BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN CÔNG NGHỆ LÊN MEN

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA SINH HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG  BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN: CÔNG NGHỆ LÊN MEN GVHD: ĐỖ THỊ HỒNG TUYẾN NHĨM: LÊ THỊ THÙY DUNG MSSV: 2008190316 TRẦN THỊ KIỀU VĨ MSSV: 2008190496 LÊ THỊ HẰNG MSSV: 2008190334 TRẦN NGUYỄN HỒNG LAN MSSV: 2008190364 TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG NĂM 2022 MODULE SẢN PHẨM TRAO ĐỔI CHẤT BẬC LÊN MEN SINH TỔNG HỢP ACID LACTIC Cơ sở lý thuyết 1.1 Mục tiêu - Xác định điều kiện, môi trường cần thiết để lên men thu acid lactid - Thực thao tác chuẩn bị môi trường, cấy giống vi sinh vật ni cấy - Phân tích thay đổi thông số canh trường nuôi cấy vi khuẩn lactid - Thực thao tác thu nhận sản phẩm acid lactid 1.2 Lên men lactic - Acid lactic loại acid hữu tự nhiên sử dụng nhiều cơng nghiệp hóa chất, dệt, thực phẩm dược phẩm Được sản xuất thương mại nhờ lên men cacbohydrate - vi khuẩn lactic Lên men lactic loại hình lên men phát triển tự nhiên - Lên men lactic trình trao đỏi lượng Các phân tử ATP hình thành trình chuyển hóa chất (lactose) vi khuẩn giữ kaij tế bào để phục vụ cho trình trao đổi sinh trưởng vi sinh vật Ngược lại, sản phẩm acid lactic, ethanol, CO vi khuẩn thải vào môi trường lên men Kết hàm lượng acid tích lũy mơi trường lên men ngày làm giảm pH môi trường kéo theo biến đổi hóa lý khác - Lên men lactic đồng hình: trình lên men mà lượng acid lactic tạo thành chiếm 90%, lượng nhỏ pyruvate huyến hóa thành acid acetic,ethanol, CO2,acetoin - Các chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình như: Lactobacillus casei, Lactobacillus cremoris, L bulgaricus, L delbrueckii - Lên men lactic dị hình: có khoảng 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngồi cịn có sản phẩm phụ tương tác với tạo thành ester có mùi thơm Acid lactic tạo thành chiếm 40%, rươu ethylic 10%, acid lactic 10%, loại khí 20% 1.3 Vi khuẩn lactic - Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacilliaceae Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+) không di động, thuộc nhóm yếm khí, khơng chứa cytochrome enzyme catalase, có khả sinh tổng hợp enzyme peroxidase mạnh - Vi khuẩn lactic có đa dạng, tế bào hình cầu hình que 1.4 Cơ chế trình lên men acid lactic Acid lactic tạo thành qua trình lên men đồng sau: Glucose Glucose - - phosphate Fuctose - - phosphate Fuctose - 1,6 - diphosphate Phosphoglyceraldehyde Phosphate dioxyacetone Acid - 1,3 - diphosphoglyceric Acid pyruvic Acid lactic 1.5 Nguyên liệu Vi khuẩn lactic sử dụng nhiều nguồn đường lactose, glucose, galactose, maltose, dextrin, chí L delbrueckii có khả đồng hóa tinh bột Trong sản xuất công nghiệp người ta sử dụng mật rỉ đường để lên men rẻ tiền, dễ kiếm Trước tiên mật rỉ cần xử lí để tẩy màu tách chất keo mật rỉ Xử lí màu người