đối ngắn trước vi sinh vật thích hợp thêm vào để bắt đầu trình lên men Chiến lược PSSF áp dụng để giảm độ nhớt bã sinh khối tải trọng rắn cao trình sản xuất ethanol sinh học hệ thứ thứ hai, dự kiến có suất sản lượng cao Do đó, cơng nghệ tiền xử lý áp suất cao PSSF cho thấy tiềm lớn để sản xuất ethanol sinh học từ tảo phù hợp để sử dụng thương mại Bảng 1: Thành phần carbohydrate loài tảo biển [2] Trong nghiên cứu này, sinh khối Sargassum spp nghiên cứu nguyên liệu tái tạo để sản xuất ethanol sinh học, sử dụng công nghệ tiền xử lý áp suất cao thân thiện với môi trường bền vững Sơ đồ quy trình sản xuất hình cho thấy, chất rắn giàu glucan qua tiền xử lý đưa vào thiết bị với điều kiện khác trình thủy phân enzym lượng chất rắn cao liều lượng enzym thấp, bước PSSF để đạt chuyển hóa tối đa glucose thành ethanol II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thu thập chuẩn bị sinh khối Sargassum Sargassum spp (Sg) sử dụng nghiên cứu thu thập Puerto Morelos, Quintana Roo, Mexico (Tọa độ GPS: 20.83149359, - 86.87929434), vào 2/2019 Sg rửa nước máy, phơi nắng 48 xay đến kích thước hạt từ 0,5 đến mm máy nghiền dạng lưỡi (Blender 564A, Dual Range Pulse, Osterizer) trước bảo quản túi polyetylen màu tối Để xác định độ ẩm, 1g Sg làm khô 80◦C 24 khác biệt trọng lượng ướt khơ sử dụng để tính độ ẩm Hình 3: Sơ đồ sản xuất ethanol sinh học sử dụng sinh khối Sargassum spp công nghệ áp suất cao 2.2 Đặc trưng hóa lý sinh khối Sargassum Sinh khối Sg xác định hàm lượng chất béo thô, chất xơ thô, protein, tro sunphat Hàm lượng polysaccharide (glucan, galactan fucoidan) xác định cách thủy phân axit định lượng 72% (w/v), theo quy trình the National Renewable Energy Laboratory, 0,5g khô sinh khối cho vào ống nghiệm với mL axit sulfuric 72% (v/v), sau đưa vào nồi cách thủy 35◦C khuấy thủ cơng Sau đó, mẫu pha loãng nồng độ axit sulfuric đạt 4%, dung dịch pha lỗng đun nóng nồi hấp Sau đó, mẫu làm lạnh trước lọc lượng nhỏ mL màng lọc nylon 0,45 µm vào ống để xác định lượng đường đơn giải phóng, cách sử dụng HPLC để ước tính hàm lượng polysaccharide mẫu: glucose tương ứng với laminarin (như glucan), galactose ứng với galactan, fucose ứng với fucoidan Cuối cùng, phần rắn sấy khô 50 ◦C 24 cân để xác định cặn không tan axit 2.3 Công nghệ tiền xử lý áp suất cao (xử lý thủy nhiệt) sinh khối Sargassum Công nghệ tiền xử lý áp suất cao (xử lý thủy nhiệt) thực thiết bị phản ứng áp suất theo mẻ thép không gỉ, thiết kế phát triển tập đoàn biorefinery (www.biorefinerygroup.com), trang bị khuấy điều khiển nhiệt độ vi tích phân tỷ lệ (proportional - integral - derivative - PID) Thiết bị phản ứng trang bị cảm biến nhiệt độ cảm biến áp suất với tổng thể tích làm việc 0,66 L Thiết bị phản ứng gia nhiệt với điện trở trang bị hệ thống làm mát áo nước (water jacket) sử dụng để hạ nhiệt thiết phản ứng Sg nước cất nạp vào thiết bị phản ứng trộn theo tỷ lệ 