các kỹ thuật cơ bản trong công nghệ sinh học
BÁO CÁO THӴC TҰP CÁC KӺ THUҰT CƠ BҦN TRONG CÔNG NGHӊ SINH HӐC Gi̫ng viên hưͣng d̳n: ThS: NguyӉn Thӏ Hӗng Loan Sinh viên: Giang Huy DiӋm I. Câu hӓi đҫu bài: 1. Tҥi sao phҧi tinh sҥch protein? Trҧ lӡi : Vì khi protein ӣ dҥng tinh sҥch sӁ có hoҥt tính mҥnh hơn ӣ dҥng thô.Hơn nӳa, muӕn nghiên cӭu cҩu trúc cӫa protein nào đó thì cҫn phҧi có dҥng tinh khiӃt cӫa nó. 2. Có nhӳng cách nào đӇ tinh sҥch protein Trҧ lӡi : Có thӇ tinh sҥch bҵng đi Ӌn di không biӃn tính, các phương pháp sҳc ký, ly tâm siêu tӕc, Nhưng điӋn di ít dùng vì điӋn di chӍ tinh sҥch đưӧc 1 lưӧng nhӓ. 3. Sau khi tinh sҥch, làm thӃ nào đӇ thu nhұn protein mong muӕn? Trҧ lӡi : Ta có thӇ dùng phương pháp điӋn di xem có lên băng chuҭn không. Phương pháp khӕi phә sӁ giúp kiӇm tra có đoҥn peptit mà ta đã xác đӏnh trưӟc hay không. Hay mӝt phương pháp khác là miӉn dӏch huǤnh quang. Lưu ý: dù dùng phương pháp nào thì trưӟc khi thu nhұn protein đӅu phҧi kiӇm tr hoҥt tính protein xem có đúng protein đó không? II. Sҳc ký trao đәi ion - IEC 1. Giӟi thi Ӌu chung - Tương tác ion là cơ sӣ cӫa viӋc tách và tinh chӃ protein bҵng sҳc ký trao đәi ion (IEC) - IEC hi Ӌn tҥi là kӻ thuұt tách protein phә biӃn nhҩt, đưӧc dùng trong các quy trình tinh chӃ và tinh sҥch protein. Sҳc ký trao đәi ion : 75% Sҳc ký ái lӵc (AC): 60% Sҳc ký lӑc gel (GF): 50% 2. Nguyên tҳc - Protein sӁ gҳn thuұn nghӏch vӟi các chҩt trao đәi bҵng tương tác ion giӳa các nhó m man g điӋn tích trái dҩu. - Sau đó, protein đưӧc chiӃt ra khi tăng dҫn lӵc ion làm tương tác ion đó bӏ bҿ gãy. Ӣ bài này, t dùng gradient muӕi NaCl tӯ 1M Lưu ý: Cơ sӣ cӫa IEC là sӵ cҥnh tranh vӏ trí cӫa các nhóm điӋn tích vӟi chҩt cҫn tách gҳn vӟi chҩt trao đәi ion. Nó tuǤ thuӝc vào điӋn tích phân tӱ và lӵc ion cӫa môi trưӡng đӋm. Khi nӗng đӝ ion cҥnh tranh cao thì các ion cҫn tách sӁ rӡi khӓi chҩt trao đәi. Hình ҧnh minh hoҥ sҳc ký tro đәi ion III. Thӵc hành 1. Chuҭn bӏ dөng cө, hoá chҩt - Rӱa sҥch, tráng nưӟc cҩt, sҩy khô các dөng cө cҫn thiӃt - Pha dung dӏch đӋm chҥy sҳc ký Tris- HCl 50 mM, PH=8, có NaCl 50 mM (đӋm A) 2. Chuҭn bӏ mүu - Cân đưӧc 50g khoai tây, dùng dao thái nhӓ và nghiӅn trong 50ml đӋm A bҵng máy xay sinh tӕ. Sau đó tráng máy lӑc bҵng 50ml đӋm A. Tәng thӇ tích đӋm phҧi dùng là 100ml. - Ly tâm 10.000 rpm/20 phút đӇ thu dӏch trong - NӃu dӏch vүn đөc thì tiӃp tөc lӑc đӇ thu dӏch trong bҵng giҩy lӑc. - Sau khi lӑc ta tiӃn hành đo OD bưӟc song A280 - Đưa dung dӏch mүu vӅ pH =8 bҵng cách bә sung tӯng lưӧng nhӓ đӋm Tris ( kiӇm tra pH bҵng giҩy quǤ) 3. Chuҭn bӏ gel - Sӱ dөng gel