ta dùng than hoạt tính Mật rỉ pha lỗng tỉ lệ 1:3, sau cho chảy qua cột than hoạt tính Than hoạt tính hấp thụ chất màu Sau làm lỗng mật rỉ đến nồng độ chất khô 15% dùng H2SO4 5% theo khối lượng dịch để acid hóa mơi trường H2SO4 có saccharose thành đường nghich đảo giúp q trình lên men sau tốt Trong giai đoạn người ta đun dung dịch 90-95⁰C Hóa chất, dụng cụ, thiết bị 2.1 Hóa chất HĨA CHÂT STT TÊN HÓA CHÂT SỐ LƯỢNG GHI CHÚ Glucose 10g Tổ MT MRS 100g Lớp Cao nấm men 5g Tổ NaOH 25g Tổ HCL 50ml Tổ Tím kết tinh 50ml Lớp Lugol 50ml Lớp Fuchsin 50ml Lớp Phenolphtalein 50ml Lớp 10 Nước cất 500ml Tổ 11 Cồn 50ml Tổ 12 Xanh methylene 15ml Lớp 13 K2HPO4 2g Lớp 14 MgSO4 3g Lớp 15 ZnSO4.7H20 1g Lớp 16 (NH4)2SO4 18g Lớp 17 Ca(OH)2 20g Lớp 18 Bông không thấm nước 100g Tổ 19 Bông thấm nước 50g Tổ 2.2 QUY CÁCH Dụng cụ DỤNG CỤ STT Tên dụng cụ Quy cách SL/ĐVT Ghi Ống nghiệm 𝞍=18mm Tổ Hộp petri 𝞍=100ml nút Tổ mài Ống hút Tổ Quả bóp Tổ Bình tia Tổ Que cấy vịng Tổ Que cấy móc Tổ Lame + lamelle 3+3 miếng Tổ Đèn cồn Tổ 10 Cốc thủy tinh 100ml Tổ 11 Cốc thủy tinh 200ml Tổ 12 Cốc thủy tinh 1000ml Lớp 13 Giá ống nghiệm inox Tổ 14 Phễu thủy tinh Vừa Tổ 15 Gía thủy tinh Tổ 16 Buret Tổ 17 Màng bọc PVC cuộn Lớp 18 Giấy báo Cũ kg Lớp 19 Thung buộc Sợi 10 Lớp 20 Ống ly tâm Nhựa 10 Lớp 21 Gía pipet 100 ml 10 Lớp 22 Eppendorf 1,5ml 10 Tổ 23 Đầu típ 1ml 100 Lớp 24 Đầu típ 0,1ml 100 Lớp 25 Hộp đựng đầu típ lớn hộp Lớp hộp Lớp 500ml ( hấp được) 26 Hộp đựng đầu típ nhỏ ( hấp được) 27 Đũa thủy tinh 2.3 Dài Tổ Thiết bị STT Tên thiết bị Quy cách Số lượng/ĐVT Ghi Nồi hấp tiệt trùng Cái Lớp Cân điện tử Cái Lớp Kính hiển vi quang học Cái Lớp Tủ ấm Cái Lớp Tủ cấy Cái Lớp pH kế Cái Lớp Brix kế Cái Lớp Tủ lạnh Cái Lớp Máy lắc Cái Lớp 10 Máy ly tâm >5000 v/p Cái Lớp 11 Fermenter lít Cái Lớp 12 Micropipet 1000 l Cái Lớp 13 Micropipet 100 l Cái Lớp 10-30% Quy trình cơng nghệ Quy trình ni cấy Môi trường lên men Khử trùng Lên men Giống vi khuẩn lactic Canh trường Xác định hàm lượng acid lactic Thu nhận acid lactic Acid lactic thô Các bước thực 4.1 Lập đường chuẩn acid lactic Bước Pha ml acid lactic chuẩn ml nước cất để stock nồng độ 120 g/L (khối lượng riêng acid lactic 1,2g/ml) Bước Pha loãng stock để dãy nồng độ acid lactic gồm 0,1; 0,5; 1; 2; 5; 10 (g/L) Bước Hút 50µl dung dịch acid lactic nồng độ khác cho vào ống nghiệm Bước Cho thêm 2ml FeCl3 0,3% vào ống nghiệm Bước Lắc đo OD390 (dung dịch FeCl3 0,3% dùng trắng mẫu), điển kết vào bảng Bảng Xây dựng đường chuẩn acid lactic Ống nghiệm Nồng độ acid lactic (g/L) 0.1 0.5 10 OD390 Bước Vẽ đường tương quan giá trị OD390 nồng độ acid lactic tương ứng 4.2 Lên men thu nhận acid lactic Bước Pha chế môi trường nhân giống, môi trường lên men acid lactic dung dịch điều chỉnh pH Vi khuẩn lactic nhân giống môi trường MRS Bảng Thành phần môi trường MRS Tên chất Hàm lượng Protease Peptone 10g Cao thịt bò 10g Cao nấm men 5g Dextrose 20g