1:20 (w/v) Phương pháp luận bề mặt phản ứng sử dụng để xác định điều kiện tối ưu để giải phóng hàm lượng glucan cao chất rắn tiền xử lý sinh khối Sg (g glucan / 100 g Sg) Các thí nghiệm tiền xử lý cao áp thủy nhiệt thực điều kiện hoạt động nhiệt độ (150 - 190 ◦C), áp suất (3,75–11,54 bar) thời gian lưu trú (10–50 phút) phù hợp với thiết kế thí nghiệm Bảng 2, giá trị trọng tâm (central point) đánh giá với lần lặp lại thí nghiệm kết thống kê phân tích phần mềm STATISTICA 8.0 Sau thiết bị phản ứng làm nguội, pha rắn pha lỏng tách thông qua phương pháp lọc Pha rắn rửa nước cất để loại bỏ hợp chất phân hủy sau sấy khơ 50 ◦C Pha rắn lại sau tiền xử lý thủy nhiệt sử dụng để tính hiệu suất chất rắn thu hồi sau xử lý (g chất rắn thu hồi/100g Sg ban đầu) Sau đó, chúng phân tích hàm lượng polysaccharide theo phương pháp thủy phân axit định lượng nêu phần 2.2 Một phần pha lỏng sau tiền xử lý thủy nhiệt phân tích HPLC để xác định glucose, galactose, fucose, axit axetic, axit formic, furfural hydroxymethylfurfural (HMF) (phần 2.6) Tỷ lệ oligomer pha lỏng định lượng phương pháp định lượng axit sau thủy phân: mẫu gồm 2g pha lỏng cho vào bình 100 mL với 1g axit sulfuric (95–97%) 22g nước cất, monome giải phóng định lượng HPLC (phần 2.6) Tất phân tích thực ba lần Cường độ công nghệ áp suất cao (tiền xử lý thủy nhiệt) biểu thị severity factor (yếu tố thể cường độ điều kiện phản ứng quy trình hóa học nhiệt độ hay áp suất), có tính đến điều kiện vận hành nhiệt độ thời gian, yếu tố biểu thị phương trình sau: Severity factor xác định có tính đến profile làm nóng, làm mát phần đẳng nhiệt trình Trong đó: • [logR0] severity factor • t’ max (min) thời gian cần thiết để đạt đến đỉnh nhiệt độ, • T (t) T '(t) profile nhiệt độ bước làm nóng làm mát • ctrl ctrf (min) khoảng thời gian cần thiết cho tồn q trình làm nóng/lạnh • ω số thực nghiệm có giá trị 14,75 Hệ số [logR0] tính tốn cách sử dụng tích phân số học để thu diện tích đường cong nhiệt độ so với thời gian Bảng 2: Thiết kế thí nghiệm điều kiện hoạt động để xử lý thủy nhiệt Sargassum spp: Đặc trưng hóa học pha rắn lỏng 2.4 Thủy phân enzyme 2.4.1 Enzyme Enzyme cocktail thương mại Cellic CTec2 Cellic HTec2 để thủy phân hemicellulose từ Trichoderma reesei sử dụng Cellic CTec2 hỗn hợp enzyme phức tạp bao gồm β-glucosidase hemicellulases, Cellic HTec2 chứa endoxylanase Hoạt tính cellulase ban đầu (118 FPU/ml) Cellic CTec2 xác định theo phương pháp National Renewable Energy Laboratory (NREL/TP-510–42628) 2.4.2 Đánh giá trình thủy phân enzym sinh khối Sargassum qua tiền xử lý 10 Sinh khối Sg tiền xử lý thủy nhiệt sử dụng làm chất cho trình thủy phân enzyme, Sg chưa qua tiền xử lý sử dụng làm đối chứng Các thử nghiệm thực bình Erlenmeyer 125 mL với thể tích làm việc 25 mL, nhiệt độ ủ 50 ◦C tốc độ khuấy 150 vòng/phút Dung dịch đệm citrate 50 mM (pH = 4,8) sử dụng với tỷ lệ cellulase/hemicellulase 