Đang tải... (xem toàn văn)
Đặc điểm tự nhiên của DNA: là một phân tử acid nucleic mang thông tin di truyền mã hóa cho hoạt động sinh trưởng và phát triển của các vật chất hữu cơ. Đặc biệt DNA có khả năng tự nhân đôi, sau khi nhân đôi 2 phân tử ADN mới (mỗi phân tử chứa một chuỗi cũ và một chuỗi mới) đều giống hệt trình tự nhau. Sự phân tách sản phẩm PCR khi điện di: sau khi kết thúc quá trình PCR thì vô số bản sao DNA được tạo thành, các sản phâm này sẽ được phân tích và đánh giá thông qua quá trình điện di nhờ vào đặc điểm và kích thước, độ cồng kềnh… của từng đoạn DNA.
phương pháp công nghệ sinh học ( điện di GEL , PCR, AFLP, RFLP ) − − − − + + Câu trình bày hiểu biết kĩ thuật điện di gel agarose Nguyên tắc điện di gel agarose: Kĩ thuật điện di gel agarose hoạt động nhờ vào lực kéo điện trường tác động vào phân tử tích điện kích thước lỗ thể (gel) Gel cấu tạo chuỗi cao phân tử (polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ D-galactose 3,6-anhydro-Lgalactose ) liên kết chéo với tạo thành hệ thống mạng lưới với kích thước mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử phản ứng tạo liên kết chéo Các phân tử phân tách di chuyển gel với vận tốc khác nhờ vào khác lực điện trường tác động lên chúng (nếu phân tử tích điện khác nhau),kích thước phân tử so với kích thước lỗ gel hình dạng, độ cồng kềnh phân tử Vị trí DNA gel xác định trực tiếp : băng DNA gel được nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) có thể phát ánh sáng tử ngoại Các yếu tố ảnh hưởng − Kích thước của phân tử Các phân tử DNA có kích thước lớn (khối lượng phân tử lớn) tốc độ dịch chuyển chậm Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi qua gel tốc độ tỷ lệ nghịch với hàm log10 khối lượng phân tử của chúng − Nồng độ agarose Đoạn DNA mang kích thước khác di ̣ ch chuyển ở các tốc độ khác qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác Cấu hình của DNA Các DNA dạng vòng đóng, vòng đứt mạch thẳng có kh ối lượng phân tử sẽ dich chuyển agarose gel ở các tốc độ khác DNA plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh DNA plasmid loại có dạng mạch thẳng Thiết bị điện di hóa chất điện di Thiết bị điện di agarose gel gồm phận bản: nắp, khay vận hành buồng điện di Nắp: nắp có đầu dây cáp điện nối điện cực buồng điện di với nguồn điện Khay vận hành bao gồm: khay đổ gel, khuôn đổ gel, lược Buồng điện di: nơi đặt gel trình điện di Buồng có rãnh để cài lược, hai điện cực tạo điện trường dung dịch − Hóa chất điện di Đệm pH: đệm điện di DNA thích hợp Tris-acetate-EDTA (TAE).Đệm giúp thiết lập giá trị pH, cung cấp ion để hỗ trợ cho độ dẫn + Thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr: quan sát DNA agarose gel thuận lợi Quy trình điện di Chuẩn bị dung dịch đệm gel Dung dịch đệm thường dùng TBE − + − + + + + − + + + − − − − − − − − − − Bản gel chuẩn bị dung dịch đệm 1x TBE hòa tan với hàm lượng agarose cần thiết đặt lò vi sóng đến tan hoàn toàn, đổ vào khuôn có lược cài sẵn để tạo gel với số giếng nạp mẫu cần thiết Khi gel đông cứng, đặt gel vào buồng điện di, đổ dung dịch đệm ngập gel khoảng 1-2 mm Nạp