Polysorbate 80 1g Ammonium citrate 2g Natri acetate 5g MgSO4 0,1g MnSO4 0,05g K2HPO4 2g Agar 15g Nước 1000mL Bảng Môi trường lên men acid lactic Tên chất Hàm lượng Glucose 10g Cao nấm men 5g Natri acetate 5g K2HPO4 2g Nước cất 1000mL pH cuối 6,5 Mỗi lớp pha: − 1000 mL môi trường lên men đưa vào fermenter − 250 mL NaOH 2M − 250 mL H2SO4 2M Bước Bao gói giấy bịt nắp dụng cụ mơi trường Bao gói pipet 10mL, dụng cụ chứa mơi trường, đầu típ Bước Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy dụng cụ 1210C, 20 phút Bước Vệ sinh khu vực thao tác cồn 700 lấy môi trường để nguội Bước Kiểm tra giống Lactobacillus acidophillus (*) Kiểm tra trạng thái tế bào, xác định mật độ phương pháp đo độ đục (*) giống Lactobacillus acidophillus cần nhân giống môi trường lỏng MRS trước 24 Bước Cấy giống Lactobacillus acidophillus từ môi trường MRS fermenter với tỷ lệ 5% Bước Cài nhiệt độ lên men 35oC, pH =6 Cài đặt tốc độ bơm acid base 0,5 ml/s Bước Kiểm tra thông số (2h lần, điểm cuối 46h) : nồng độ sinh khối,hàm lượng acid lactic(g/L) Xác định nồng độ acid lactic phương pháp quang phổ Nguyên tắc: Phản ứng sắt (III) chloride với acid lactic môi trường dung dịch tạo thành sắt (III) lactate có màu xanh vàng, hấp thụ cực đại bước sóng 390 nm Cách tiến hành: − Cho 50 µl mẫu cần xác định nồng độ acid lactic vào ống nghiệm (đối với mẫu canh trường cần lọc bỏ sinh khối trước) − Bổ sung ml dung dịch FeCl3 0,3 % vào ống nghiệm chứa mẫu, lắc − Dựa vào đường chuẩn tương quang OD 390 nm nồng độ acid lactic để xác định nồng độ acid lactic canh trường Kết thảo luận  Nuôi cấy Lactobacillus casei Hình Vi khuẩn Lactobacillus casei Nhận xét: Sau khi thực cấy ria vi khuẩn lactic mơi trường MRS, khuẩn lạc có dạng hình cầu, màu trắng đục, phân lập riêng biệt bề mặt môi trường nuôi cấy  Tiêu nhuộm Gram nấm men Hình Tiêu nhuộm Gram vi khuẩn Lactobacillus casei  Xây dựng đường chuẩn acid lactic Lập đường chuẩn sinh khối vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Bảng Kết đo OD sinh khối vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Ống nghiệm Nồng độ acid lactic (g/L) OD390 0.1 0,042 0.5 0,085 0,124 0,282 5 0,434 10 0,819 Hình Đường chuẩn acid lactic  Lên men thu nhận acid lactic - Kết đo OD Bảng Kết đo OD lên men thu nhận acid lactic Thời gian 0h 2h 20h 22h 24h 26h 27,5h 44h 46h OD390 nm 0,159 0,620 0,968 0,603 0,521 0,511 0,544 0,549 Từ giá trị OD đo được, dựa vào đường chuẩn acid lactic: y = 0,0766x + 0,0603 suy hàm lượng acid lactic: Thời điểm lấy Thời gian (h) Xác định sinh khối Hàm lượng acid lactic OD600 ( g/L) OD390 mẫu 12h-13h30 23/03 0h 0,367 14h-15h30 23/03 2h 0,249 1,289 8h30 24/03 20h 0,227 7,307 10h20 24/03 22h 0,266 11,850 12h30 24/03 24h 0,227 7,085 14h30 24/03 26h 0,585 6,014 vòng/ phút 15 phút để loại bỏ hoàn toàn sợi nấm bào tử dịch lên men − Chỉnh pH canh trường, pH = 1-2 HCl đậm đặc − Hút 10 ml canh trường sau chỉnh