1: (v/v) tỷ lệ nạp cellulase 15 FPU/g glucan Thiết kế thử nghiệm sau tương tự thiết kế nêu phần 2.3.1, biến độc lập (các yếu tố nghiên cứu) lượng chất rắn qua tiền xử lý (5, 13%, w/v), lượng cellulase (5, 10 15 FPU/g glucan), nồng độ glucose (g/L) biến phụ thuộc Để tránh phát triển vi sinh vật trình thủy phân enzyme, 100 μL tetracycline 75 μL cycloheximide từ dung dịch gốc 10 g/L sử dụng Các mẫu nhỏ (1 mL) lấy 0, 6, 12, 24, 48 72 từ trình thủy phân enzym ly tâm Dịch thu được phân tích HPLC (phần 2.6) hiệu suất đường hóa (chuyển glucan thành glucose %) tính theo cơng thức sau: Trong • [Glucose] nồng độ glucose cịn lại tính g/L • [Cellobiose] nồng độ cellobiose cịn lại sau thủy phân glucan, nồng độ tính g/L • (f) phần glucan dạng khô (g / g) • 1,053 1,111 yếu tố chuyển đổi • [Biomass] nồng độ sinh khối khô thời điểm bắt đầu thủy phân enzym 2.5 Lên men chất rắn qua xử lý sinh khối Sargassum 11 2.5.1 Chuẩn bị chủng cấy Saccharomyces cerevisiae PE-2 thu nhận từ trung tâm Kỹ thuật Sinh học Đại học Minho, Bồ Đào Nha sử dụng thử nghiệm Nấm men nuôi bình Erlenmeyer 500 mL với 125 mL mơi trường bao gồm 50 g /L glucose, 10 g/L peptone dịch chiết nấm men ủ 35 ◦C với tốc độ lắc 150 vòng /phút 16 Hỗn dịch tế bào ly tâm vô trùng (4 ◦C, 5600g, 15 phút), chất rắn huyền phù 0,9% NaCl nồng độ cuối 200g nấm men tươi L 2.5.2 Quá trình tiền đường hóa tới lên men đồng thời (PSSF) sinh khối Sargassum qua tiền xử lý Các điều kiện xử lý tối ưu từ thử nghiệm thủy phân enzyme phần 2.4.2 sử dụng giai đoạn tiền đường hóa sinh khối Sg qua tiền xử lý Các thí nghiệm thực lặp lại ba lần bình Erlenmeyer 250 mL với thể tích làm việc 50 mL điều kiện bán kỵ khí Sau 24 giờ, nhiệt độ điều chỉnh từ 50 ◦C xuống 35◦C S cerevisiae PE-2 cấy nồng độ g/L dịch nấm men tươi NaCl (0,9% w / v) Động học trình lên men theo dõi 72 giờ, với mL mẫu lấy 24 giai đoạn tiền đường hóa để định lượng glucose, mẫu lấy 12, 24, 48 72 giai đoạn lên men để định lượng glucose bioethanol Các mẫu phân tích HPLC (phần 2.6) Kết biểu thị hiệu suất chuyển hóa ethanol (%) sử dụng phương trình sau: 𝐻𝑖ệ𝑢 𝑠𝑢ấ𝑡 𝑒𝑡ℎ𝑎𝑛𝑜𝑙 (%) = [EtOH]f −[EtOH]0 0.51[𝑓.(𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠).1.111 𝑥 100 Trong đó: • [EtOH]f nồng độ ethanol cuối trình lên men (g/L) • [EtOH]0 nồng độ ethanol đầu trình lên men (g/L) (theo lý thuyết 0) 12 • 0,51 hệ số chuyển đổi glucose thành ethanol dựa sinh hóa tỷ lượng nấm men • f tỷ lệ glucan sinh khối khơ (g/g) • (Biomass) nồng độ sinh khối khơ đầu q trình lên men (g/L) • 1,111 hệ số tỷ lượng chuyển glucan thành glucose tương đương 2.6 Phương pháp phân tích Glucose, galactose, fucose, axit formic, axit axetic, HMF, furfural bioethanol phân tích phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng Agilent 1260 Infinity II Perkin Elmer (Mỹ) trang bị máy cảm biến đo khúc xạ cột MetaCarb 87H (300 mm × 7,8 mm, Agilent) Pha động