mẫu: Mẫu trộn với đệm thuốc nhuộm tra vào giếng Chạy điện di: sử dụng nguồn điện 100V, cường độ 100mmA, thời gian chạy điện di khoảng 40’ Nhuộm gel soi gel: kết thúc điện di gel lấy nhuộm đặt vào máy soi UV để quan sát kết điện di Ứng dụng điện di agarose gel Ước lượng kích thước phân tử DNA sau thực phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập đồ hạn chế DNA tạo dòng…) Phân tích sản phẩm PCR (ví dụ: chẩn đoán di truyền phân tử in dấu di truyền…) Phân tách DNA hệ gen cắt hạn chế trước thẩm tích Southern, RNA trước thẩm tích Northern Ưu điểm nhược điểm Ưu điểm phương pháp gel rót dễ dàng, không gây biến tính mẫu bền vững vật lý polyacrylamide Mẫu dễ thu hồi Nhược điểm agarose gel bị nóng chảy trình điện di, đệm bị tiêu hao, dạng khác nucleic acid chạy không ổn định Câu trình bày hiểu biết kĩ thuật điện di Nguyên tắc kĩ thuật điện di: Điện di tượng dịch chuyển phân tử tích điện tác động điện trường, hay nói cách khác kỹ thuật phân chia phân tử DNA, RNA, protein dựa đặc điểm vật lý khối lượng hay điện tích thực chúng − − − + + + + + + + + + Khi phân tử tích điện đặt điện trường, chúng dịch chuyển cực (+) (-) tùy theo điện tích chúng Protein có điện tích thực dương âm, nucleic acid có điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate dịch chuyển hướng đến cực dương Các phân tử protein nucleic acid chạy điện di khuôn đỡ (support matrix) giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose polyacrylamide gel Thông thường, gel khuôn đúc dạng phiến mỏng có cácgiếng để nạp (loading) mẫu Gel ngâm đệm điện di cung cấp ion để dẫn truyền dòng điệnvà vài loại đệm để trì pH giá trị không đổi tương đối Thiết bị điện di Thiết bị điện di gồm phận bản: nắp, khay vận hành buồng điện di Nắp: nắp có đầu dây cáp điện nối điện cực buồng điện di với nguồn điện Khay vận hành bao gồm: khay đổ gel, khuôn đổ gel, lược Buồng điện di: nơi đặt gel trình điện di Buồng có rãnh để cài lược, hai điện cực tạo điện trường dung dịch − Các thông số điện di: + Lực dẫn điện di hiệu điện hệ thống + Vận tốc phân tử tỉ lệ thuận với gradient hiệu điện xung quanh Các yếu tố quan trọng trình điện di − Đệm pH: Protein chất lưỡng tính, tích điện âm dương, chúng có chứa hai loại gốc acid base Điện tích thực protein xác định pH môi trường xung quanh, số lạo a.a mang nhóm carboxyl amine Axit nucleic lưỡng tính, tích điện âm đa số dệm điện di pH cần giữ ổn định để trì điện tích − Tác động nhiệt lên trình phân tách Sự điều khiển nhiệt then chốt bước điện di Nhiệt độ cao gây nhiều vấn đề: nhiệt cao khiến gel agarose bị nóng chảy, hư hại thiết bị điện di Các protein bị biến tính bất hoạt Các loại gel thông dụng trình điện di − Gel agarose + + + Là dẫn xuất polysacharide từ agar có độ tinh khiết cao, thường cung cấp dạng bột khô, trạng thái lỏng nhiệt độ cao, tạo gel nhieeetj độ khoảng 40oC Nông độ cao, mạng lưới nhỏ, thông thường nồng độ thích hợp cho sử dụng từ 0.4% đến 4% Ưng dụng để tách phân tích ADN, sử dụng EtBr tia UV để phát băng DNA + Gel polyacrylamide Điện di gel polyyacrymide có SDS: tách protein dựa KLPT Khi tách sds, di động xác định