pH vào phễu chiết, tiếp tục cho vào phễu chiết 10 ml ethyl acetate (EtOAc), lắc mạnh 60s để có tiếp xúc pha Để yên 10 phút để tách pha hoàn toàn, thu dịch phía chuyển sang phễu chiết − Lặp lại thêm lần Toàn ethyl acetate thu tiếp tục trích ly với đệm phosphate pH = 7,4 − Hút 10 ml đệm phosphate cho vào 30 ml ethyl acetate, lắc nhẹ phút, để yên 10 phút Toàn GA3 hấp thụ vào đệm phosphate bên dưới, hút bỏ lớp ethyl acetate phía Để nhiệt độ phịng khoảng 2h để lượt ethyl acetate bốc khỏi hỗn hợp dung dịch − Chuẩn bị ống nghiệm: hút ml đệm phosphate sau trích ly cho vào ống nghiệm, thêm ml nước cất vào ống nghiệm, lắc − Tiếp tục thêm vào ống ml thuốc thử phosphor molybdic, lắc − Đun cách thủy nhiệt độ 95-100oC 10 phút Thời gian tính từ lúc nhiệt độ nước bên ống nghiệm (khoảng phút) − Sau đun, làm lạnh nhanh Đem đo độ hấp thụ quang bước sóng 660nm Kết thảo luận 5.1 Nuôi cấy sinh tổng hợp GA3  Nuôi cấy nấm mốc Gibberella fujikuroi Hình Nấm mốc Gibberella fujikuroi 19 Nhận xét: Nấm mốc sau thực cấy điểm mơi trường PDA có hình thái dạng sợi, màu trắng, phân bố bề mặt môi trường cấy  Tiêu nấm mốc Gibberella fujikuroi Hình Tiêu tế bào nấm mốc Gibberella fujikuroi 5.2 Thu nhận GA3 Khối dịch lên men thu được: 56,019 g Khối lượng sinh khối sau lên men: 0,196 g  Xây dựng đường chuẩn GA3 Hình Dung dịch sau cho thuốc thử phosphor molybdic 20  Kết đo OD: Ống nghiệm OD660nm 0,004 0,03 0,06 0,089 10 0,117 0,154 0,173 0,216 0,267 0,277 0,302 Hình Đường chuẩn GA3  Giá trị đo OD λ=660 nm qua mốc thời gian Bảng Giá trị OD qua mốc thời gian Thời gian Ống Ống Trung bình 48h 0.273 0.147 0.21 72h 0.198 0.192 0.195 96h 0.304 0.256 0.28 120h 0.267 0.314 0.291 168h 0.308 0.261 0.285  Nồng độ GA3 qua mốc thời gian Dựa vào phương trình đường chuẩn Gibberelin y = 3,0991x - 0.0014, ta có: Mốc thời gian Nồng độ GA3 48h 0,068 72h 0,063 96h 0,09 120h 0,094 168h 0,092 21 Nồng độ Gibberellin theo thời gian (g/l) 0.1 0.09 0.08 0.07 Nồng đọ GA3 (g/l) 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 40 60 80 100 120 140 160 180 Thời gian Hình Nồng độ GA3 theo thời gian  Xác định GA3 mẫu: Hình Dung dịch sau cho thuốc thử phosphor molybdic  Kết đo OD: Ống nghiệm Ống Ống OD660nm 0,198 0,192 22 Từ giá trị OD ghi nhận được, tính ∆ OD theo cơng thức: ∆ OD = ODx - ODo Trong đó:  ODx giá trị ghi nhận tương ứng với mẫu canh trường sau trích ly  ODo giá trị ghi nhận tương ứng với mẫu đối chứng  ∆ OD1 = 0,198 - 0,004 = 0,194  ∆ OD2 = 0,192 - 0,004 = 0,188 Từ giá trị ∆ OD tính được, xét giá trị ∆ OD nằm giới hạn đường chuẩn GA3 0,01 - 0,1 g/l hay đường chuẩn GA3 0,1 - 0,5 g/l, thay giá trị ∆ OD biến số x phương trình đường chuẩn dạng y = ax + b tính nồng độ GA3 mẫu Ta có phương trình đường chuẩn y = 3.0991x - 0.0014  Nồng độ GA3 mẫu 1: y = 0,6 g/l  Nồng độ GA3 mẫu 2: y = 0,581 g/l 23 MODULE CHỦ ĐỘNG KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ CƠ CHẤT CẢM