H2SO4 mM, tốc độ dòng chảy 0,7 mL/phút 60 ◦C thể tích tiêm 20 µL Trước phân tích HPLC, tất mẫu lọc qua màng lọc nylon 0,45μm III KẾT QUẢ 3.1 Đặc điểm hóa lý Sg Thành phần hóa học (g/100 g Sargassum (d.w)) sinh khối khô Sg: glucan (10,40 ± 0,96), galactan (4,34 ± 0,39), fucoidan (6,77 ± 0,69), cặn không tan (26,46 ± 0,31), sulphat (4,93 ± 0,24), Chất béo (0,33 ± 0,001), chất xơ thô (20,60 ± 0,75), protein (8,34 ± 0,39), tro (20,27 ± 0,44) Polysaccharide ngun liệu thơ phân tích liên quan đến glucan (như laminarin), galactan fucoidan cho kết 10,40, 4,34 6,77g /100 g d.w Các kết carbohydrate tương tự Sargassum muticum (10,18g/100g d.w glucan, 2,69 galactan, 6,00 fucoidan) Himanthalia elongata (15,69g/100g d.w tổng lượng cacbohydrate).Tuy nhiên, hàm lượng polysaccharide sinh khối Sargassum từ nghiên cứu thấp so với Sargassum horridum (50,64g/100 g d.w) Sargassum spp (41,81g/100 g d.w) nghiên cứu trước Điều khơng phải tất polysaccharide rượu đường (mannitol, laminarin, mannan alginate) tảo nâu tương thích với phương 13 pháp định lượng cơng nghệ phân tích sử dụng nghiên cứu Những điểm tương đồng khác biệt thành phần sinh hóa có liên quan đến thay đổi mùa, vị trí địa lý điều kiện khí hậu Bên cạnh đó, thay đổi gây tính thời vụ hoạt động sinh sản Ngồi ra, tính theo mùa epifauna liên quan đến tăng giảm đại thực bào thay đổi độ phủ biểu sinh tảo Macrophytes ảnh hưởng đến chu trình dinh dưỡng thơng qua chuyển giao nguyên tố hóa học từ trầm tích sang nước, giữ lại chất rắn chất dinh dưỡng rễ ngập nước chúng, giảm chất dinh dưỡng giải phóng từ trầm tích cách bảo vệ chống lại gió sóng 3.2 Tiền xử lý Sargassum spp áp suất cao Trong nghiên cứu này, nước sử dụng làm môi trường phản ứng với nhiệt độ thời gian cư trú yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu tiền xử lý Tiền xử lý thủy nhiệt sở hữu thuộc tính tuyệt vời, bao gồm việc sử dụng nước nóng nước, không yêu cầu thêm dung môi bổ sung Các mơ hình kinh tế cơng nghệ, tạo để so sánh phương pháp tiền xử lý khác nhau, cho tiền xử lý thủy nhiệt yêu cầu vốn thấp thực tế hợp chất ức chế cho giai đoạn xử lý sau tạo ảnh hưởng tới mơi trường hơn, bao gồm giảm phát thải khí nhà kính Trong nghiên cứu này, severity factor tính toán nằm khoảng 3,71 4.23, thông số nhiệt độ thời gian tiền xử lý cung cấp cách thực tế để so sánh kết với báo cáo khác sử dụng thông số khác nhiệt độ, thời gian axit Kết phù hợp với nghiên cứu trước sử dụng tiền xử lý thủy nhiệt Hình cho thấy profile nhiệt độ tiền xử lý với áp suất cao điều kiện vận hành: severity factor Bảng cho thấy thành phần pha lỏng rắn tất thí nghiệm tiền xử lý thực nghiên cứu Rõ ràng pH pha lỏng tạo 14 giảm severity factor trình tiền xử lý tăng Điều ion hóa tự động nước, dẫn đến việc tạo H3O+ giải phóng khỏi nước sử dụng, nhóm SO3H từ fucoidan có sinh khối Sargassum, gây tượng Các sản phẩm đường phân giải, hoạt động chất ức