KỸ THUẬT DI TRUYỀN “CÁC THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH” IMMUNOASSAY ThS Nguyễn Thị Mỹ Nương Email Mục tiêu, nguyên lý 2. Một số kỹ thuật thông dụng: ➢ Immumoprecipitation, flow cytometry ➢ Western blot ➢ ELISA ➢ Lateral Flow Immunoassay Systemsntmnuonghcmus edu vn 1 Nội dung 1 Mục tiêu, nguyên lý 2 Một số kỹ thuật thông dụng ➢ Immumoprecipitation, flow.
“CÁC THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH” IMMUNOASSAY ThS Nguyễn Thị Mỹ Nương Email: ntmnuong@hcmus.edu.vn Nội dung Mục tiêu, nguyên lý Một số kỹ thuật thông dụng: ➢ Immumoprecipitation, flow cytometry ➢ Western blot ➢ ELISA ➢ Lateral Flow Immunoassay Systems ➢ Immunohistochemistry (IHC)/Immunocytochemistry (ICC) Tài liệu tham khảo [1] David Wild (2013) The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques (4th ed.) Elsevier Science Mục tiêu – nguyên lý Phát protein/kháng thể kháng thể/protein nhờ tương tác kháng nguyên – kháng thể Nguyên lý kỹ thuật xuất phát từ ba đặc tính quan trọng kháng thể: - Linh hoạt - Đặc hiệu - Nhạy Mục tiêu – nguyên lý Thành phần: - Kháng nguyên: tính đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào kích thước cấu trúc kháng nguyên - Kháng thể: + Sản xuất kháng thể: đa dòng, đơn dòng, tái tổ hợp + Các loại: kháng thể bắt giữ (capture Ab); kháng thể sơ cấp (primary Ab); kháng thể thứ cấp(secondary conjugate Ab) Các kiểu đánh dấu Đánh dấu phóng xạ I125 - Rất nhạy, ổn định, giữ lâu - Nguy hiểm Cộng hợp enzyme Nhạy, dễ, an tồn Phải đọc tín hiệu nhanh Cộng hợp huỳnh quang Rất nhạy, dễ, an - Nhạy, đặc hiệu, toàn nhiều màu, dễ Cần máy đọc tự động - Cần máy đọc Cộng hợp hạt nano - Nhanh, dễ, an toàn, giá thấp, thấy mắt thường - Độ nhạy đặc hiệu thấp Các kỹ thuật thông dụng Tạm chia thành nhóm: - Bắt giữ pha lỏng: kết tủa miễn dịch (immunoprecipitation, IP); flow cytometry - Bắt giữ giá thể: Western blot, ELISA, Lateral Flow Immunoassay Systems - Bắt giữ mô/tế bào: IHC, ICC 10 Advantages Disadvantages High sensitivity - more than one labeled secondary Possibility of background noise - secondary antibody can bind the primary antibody antibody may be cross-reactive Economical - fewer labeled antibodies are needed Longer procedure than direct ELISA technique Greater flexibility - different primary antibodies can additional incubation step for secondary antibody be used with a single labeled secondary antibody needed Best for: determining total antibody concentration in samples 18 19 Sandwich ELISA Advantages Disadvantages High sensitivity - 2-5 times more sensitive than direct or indirect ELISA Antibody optimization can be difficult cross-reactivity may occur between the High specificity - two antibodies are capture and detection antibodies involved in capture and detection Needs a standardized ELISA kit or tested Flexibility - both direct and indirect antibody pair detection can be used Best for: analysis of complex samples, since the antigen does not need to be purified prior to measurement 20 ELISA cạnh tranh 21 ELISA cạnh tranh Advantages Disadvantages Main advantage - no sample processing is required and crude or impure samples can be used More robust - less sensitive to sample dilution and Same limitations as base sample matrix effects than the sandwich ELISA ELISA - as each ELISA technique can be adapted More consistent - less variability between duplicate to a competitive format samples and assays Maximum flexibility - it can be based on direct, indirect or sandwich ELISA Best for: commonly used when only one antibody is available for the antigen of interest It is also suitable for detecting small antigens that cannot be bound by two different antibodies such as in the sandwich ELISA technique 22 Lateral Flow Immunoassay Systems Test strip 23 Cạnh tranh 24 Cấu trúc điển hình test strip 25 26 ICC / IHC / IF 27 28 Các bước 29 30 Immunohistochemistry (IHC) Hóa mơ miễn dịch 31 Các bước Xử lý mơ: - Cố định - Khử nước - Làm - Nhúng paraffin - Cắt mô 32 ... Lateral Flow Immunoassay Systems Test strip 23 Cạnh tranh 24 Cấu trúc điển hình test strip 25 26 ICC / IHC / IF 27 28 Các bước 29 30 Immunohistochemistry (IHC) Hóa mơ miễn dịch 31 Các bước Xử... mô/tế bào: IHC, ICC 10 Kết tủa miễn dịch Bài toán: Xác định protein X tương tác với protein số protein Y, Z, W,… X = Pak1-PBD gắn đuôi HA Y = Rac1 11 Kết tủa miễn dịch Bài toán: Muốn thu nhận protein... hiệu thấp Các kỹ thuật thông dụng Tạm chia thành nhóm: - Bắt giữ pha lỏng: kết tủa miễn dịch (immunoprecipitation, IP); flow cytometry - Bắt giữ giá thể: Western blot, ELISA, Lateral Flow Immunoassay