ỨNG (CASEIN) ĐẾN SỰ SINH TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE CỦA ASPERGILLUS NIGER ĐẶT VẤN ĐỀ Protease (còn gọi proteinase peptidase) nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-) chuỗi polypeptide Protease chiếm khoảng 60% thị trường enzyme công nghiệp Trong đó, protease từ vi sinh vật chiếm khoảng 40% tổng số enzyme bán toàn giới Nghiên cứu tổng hợp protease từ vi sinh vật Aspergillus niger là vi sinh vật quan trọng sử dụng cơng nghệ sinh học. Nó sử dụng nhiều thập kỷ để sản xuất enzyme ngoại bào (thức ăn) axit citric Aspergillus niger dòng nấm sợi phân bố rộng rãi nhiều loại chất tự nhiên sản phẩm nông nghiệp, biết đến với khả sinh tổng hợp nhiều loại enzyme, có protease Từ định hướng trên, chúng tơi xác định mục đích nghiên cứu đề tài để xác định khả sinh tổng hợp enzyme protease từ chủng nấm mốc Aspergillus niger tác động yếu tố ảnh hưởng nồng độ chất (casein) CƠ SỞ LÝ THUYẾT 2.1 Quá trình lên men Protease ngoại bào sản xuất theo phương pháp lên men chìm lên men bán rắn Phương pháp lên men bán rắn đặc biệt thích hợp cho phát triển nấm chúng yêu cầu độ ẩm thấp so với vi khuẩn Ngoài ra, phương pháp lên men tương đối đơn giản, rẻ tiền mang lại hiệu suất sinh tổng hợp enzyme cao Với thành phần môi trường lên men gồm cám, trấu, casein Casein nguồn chất tổng hợp protease cao môi trường bán rắn 2.2 Đối tượng vi sinh vật Aspergillus niger loại nấm sợi đơn, bào tử dính dài trơn khơng màu hay nâu, thể bình đáy, túi nấm trịn đầu xịe Aspergillus niger sinh sản hình thức bào tử dính khơng túi bao bọc Cơ thể dạng sợi, gọi khuẩn ty hay sợi nấm (hypha), nhiều sợi (lypha), hợp lại thành hệ sợi nấm (mycelium) Khuẩn ty nấm tăng trưởng có vách ngăn 24 Aspergillus niger đồng hóa tốt loại đường glucose, fructose, saccharose, mannose Đối với đường sorbose, galactose, Aspergillus niger đồng hóa mức tốt, cịn đường lactose đồng hóa mức trung bình Aspergillus niger có khả sinh enzyme amylase, protease, pectinase, α– amylase, glucoamylase 2.3 Sản phẩm protease Protease enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho trình thủy phân liên kết peptit ( -CO-NH-) phân tử protein peptit thành enzyme tự Enzyme protease enzyme thủy phân liên kết pectid (-CO-NH-) phân tử protein giải phóng acid amin, pepton dittripepton HĨA CHẤT- DỤNG CỤ- THIẾT BỊ 3.1 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị A DỤNG CỤ STT TÊN DỤNG CỤ SỐ LƯỢNG Bình tia Cốc thủy tinh 500ml Cốc thủy tinh 250ml Cốc thủy tinh 50 ml Đũa thủy tinh Pipet 10 ml Pipet ml Pipet ml Phễu thủy tinh Φ 60 10 Giá ống nghiệm inox 11 ống nghiệm Φ 18 20 ống 12 Bóp cao su 13 Bình tam giác 14 Giá pipet 15 Chai tối màu cái 250 ml 25 16 Giấy lọc hộp 17 Bình tam giác 18 Ống nghiệm 250ml 18 ống B HÓA CHẤT STT TÊN HÓA CHẤT SL/ ĐVT Nước cất lần lít Casein 1% Cồn 98 Aspergillus niger NaNO3 2.0g K2HPO4 1.0g MgSO4 0.5g KCL 0.5g FeSO4 0.1g 10 Sucrose 30g 11 