chế tác nhân trình thủy phân lên men enzyme, ngăn chặn cách kiểm sốt pH q trình tiền xử lý Sự thay đổi độ pH nghiên cứu từ 6,03 đến 6,80 Hình 4: Profile nhiệt trình tiền xử lý áp suất cao thí nghiệm Đối với điều kiện hoạt động giá trị trọng tâm (central point) (170 ◦C, 30 phút, 6,91 bar), thành phần pha lỏng là: galactose (0,16 ± 0,01 g /L), mannitol (0,22 ± 0,01 g / L), fucose (0,32 ± 0,009 g / L) glucose không phát Các 15 hợp chất phân huỷ phát nghiên cứu formic (6,22 ± 0,22 g / L) axit axetic (0,25 ± 0,01 g / L), với axit fomic mức cao Axit axetic phát mức thấp đáng kể, khơng có dấu vết furfural HMF tìm thấy Oligosaccharide phát nồng độ cao chút monosaccharide nói trên, với gluco-oligosaccharid (GlO), galacto-oligosaccharides (GaO) fuco-oligosaccahrides (FuO) diện từ 0,00 đến 2,45 g /L, 0,00 - 1,05 g/L 0,00 - 1,64g/L Tiền xử lý áp suất cao thủy nhiệt có severity 3,84 tạo pha lỏng chứa nồng độ cao GlO, 2,45 g/L, tất trình tiền xử lý Sản lượng rắn (%) cặn lại tạo sau trình tiền xử lý áp suất cao thủy nhiệt giảm severity factor tiền xử lý tăng lên, cuối làm giàu hàm lượng glucan mà sau bị thủy phân enzyme thành glucose severity factor 4.23, trình tiền xử lý tạo lượng rắn chứa glucan nhiều nhất, 32,33g/100 g d.w Cặn rắn khơng hịa tan thành phần pha chất rắn, chủ yếu phải bao gồm tro hợp chất định lượng khác Phân tích phương sai (ANOVA) phân tích cho cơng thức Trong “T” nhiệt độ “t” thời gian % Glucan = 1,01T + 6,61t - 2,15T2 + 0,87t2 + 4,56Tt + 20,20 Phân tích ANOVA 95% kết (R2), phù hợp với việc xác định điều chỉnh hệ số R2adj = 0,90 3.3 Thủy phân sinh khối Sargassum qua tiền xử lý enzyme Sinh khối Sg tiền xử lý 190◦C 50 phút (severity factor: 4,23) chọn thủy phân enzym Các thử nghiệm sơ sau thực sinh khối Sg qua tiền xử lý không tiền xử lý sử dụng tỷ lệ nạp (khoảng 15 FPU/g glucan) Cellic CTec 1% (w/v) Cellic CTec kết hợp với Cellic HTec theo tỷ lệ 1:2 Tối đa có 0,86 g/L glucose giải phóng từ sinh khối Sg chưa 16 qua tiền xử lý thủy phân enzyme Cellic CTec Cellic CTec Cellic HTec (Hình 5a) Ngược lại, nồng độ glucose tăng lên đáng kể sử dụng Cellic CTec Cellic CTec Cellic HTec sinh khối Sg tiền xử lý 190 ◦C 50 phút, với nồng độ tương ứng 4,17 g/L 9,69 g/L Điều tiền xử lý làm cho phần glucan dễ tiếp cận với enzyme để thủy phân thành glucose Ngoài ra, kết hợp hai loại enzyme cocktail cho sản lượng glucose giải phóng cao 57% từ sinh khối Sg tiền xử lý so với việc sử dụng Cellic CTec (Hình 5b) Nhiều nghiên cứu cho khó để ước tính tác động cộng hợp hai phức hợp enzyme, nhiên enzyme phụ, chẳng hạn họ enzyme glycoside hydrolase enzyme oxy hóa có Cellic CTec2 cellulase có Cellic HTec2 cocktail, giúp cải thiện chuyển đổi glucan thành glucose Hơn nữa, kết hợp enzyme làm tăng độ xốp chất xơ, dẫn đến gia tăng sợi ngắn độ phồng sợi, làm tăng diện tích bề mặt có sẵn cho cellulase hoạt động Hiện nay, chưa có nghiên cứu với