điện tích chuỗi polypeptide mà so khối lượng phân tử SDS chất tẩy anion gây biến tính protein Các bước − + + − − − − − − − − − − − − − − − − B1: xác định chất phân tích, loại, khối lượng phân tử B2: xác định gel B3: pha loãng dung dịch gel có nồng độ ( C%) xác định cần thiết cho việc điện di B4: đun nóng chảy gel, đổ gel vào khuôn, chờ gel đông B5:đặt gel vào bể điện di có dung dịch đệm, rút lược B6: tra mẫuvào giếng B7: khởi động thiết bị điện di B8: lấy gel từ bể điện di ngâm thuốc nhuộm bắt màu huỳnh quang, cho len máy soi UV có kết nối máy tính phân tích kết ứng dụng điện di Phương pháp điện di cho khả phân tách nhanh xác, giúp nhận biết, phân tích tinh DNA, phân tách protein Nhờ phương pháp mà người ta ứng dụng để phân tích giải trình tự DNA, ứng dụng nghiên cứu DNA hiệu Hạn chế: Nhiệt độ cao gây nhiều vấn đề: nhiệt cao khiến gel agarose bị nóng chảy, hư hại thiết bị điện di.Các protein bị biến tính bất hoạt Nhưng khắc phục cách dùng hỗ trợ thiết bị làm lạnh hóa chất điều nhiệt, Câu trình bày hiểu biết kĩ thuật PCR Nguyên lí bản: Đặc điểm tự nhiên DNA: phân tử acid nucleic mang thông tin di truyền mã hóa cho hoạt động sinh trưởng phát triển vật chất hữu Đặc biệt DNA có khả tự nhân đôi, sau nhân đôi phân tử ADN (mỗi phân tử chứa chuỗi cũ chuỗi mới) giống hệt trình tự Sự phân tách sản phẩm PCR điện di: sau kết thúc trình PCR vô số DNA tạo thành, sản phâm phân tích đánh giá thông qua trình điện di nhờ vào đặc điểm kích thước, độ cồng kềnh… đoạn DNA Nguyên lí kỹ thuật: Nhiệt độ: nhiệt độ cao dùng để tháo xoắn, tách sợi đôi DNA thành sợi đơn thay chp enzyme helicase Mồi: cặp mồi thiết kế để mồi nhận biết sợi có nghĩa DNA mà ta cần tái mồi nhận biết sợi đối nghĩa Enzyme: xúc tác cho trình lắp giáp nucleotide A,T,G,X vào mạch DNA tổng hợp Đơn phân: loai dNTP nguyên liệu tham gia tạo lên DNA − − − − • • • • • + + • • • Dung dịch đệm, pH: giúp cho enzyme Taq hoạt động chức năng, cân pH dung dịch Thiết bị PCR: Phản ứng PCR thực máy chu trình nhiệt Cần đáp ứng yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh xác Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm khuếch đại riêng nên thí nghiệm nghiên cứu cần tiến hành loại Các bước bản: − Xác định thành phần PCR + Các thành phần PCR DNA khuôn tinh ( sử dụng Proteinase K, CTAB để loại bỏ thành phần DNA) Mồi: gồm mồi xuôi mồi ngược tùy vào mục đích mà thiết kế cặp mồi Enzyme: thường sử dụng enzyme taq polymerase Các loại dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP, Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm phụ thuộc vào loại enzyme sử dụng, quan trọng Mg2+ Tính toán: cần xác định số lượng, thể tích mẫu cần tra vào giếng để định lượng thể tích thành phần cần cho phản ứng chạy PCR Tính toán tổng số thể tích thành phần cho vào tuýp lớn cho chia tuýp nhỏ tích Kỹ thuật mix: Mix thành phần theo nguyên tắc cho nước cho Taq cuối Sau chia hỗn hợp mix cho tuýp Cho nước để lấy hóa chất dê tan không bị bám dính đầu côn Cho taq cuối đẻ tránh taq hoạt tính để lâu − Đặt chu trình PCR + Phản ứng PCR gồm nhiều chu kì, chu kì gồm giai đoạn: Thời kì biến tính