Agar 20g 12 TCA 5% 25ml 13 HCl 0,2N 2ml 14 Tyrosin 1/4000N 1ml 15 NaOH 0,5N 25ml 16 Thuốc thử Folin 1/3 5ml GHI CHÚ 500ml GV chuẩn bị C THIẾT BỊ STT TÊN THIẾT BỊ SỐ LƯỢNG Cân kĩ thuật Tủ cấy Nồi hấp Máy đo OD 26 Máy lắc Máy ly tâm Máy đo pH 3.2 Pha hóa chất - Pha dung dịch TCA 5%: cân 5g pha với nước cất thành 100ml - Pha dung dịch tyrosin 1/400N: cân 0,045g tyrosin (cân số lẻ), hịa tan hồn tồn 100ml HCl 0,2N - Pha dung dịch casein 1%: cho 1,9g casein + 20 - 30ml dd NaOH 0,5N vào cốc 250ml Đặt lên máy khuấy từ, gia nhiệt (50 - 60 oC) khuấy cho casein tan hết, tiếp tục khuấy không gia nhiệt Sau nhỏ từ từ HCl 0,5N để pH đạt 7,5 - 8,0 Cuối dùng đệm Na2HPO4 pH = định mức đến 200ml - Pha dung dịch NaOH 0,5N: Pha 10g 500ml nước cất - Pha thuốc thử Folin 1/3N: từ Floin 1N pha loãng lần nước cất 3.3 Chuẩn bị môi trường Bảng Thành phần khống bổ sung mơi trường lên men 3.4 Thành phần Hàm lượng NaNO3 0,2g K2HPO4 0,1g MgSO4 0,05g KCl 0,05g FeSO4 0,01g Nước cất 100ml Quy trình ni cấy Quy trình ni cấy Aspergillus niger để thu nhận enzyme protease khái quát thông qua sơ đồ sau 27 Aspergillus niger Nhân giống Lên men Khảo sát yếu tố ảnh hưởng Thu nhận sản phẩm thô (1) Enzyme protease thơ Hoạt tính enzyme (2) Hình 3.4 Sơ đồ quy trình ni cấy thu nhận enzyme protease (1): Thu nhận sản phẩm thô cách tạo dịch bào tử (2): Dùng phương pháp Ansson cải tiến để xác định hoạt tính enzyme protease Thực nghiệm thức 2%, 4%, 6% 3.5 Chuẩn bị giống Aspergillus niger giữ giống thạch nghiêng PDA (Potato dextrose agar) 4°C Cấy chuyển giống sang ống thạch nghiêng PDA khác, để nhiệt độ 34 - 35˚C 72 đến 96 Lấy mL nước cất vô trùng đánh tan bào tử Aspergillus niger chuyển sang bình tam giác chứa mơi trường PDA, để nhiệt độ 34-35˚C 72 đến 96 Mật độ bào tử xác định cách đếm buồng đếm hồng cầu đạt 107 bào tử/mL NỘI DUNG THỰC HIỆN 28 4.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ casein đến trình sinh tổng hợp enzyme protease Aspergillus niger Mục đích: Chọn tỷ lệ casein thích hợp cho nấm mốc để thu enzyme protease có hoạt tính cao Cách tiến hành: _ Nhân giống : Trong môi trường PDA đĩa thạch Nuôi cấy 72 đến 96 _ Lên men (nhân sinh khối): Chuẩn bị mơi trường bình tam giác 500ml chứa 10g môi trường bán rắn với tỷ lệ cám : trấu (7:3), bổ sung khoáng (bảng 3.3) tạo độ ẩm cho môi trường với độ ẩm khoảng 45% Sau bổ sung chất vào bình với tỷ lệ bảng 4.1 Đem hấp khử trùng 20 phút, để nguội Sau cho vào bình lát thạch chứa bào tử nấm mốc để lên men Nghiệm thức Tỷ lệ chất Casein (%) (w/v) CT1 CT2 CT3 Bảng 4.