enzyme chuyên biệt cho tảo biển báo cáo Do đó, so sánh chủ yếu tạo sinh khối lignocellulosic để sản xuất ethanol với polysaccharide sử dụng q trình thủy phân enzyme glucan cellulose Trong sinh khối hệ 2, bổ sung hemicellulases cải thiện sản lượng thủy phân enzyme lượng xylan thấp chất rắn tiền xử lý Ngoài ra, hỗn hợp phức enzyme cải thiện nồng độ sản lượng glucose Sản lượng glucose tăng lên từ 48,3% (chỉ Cellic CTec2) đến 72,5% (Cellic CTec2, Cellic HTec2, PEG) 21,7% chất rắn tiền xử lý w/v, 16,3% chất rắn tiền xử lý nghiên cứu trước Yang et al (2017) Họ gợi ý PEG ổn định kích hoạt Cellic CTec2 HTec2, đồng thời ảnh hưởng đến cấu trúc độ nhớt, làm tăng tương tác enzyme sinh khối 17 Hình 5: Động học trình thủy phân enzyme sinh khối qua tiền xử lý chưa tiền xử lý sử dụng Cellic CTec2 Cellic HTec2 1% glucan 15 FPU cellulase a) Nồng độ glucose (g/L) b) Hiệu suất glucose (%) 18 Sản lượng đường hóa cao từ tiền xử lý chất tải rắn (4% (w/v)) với tỷ lệ nạp enzyme cao (16 FPU/g glucan, Cellic CTec Cellic HTec với tỷ lệ 1: 2) Ở điều kiện vậy, lượng enzyme dư thừa lượng sinh khối Sg qua tiền xử lý thấp cho phép giải trùng hợp hiệu tất glucan có sinh khối Sg Sử dụng kiểm nghiệm ANOVA phân tích cho mơ hình bên Trong “P” chất rắn tiền xử lý “E” tải lượng enzyme % Saccharification yield = 7,56E - 3,29P - 2,22E2 + 0,81p2 - 2,12EP + 91,22 ANOVA mơ hình thu giải thích 90% kết (R2), phù hợp với việc xác định điều chỉnh hệ số R2adj = 0,81 Hình cho thấy nồng độ glucose giải phóng sử dụng Cellic CTec2 Cellic HTec2 (với tỷ lệ 1: 2) với mức nạp enzyme chất rắn khác sau 72 sinh khối Sg tiền xử lý Lượng glucose cao nhất, 43,07 g/L, 42,65 g/L 36,57 g/L, giải phóng từ điều kiện nạp chất rắn 13% (w/v), giá trị FPU 15, 10 Các giá trị tương ứng với hiệu suất chuyển đổi 92,12, 91,33 78,32% Kết đạt khả quan so với nghiên cứu trước trình thủy phân enzyme chất rắn từ bã mía agave, sử dụng Cellic CTec2 lượng đường glucose giải phóng 40 70 g /L (tương ứng với 80% suất chuyển đổi) sử dụng điều kiện mức nạp chất rắn 10 15% (w/v) với nồng độ enzyme 15 FPU 19 Hình 6: Kết thủy phân enzyme mức hàm lượng chất rắn cao sinh khối Sg tiền xử lý nồng độ enzyme thấp sử dụng Cellic CTec2 Cellic HTec (tỷ lệ 1: 2) Sự khác biệt cho loại sinh khối sử dụng, lượng glucan sinh khối lignocellulosic tiền xử lý 46,46%, so với 32,33% Sargassum sử dụng nghiên cứu Liên quan đến suất chuyển đổi, rõ ràng khác biệt thành tế bào tảo biển không chứa lignin Trong khi, del Río et al (2019) cho Sargassum muticum tiền xử lý thu 6,01 g/L glucose giải phóng với hiệu suất chuyển hóa 94%, sử dụng 14,3 kg/100 tổng trọng lượng chất rắn tiền xử lý mức nạp enzyme 20 FPU Nồng độ sản lượng 20 glucose tương tự thu thử nghiệm sơ thực nghiên cứu này, hàm lượng chất rắn thấp FPU enzyme cao sử dụng 3.4 Lên men sinh khối Sargassum qua tiền xử lý 3.4.1 Chiến lược tiền đường hóa tới lên men đồng