DNA: tách sợi đôi thành sợi đơn, nhiệt độ thiết kế 95 độ C, với nhiệt độ DNA tạo sợi đơn DNA Thời kì lai primer DNA: nhiệt độ thay đổi khoảng 50 độ C đến 60 độ C Nhiệt độ tùy thuộc vào loại marker mà ta sử dụng giai đoạn đoạn mồi bắt cặp với mạch đơn DNA khuôn mẫu vị trí bổ sung Thời kì kéo dài DNA nhờ Taq polymerase Ở nhiệt độ 72 độ C nhiệt độ tối ưu cho hoạt động DNA polymeerase Dưới tác động DNA polymerase đoạn mồi bắt cặp với DNA khuôn mẫu kéo dài Các DNA hình thành lại sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho chu kì − − − − − − + Thu nhận kết quả: sau chạy xong PCR cần tiến hành điện di sản phẩm gel agarose đê phân tích, đánh giá kết + Ưu điểm – Nhược điểm: Ưu điểm: thời gian thực nhanh, đơn giản, tốn kém, độ tinh mẫu không cần cao Nhược điểm: ngoại nhiễm, sai sót gây Taq polymerase cho tỉ lệ sai cao 10-4 Hướng ứng dụng hướng phát triển: − Hướng ứng dụng: + Chuẩn đoán bệnh di truyền + Tách dòng sản phẩm pcr + Nhật biết đột biến, xen đoạn + Nghiên cứu trình tiến hóa + Chọn giống vật nuôi, trồng + Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm − Hướng ứng dụng: + RT-PCR: nhạy hơn, dùng cho phân tách ARN + RT-PCR cạnh tranh: định lượng loại mARN chuyên biệt + Real- Time PCR: đánh giá tích lũy định lượng sản phẩm PCR Câu Trình bày hiểu biết kỹ thuật AFLP Nguyên lý AFLP số kĩ thuật phát dấu vết DNA, đánh giá đa dạng cjieeuf dài DNA Kĩ thuật gồm bước: (1) cắt hạn chế DNA có tham gia RF (2) khuếch đại có chọn lọc phân mảnh hạn chế tìm kiếm (3) phân tích đoạn khuếch đại điện di gel Khuếch đại PCR phân mảnh hạn chế thực cách sử dụng adapter trình tự hạn chế để tạo trình tự cho primer chạy PCR Khuếch đại có chọn lọc diễn sử dụng primer bắt cặp với phân mảnh hạn chế bằm phía đầu 3’ adapter trình tự hạn chế => Vì sử dụng AFLP để phân tích độ đa dạng chiều dài DNA không cần biết trình tự nucleotide Các bước kĩ thuật AFLP − Bước chuẩn bị khuôn mẫu AFLP Mẫu DNA phân lập tinh chế từ sinh vật Toàn DNA có trình tự cắt MseI EcoRI MseI cắt trình tự T T A A T T A A A AT T A A T T EcoRI cắt trình tự G A A T T C C T T A A G G C T T A A A A T T C G Bước Cắt hạn chế RE nối Cắt hạn chế RE Bằng cách ủ DNA khuôn với RE: ý khuôn mẫu với enzyme hạn chế chuẩn bị, sử dụng thiết protocol( biếu thị chất giống nhau, nồng độ, điều kiện nhau) Phân mảnh hạn chế có đặc điểm: T A A G end € EcoRI End € MseI T C T T A A − + • • • + • • • • Được cắt enzyme Một đàu trình tự bắt cặp bổ sung hau đầu dính adapter MseI-trình tự cắt MseI Một đầu trình tự bổ sung hai đầu dính adapter EcoRI- Trình tự cắt EcoRI( adapter > 20 nu) Đoạn đầu trình tự + Nối RE với adapter RE + adapter ( đoạn trình tự nhân tao, có đặc điểm kết hợp với đầu dính ez cắt theo nguyên tắc bổ sung) + ligase dsARE( DNA phân đoạn hạn chế sợi kép) − Bước khuếch đại chọn lọc Trong bước cần ý đến mồi AFLP gồm phần: trình tự lõi, trình tự đặc hiệu enzyme ( ENZ) trình tự mở rộng chọn lọc ( EXT) Primer thiêt kế dựa vào trình tự adapter trình tự cắt RE Primer EcoRI: 5’-lõi – EN2 – EXT = 19 EXT = primer có loại EXT = primer có 16 loai EXT=3 primer có 64 loại + Chạy PCR: Chuẩn bị thành