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ chất casein tới khả sinh enzyme protease Yếu tố theo dõi: hoạt tính enzyme protease Kết thu được, điền vào bảng sau: Tỉ lệ nguồn chất (%) (w/v) CT1 CT2 CT3 Hoạt tính protease (UI/mL) 4.2 Phương pháp phân tích (phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease) 4.2.1 Thu sản phẩm thô (enzyme protease thô) 29 Sau lên men, sử dụng 100 mL dung dịch đệm phosphate pH = 7,6 cho vào môi trường lên men, dùng đũa khuấy để mơi trường bình trộn với dung môi 15 phút Lọc lấy dịch qua lọc thu lấy dịch enzyme thô 4.2.2 Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Ansson cải tiến Nguyên tắc: Khả thủy phân enzyme protease thực với chất protein (hemoglobin, casein, albumin) tạo sản phẩm tan dung dịch TCA peptide có chứa tyrosin Việc định lượng tyrosin phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteu cho biết hoạt động thủy phân enzyme xác định hoạt tính enzyme Các bước tiến hành: Chuẩn bị ống nghiệm theo bảng Bảng 6.Chuẩn bị ống nghiệm đo hoạt tính protease Hóa chất Dung dịch Casein 1% Đơn vị ml Các ống nghiệm Ống tyrosin 2% 4% Ống mẫu 6% 2,5 2% 4% Ống không 6% 2,5 2% 4% 2,5 Để yên 35,5oC phút TCA5% ml 5,0 0,0 5,0 HCl 0,2N ml 0,0 0,5 0,5 ml 0,5 0,0 0,0 ml 0,0 0,5 0,0 Tyrosin 1/400N Dịch E protease Lắc Để yên 35,5oC 10 phút TCA 5% Dịch E protease ml 0,0 5,0 0,0 ml 0,5 0,0 0,5 Lắc đều, để yên 10 phút 25oC Lọc DD lọc ml 2,5 2,5 2,5 NaOH 0,5N ml 5,0 5,0 5,0 30 6% Thuốc thử Folin 1/3 ml 1,0 1,0 Lắc để yên 15 phút Đo OD 595nm  Tính kết quả: HT = 450 x ∆ ODM X × × ∆ ODT 10 X Trong : HT: hoạt tính enzyme protease (UI/ml) X1 : thể tích dung dịch tyrosin chuẩn (ml) X2: Thể tích dung dịch chứa enzyme (ml) ∆ODT = ODT – ODC, ∆ ODM = ODM - ODC Kết 5.1 Lên men nấm mốc Aspigillus niger Hình Lên men nấm mốc bổ sung chất casein tỷ lệ 5.2 Thu nhận enzyme protease thô Hình 10 Thu nhận enzyme thô tỷ lệ casein 2% 4% 6% 31 1,0 5.3 Xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Ansson cải tiến Hình 11 Dung dịch sau cho thuốc thử folin 1/3N  Kết đo OD: Bảng Kết đo OD Các ống nghiệ m OD 595 nm Ta có: Casein 2% Ống ống tyrosin mẫu 0,400 0,30 Casein 4% ống Ống ống Casein 6% ống không tyrosin mẫu 0,269 0,365 0,293 0.438 ΔODT = ODT - ODC ΔODM = ODM - ODC Enzyme protease tỉ lệ chất casein 2%: ΔODT = 0,400 – 0, 269 = 0,131 ΔODM = 0,300 – 0,269 = 0,031 Enzyme protease tỉ lệ chất casein 4%: ΔODT = 0,438 – 0,293 = 0,145 ΔODM = 0,365 – 0,293 = 0,072 Enzyme protease tỉ lệ chất casein 6%: ΔODT = 0,463 – 0,319 = 0,144 ΔODM = 0,387 – 0,319 = 0,068  Hoạt tính enzyme protease 32 Ống khơng tyrosin 0,463 ống ống mẫu không 0,387 0,319  Enzyme protease tỉ lệ chất casein 2%: HT = 450× ∆ OD M X 450 ×0,031 0,5 × × = × × =10,649¿ ∆ OD T 10 X 0,131 10 0,5  Enzyme protease nồng tỉ lệ chất độ casein 4%: HT = 450× ∆ OD M X 450 ×0,072 0,5 × × = × × =22,345 ¿ ∆ OD T 10 X 0,145 10 0,5  Enzyme protease tỉ lệ chất casein 6%: HT = 450× ∆ OD M X 450 ×0,068 0,5 × × = × × =21,25 ¿ ∆ OD T 10 X 0,144 10 0,5 Bảng Kết hoạt tính enzyme protease Tỉ lệ nguồn chất (%) (w/v) Hoạt tính protease (UI/mL) CT1 CT2 CT3 10,649 22,245 21,25  Nhận xét: Hoạt tính enzyme protease đạt giá trị lớn tỉ lệ chất casein 4% (22,245 UI/mL) đạt giá trị nhỏ tỉ lệ chất casein 2% (10,649 UI/mL) 33