thời Quá trình lên men thực theo chiến lược PSSF nhằm mục đích tối đa hóa sản xuất ethanol sinh học cách sử dụng điều kiện tối ưu thu từ giai đoạn tiền xử lý thủy phân enzyme: 190◦C - 50 phút, 10 FPU/g glucan 13% (w/v) cht rn sau tin x lý Theo Gonỗalves et al (2016), PSSF so với chiến lược sản xuất ethanol sinh học khác (chẳng hạn thủy phân lên men riêng biệt, hay đường hóa lên men đồng thời SSF) có suất tỷ lệ chuyển đổi cao hơn, miễn thời gian tiền đường hóa cải thiện sản lượng chuyển đổi Romaní et al (2016) đề cập chiến lược PSSF phù hợp với nguyên liệu có hàm lượng chất rắn cao, độ nhớt hỗn hợp giai đoạn tiền đường hóa giảm đáng kể, cải thiện chuyển khối trình chuyển đổi thành ethanol sinh học Như hình 7, nồng độ glucose sau 24 45,66 ± 0,75 g/L với hiệu suất 97,78 ± 1,62% Sau 12 lên men, glucose tiêu thụ hoàn toàn 18,14 ± 1,11 g/L ethanol sinh học sản xuất, với hiệu suất chuyển hóa 76,23 ± 4,68% Nồng độ glucose đạt PSSF rõ ràng cao so với sản lượng glucose thu từ giai đoạn thủy phân enzyme riêng biệt (39,52 g/L 24 giờ) Điều cải thiện tính khơng đồng chất tham gia phản ứng enzyme, nước, đệm, sinh khối Sự tiếp xúc không đủ chất phản ứng phân bố ngẫu nhiên vật liệu bình dẫn đến chuyển khối bất lợi Một hỗn hợp trộn sẵn cung cấp tiếp xúc hiệu enzyme chất hàm lượng chất rắn cao cần có bình phản ứng đủ mạnh để trộn hiệu hỗn hợp nguyên liệu để giảm thiểu nhược điểm chuyển khối Ví dụ, Pino et al (2019) sử dụng bình phản ứng nằm ngang thiết kế để thủy phân enzyme tải 21 trọng chất rắn cao sinh khối lignocellulose, giúp tăng cường hiệu trộn Mặc dù tất glucose tiêu thụ sau 12 lên men, sản lượng ethanol sinh học đạt 76%; từ khơng thể kết luận liệu sản lượng tối đa ethanol sinh học có đạt đỉnh trước hay khơng Hình 7: Profile động học trình sản xuất ethanol sinh học sử dụng chiến lược tiền đường hóa tới lên men đồng thời chất sinh khối Sg qua tiền xử lý Ngược lại, công trình nghiên cứu Tan Lee (2016) sử dụng chiến lược PSSF thu sản lượng ethanol sinh học 92,7% vòng chưa đầy 3,5 Sau 36 lên men, nồng độ ethanol sinh học giảm xuống nồng độ cuối 10,39 ± 1,17 g/L Điều bay ethanol nấm men tạo thành sản phẩm phụ thay mà định lượng hệ thống 22 phân tích sử dụng nghiên cứu Hơn nữa, nấm men bắt đầu tiêu thụ ethanol sinh học mà sản xuất, nghiên cứu gợi ý chủng nấm men sản xuất ethanol sinh học có khả đồng hóa ethanol sinh học nguồn carbon ưu tiên glucose bị cạn kiệt Nồng độ hiệu suất chuyển hóa thu nghiên cứu tương tự hiệu suất báo cáo nghiên cứu khác Chuẩn độ thu nghiên cứu cao so với kết del Río et al (2019), người đạt sản lượng ethanol sinh học 12,23 14,10 g/L sử dụng Sargassum muticum Saccharomyces cerevisiae PE-2 chiến lược SSF, tương ứng với hiệu suất chuyển hóa 81% Kết tương tự Hou et al (2015), làm việc theo hai chiến lược lên men SSF SHF sinh khối Laminaria digitata sử dụng nấm men S cerevisiae Họ sản xuất 14,7 20,7 g/L