phần PCR: Khuôn mẫu DNA sản phẩm bước 2.Enzyme taq DNA polymerase Prime: thiết kế theo nguyên tắc dNTP: chuẩn bi vật liệu buộc phải điều kiện gốc phosphate • Chu trình nhiệt: Trường hợp chạy 20 ch kì đơn với AFLP sử dụng mồi có EXT = Trường hợp chạy 36 chu kì đơn với AFLP sử dụng có mồi EXT = Cả hai trường hợp chu kì có giai đoạn sau: Nhiệt độ biến tính 94 độ 30s Nhiệt độ hồi tính 36 độ 30s Kéo dài 72 độ phút Nhiệt độ hồi tính chu kì 65 độ, sau giảm chu kì 0.7 độ cho 12 chu kì tiếp tục 56 độ cho 23 chu kì lại − Bước 4: chạy điện di + Gel polyacrymadie có khả biến tính + Chuẩn bị gel, chuẩn bị hệ thống điện di + Tra mẫu vào gel + Kết nối với ngồn điện − Bước 5: đánh giá độ đa dạng Ưu nhược điểm ứng dụng Ưu điểm: AFLP nhanh hơn, không phức tạp RELP khảo sát toàn gen Kỹ thuật đòi hỏi lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích độ lặp lại phản ứng cao mồi sử dung không cần đặ hiệu loại Nhược điểm: maker trội, điều hạn chế phân biệt cá thể đồng trội dị hợp ứng dụng: đánh giá đa dạng sinh học, phân tích thu thập quỹ gen, đánh giá kiểu gen cá thể, phân tích khoảng cách di truyền thiết lập nhóm liên kết thị gen quan tâm, đánh giá mức độ liên quan khác biệt giông Câu trình hiểu biết kĩ thuật RFLP Nguyên lí bản: Phản ứng PCR thực để khuếch đại vùng DNA cần khảo sát cách sử dụng cặp mồi oligonucleotide thành phần phần khác phẩn ứng PCR để tạo vô số DNA Sau sản phẩm PCR ủ với enzyme RE tạo phân đoạn DNA có kích thước khác Sử dụng kĩ thuật điện di gel để tách rời đoạn DNA có kích thước khác Sử dụng kĩ thuật Southern bot: Gây biến tính DNA gel ,sau chuyển DNA từ gel sang màng lai Thẩm tích phân tử DNA lên màng lai, Lai phân tử (lai với mẫu dò đặc hiệu có mang phóng xạ hoạt động) Chụp ảnh phóng xạ tự ghi để thu nhận đánh giá kết − Sơ đồ nguyên lý: PCR+RE Điện di thẩm tách lai chụp Nguyên tắc kĩ thuật: − − − − − − − − − − + + + + + + + Môi trường cho PCR hoạt động: Để cho PCR hoạt động cần đòi hỏi có đầy đủ thành phần phản ứng PCR: DNA khuôn, mồi, enzyme polymezase, dNTP, dung dịch đệm máy luân chuyển nhiệt thật nhanh xác.Chú ý đệm phản ứng PCR tris – HCL, KCl, MgCl Môi trường cho RE hoạt động: Để đảm bảo cho RE hoạt động cần ủ RE với DNA nhiệt độ, pH, dung dịch đệm môi trường phù hợp, đặc biệt phải có dung dịch đệm Nacl ion Mg2+ Trên DNA phải có trình tự cắt enzyme RE Dựa độ đặc hiệu enzyme cắt hạn chế vị trí nhận biết chúng DNA gen Sự khác biệt vị trí cắt tạo phân đoạn cắt DNA khác Các bước − Bước 1: tách chiết tinh DNA Mẫu DNA không đặc hiệu nhiễm tạp chất khác lên cần phải tinh Thành tế bào sinh vật bị phá vỡ biện pháp học chất tẩy mạnh DNA giải phóng làm tạp chất Rnase DNA kết tủa Ethanol 100% thu lại nhờ li tâm − Bước 2: Phản ứng PCR Chuẩn bị Khuôn mẫu DNA tinh bước Enzyme taq Primer thiết kế gắn vào trình tự adaptor trình tự cắt RE dNTP Chu trình nhiệt: • Nhiệt độ biến tính 94 độ 30s • Nhiệt độ hồi tính 36 độ 30s • Kéo dài 72 độ phút − Bước 3: Tiến hành xử lí RE Nồng độ NaCl dung dịch đệm: phải sử dụng nhiều RE có nồng độ NaCl dung dịch đệm khác cắt RE có nông độ NaCL thấp trước đến RE cần NaCL nồng độ cao RE