DEAE-cellulose - Gel đã đưӧc chuҭn bӏ trưӟc, đã loҥi bӓ các hҥt gel nhӓ, vӥ trôi lơ lӱng. 4. Nhӗi cӝt gel - Hòa gel tron g 5 lҫn thӇ tích đӋm chҥy, đӇ lҳng, hút (gҥn) bӓ các hҥt gel nhӓ lơ lӱn g ӣ trên cho đӃn khi còn 1,5 thӇ tích. - Rӱa và tráng sҥch cӝt, lҳp dây dүn ra vào đҫu dưӟi, gҳn cӝt lên giá theo phương thҷng đӭng. Đánh dҩu vӏ trí 5ml bҵng cách đә 5ml nưӟc vào rӗi bơm ra. - Đóng phía dưӟi cӝt bҵng cách dӯng bơm. Khuҩy thұt nhҽ, hoà đӅu cӕc gel rӗi dùng pipet 1000µl (đҫu côn cҳt to phҫn đҫu) hút gel và thҧ tӯ tӯ vào cӝt (tránh tҥo bӑt khí) - Khӣi đӝng bơm cho dӏch đӋm chҧy ra và gel lҳng xuӕn g dưӟi tác dөng cӫa áp suҩt trong cӝt. TiӃp tөc thêm gel vào thưӡng xuyên cho đӃn khi lưӧng gel lҳng đҥt thӇ tích 5ml. - Khi gel đӃn vҥch 5ml, cho chҧy qua cӝt ít nhҩt 5ml đӋm vӟi tӕc đӝ khoҧng 30-60ml/h. Đây là bưӟc cân bҵng cӝt. 5. Gҳn mүu lên cӝt - Sau khi có nӗng đӝ protein ban đҫu tap pha loãng ra nӗng đӝ 20 mg/ml (cҫn lҩy 400 mg) nê ta sӁ lҩy 20ml dung dӏch mүu. - Cho 20ml mүu này chҧy vào cӝt tӯ tӯ đӇ n gҩm xuӕng hӃt - Rӱa protein khôn g gҳn trên cӝt bҵng đӋm A. Đo OD 280 < 0.1 thì dӯng lҥi. - Thu lҥi 500µl đӇ điӋn di sҧn phҭm. 6. Thu mүu - Rӱa chiӃt mүu bҵng gradient NaCl tӯ 0.05M đӃn 1M - Sӱ dөng máy thu phân đoҥn đӇ thu lҫn lưӧt 70 ӕng nghiӋm, mӛi ӕng 18 giӑt mүu. - TiӃn hành đo OD 280 các ӕng chҹn thu đưӧc theo thӭ tӵ 2,4,6,«.70. rӗi thӕng kê sӕ liӋu theo bҧng. KӃt quҧ - Protein = ଶ଼כሺ௧ãሻ Ǥ - Protein tәng sӕ = ଶ଼כሺ௧ãሻכ Ǥ Dung dӏch chi Ӄt thô ban đҫu đem đi pha loãng 10 lҫn rӗi đo OD ta thu đưӧc chӍ sӕ là 2,22(mg/ml) o Ta có: OD280 = 0.66 1mg protein/1 ml dӏch mүu. Protein tәng sӕ thu đưӧc là: ଶǤଶଶכଵכଵ Ǥ = 660.5 (mg) Thu đưӧc bҧn sӕ liӋu: IV. ĐiӋn di protein bҵng gel polyacrylamide có SDS 1. Đә gel - Đә gel polyacrylamide hai lӟp, gel cô là 4% và gel tách là 12% - Phҫn gel tách đưӧc đә trưӟc. Sau khi trùng hӧp hoàn toàn,đә phҫn gel cô. - Gel cô trùng hӧp hoàn toàn thì sau 30-60 phút thì sӱ dөn g đӇ đi Ӌn di. 2. ĐiӋn di - TiӃn hành điӋn di: protein tinh sҥch, dӏch chiӃt thô, dӏch lên cӝt, FT, rӱa 10ml đҫu, phân đoҥn 26, 40, 42, 60 - Trӝn 10µl mүu vӟi 30µlđӋm mүu (nӗng đӝ 4x). Đһt vào tӫ ҩm 90ºC trong 10 phút. ĐiӋn di mүu 20µl và marker 10µl. - ĐӋm chҥy đi Ӌn di là Tris-glycin, PH 8.8 chӭa SDS 1%. Chҥy điӋn di vӟi điӋn thӃ әn đӏnh 150V. . BÁO CÁO THӴC TҰP CÁC KӺ THUҰT CƠ BҦN TRONG CÔNG NGHӊ SINH HӐC Gi̫ng viên hưͣng d̳n: ThS: NguyӉn Thӏ Hӗng Loan Sinh viên: Giang Huy DiӋm I là cơ sӣ cӫa viӋc tách và tinh chӃ protein bҵng sҳc ký trao đәi ion (IEC) - IEC hi Ӌn tҥi là kӻ thuұt tách protein phә biӃn nhҩt, đưӧc dùng trong các