ethanol (tương ứng với 50,5 70,6% hiệu suất chuyển đổi) cách sử dụng SSF SHF tương ứng Họ cho sản lượng ethanol thấp hiệu suất giai đoạn thủy phân enzyme Trong nghiên cứu khác, Kim et al (2015) áp dụng chiến lược SSF SHF với chủng S cerevisiae KCTC 7906 để lên men sinh khối rắn tiền xử lý nồi hấp Gelidium amansii Nồng độ ethanol thu 3,33 3,78 g/L, 2% (w/v) sinh khối rắn sử dụng làm nguyên liệu chiến lược SHF SSF, kết tương ứng với 74,3 84,9% hiệu suất ethanol chuyển hóa IV KẾT LUẬN Nghiên cứu mơ tả phát triển quy trình sử dụng Sargassum spp làm chất sau tiền xử lý áp suất cao khả đầy hứa hẹn làm nguyên liệu cho sản xuất ethanol sinh học Theo chiến lược PSSF, nồng độ ethanol sinh học cuối 18,14 g/L đạt (76% hiệu suất theo lý thuyết) Các kết từ nghiên cứu cho thấy rằng: sinh khối Sargassum spp dễ dàng thu từ bãi ven biển nguyên liệu hứa hẹn tương lai để sản xuất nhiên liệu sinh học, nhiên cần tìm kiếm chiến lược mở rộng quy mô tương lai gần [5] 23 V TÀI LIỆU THAM KHẢO Sci-Hub | Fungal pretreatment as a sustainable and low cost option for bioethanol production from marine algae | 10.1016/j.jclepro.2020.121763, https://sci-hub.hkvisa.net/10.1016/j.jclepro.2020.121763 Vasić, K., Knez, Ž., Leitgeb, M.: Bioethanol Production by Enzymatic Hydrolysis from Different Lignocellulosic Sources Molecules 26, 753 (2021) https://doi.org/10.3390/molecules26030753 Jambo, S.A., Abdulla, R., Mohd Azhar, S.H., Marbawi, H., Gansau, J.A., Ravindra, P.: A review on third generation bioethanol feedstock Renewable and Sustainable Energy Reviews 65, 756–769 (2016) https://doi.org/10.1016/j.rser.2016.07.064 Orozco-González, J.G., Amador-Castro, F., Gordillo-Sierra, A.R., García- Cayuela, T., Alper, H.S., Carrillo-Nieves, D.: Opportunities Surrounding the Use of Sargassum Biomass as Precursor of Biogas, Bioethanol, and Biodiesel Production Frontiers in Marine Science 8, (2022) Aparicio, E., Rodríguez-Jasso, R.M., Pinales-Márquez, C.D., Loredo- Treviđo, A., Robledo-Olivo, A., Aguilar, C.N., Kostas, E.T., Ruiz, H.A.: Highpressure technology for Sargassum spp biomass pretreatment and fractionation in the third generation of bioethanol production Bioresource Technology 329, 124935 (2021) https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.124935 i ... lên men, sản lượng ethanol sinh học đạt 76%; từ khơng thể kết luận liệu sản lượng tối đa ethanol sinh học có đạt đỉnh trước hay khơng Hình 7: Profile động học trình sản xuất ethanol sinh học sử... Hơn nữa, nấm men bắt đầu tiêu thụ ethanol sinh học mà sản xuất, nghiên cứu gợi ý chủng nấm men sản xuất ethanol sinh học có khả đồng hóa ethanol sinh học nguồn carbon ưu tiên glucose bị cạn kiệt... nguồn lượng tương lai gần Hiện nay, ethanol sinh học nguồn nhiên liệu thay tiềm tính chất tái tạo lượng khí thải carbon thấp Tuy nhiên, nguyên liệu làm ethanol sinh học hệ thứ thứ hai cạnh tranh đất