bảo quản dung dịch đệm có 50% glycerol 200 độ C tiếp xúc với tốt, nhiên phai đảm bảo thể tích RE không 1/10 thể tích phản ứng Glycerol gây ức chế hoạt động cảu RE Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt: nước tinh khiết, RE 10 x bufer, BSA, RE, DNA − Bước điện di: Điện di gel agarose để phân tích kết − Bước Southerm Blotting: + Chuyển DNA sang màng nylon + Chọn đoạn dò, đánh dấu đoạn dò + Lai gép gen − Bước chụp ảnh, soi UV thu nhận kết Ưu điểm, nhược điểm, ứng dung Ưu điểm: Marker đồn trội cho phép phân biệt thể dị hợp kích thước DNA khảo sát RFLP lớn số lượng phân tử DNA tạo nhiều, đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu − Nhược điểm + Quy trình thực phức tạp, nguy hiểm tới sức khỏa người nghiên cứu + DNA yêu cầu chất lượng caoddax làm hạn chế vược sử dung kĩ thuật + Sử dụng đồng vị phóng xạ để phân tách tương đối tốn độc hại − ứng dụng xác định mối quan hệ đơn phân loại liê quan chặt chẽ cấp độ kiểu công cụ in vân tay cho nghiên cứu đa dạng nghiên cứu lai sử dụng kiểm tra hình kiểm tra huyết thóng, định vị gen, rối loạn di truyền xác định nguy gây bệnh − + + [...]... phân đoạn cắt DNA khác nhau Các bước cơ bản − Bước 1: tách chiết và tinh sạch DNA Mẫu DNA có thể không đặc hiệu hoặc nhiễm các tạp chất khác lên cần phải được tinh sạch Thành tế bào của sinh vật bị phá vỡ bằng biện pháp cơ học và các chất tẩy mạnh DNA được giải phóng và làm sạch tạp chất Rnase DNA được kết tủa trong Ethanol 100% và thu lại nhờ li tâm − Bước 2: Phản ứng PCR Chuẩn bị Khuôn mẫu DNA đã... hợp phản ứng cắt: nước tinh khiết, RE 10 x bufer, BSA, RE, DNA − Bước 4 điện di: Điện di trên gel agarose để phân tích kết quả − Bước 5 Southerm Blotting: + Chuyển DNA sang màng nylon + Chọn đoạn dò, đánh dấu đoạn dò + Lai gép gen − Bước 6 chụp ảnh, soi UV thu nhận kết quả Ưu điểm, nhược điểm, ứng dung Ưu điểm: Marker đồn trội cho phép phân biệt các thể dị hợp do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn... trình tự cắt RE dNTP Chu trình nhiệt: • Nhiệt độ biến tính ở 94 độ trong 30s • Nhiệt độ hồi tính 36 độ trong 30s • Kéo dài 72 độ trong 1 phút − Bước 3: Tiến hành xử lí RE Nồng độ NaCl của dung dịch đệm: nếu phải sử dụng nhiều RE có nồng độ NaCl của dung dịch đệm khác nhau thì cắt RE có nông độ NaCL thấp trước rồi đến RE cần NaCL nồng độ cao hơn RE được bảo quản trong dung dịch đệm có 50% glycerol ở... − + + + + + + + Môi trường cho PCR hoạt động: Để cho PCR hoạt động cần đòi hỏi có đầy đủ thành phần của phản ứng PCR: DNA khuôn, mồi, enzyme polymezase, dNTP, dung dịch đệm và một máy luân chuyển nhiệt thật nhanh và chính xác.Chú ý đệm trong phản ứng PCR là tris – HCL, KCl, MgCl 2 Môi trường cho RE hoạt động: Để đảm bảo cho RE hoạt động cần ủ RE với DNA trong nhiệt độ, pH, dung dịch đệm và môi trường... tương đối tốn kém và độc hại − ứng dụng xác định mối quan hệ đơn phân loại liê quan chặt chẽ hoặc cấp độ trong một kiểu như công cụ in vân tay cho các nghiên cứu đa dạng và nghiên cứu về lai sử dụng trong các kiểm tra hình sự và kiểm tra huyết thóng, định vị gen, rối loạn di truyền và xác định nguy cơ gây bệnh − + +