Bài viết Nghiên cứu in vitro và in silico sàng lọc các hợp chất của cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume) có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase trình bày đánh giá tác dụng ức chế α-glucosidase in vitro của cây chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume.) và xác định những hợp chất trong cây chè vằng có tác dụng ức chế α-glucosidase bằng phương pháp docking phân tử.
VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 38, No (2022) 34-44 Original Article In vitro and in silico Screening of Bioactive Compounds from Jasminum subtriplinerve Blume as α-glucosidase Inhibitor Le Minh Ngoc, Nguyen Bao Kim, Nguyen Nhu Son, Do Thi Hong Khanh, Bui Thanh Tung* VNU University of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam Received 19 January 2022 Revised 24 January 2022; Accepted 24 January 2022 Abstract: The leaves of Jasminum subtriplinerve Blume were extracted by cold maceration with ethanol 70 % and subsequently fractionated with n-hexane, ethyl acetate (EtOAc), and n-butanol (nBuOH) solvents The extract and fractions were evaluated α-glucosidase inhibitory activities in vitro The results have shown that n-hexane and EtOAc fractions had strong α-glucosidase inhibitory effects with IC50 values of 7.27 ± 0.71 g/mL and 7.42 ± 0.95 g/mL, respectively The total extract, the n-BuOH fraction, and the aqueous fraction did not show inhibitory effects on the enzyme αglucosidase The molecular docking results revealed that rutin, isoverbascoside, astragalin, isoquercitrin, verbascoside, stigmasterol, nicotiflorin, and chevangin B might play an important role in the biological effect of this medicinal plant Among these compounds, astragalin, isoquercitrin, verbascoside, and stigmasterol may be developed as drugs Our findings suggested that leaves of Jasminum subtriplinerve Blume will be the potent resource of natural α-glucosidase inhibitors Keywords: α- glucosidase, diabetes, Jasminum subtriplinerve, molecular docking * * Corresponding author E-mail address: tungbt.ump@vnu.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4386 34 L M Ngoc et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 38, No (2022) 34-44 35 Nghiên cứu in vitro in silico sàng lọc hợp chất Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume) có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase Lê Minh Ngọc, Nguyễn Bảo Kim, Nguyễn Như Sơn, Đỗ Thị Hồng Khánh, Bùi Thanh Tùng* Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 19 tháng 01 năm 2022 Chỉnh sửa ngày 24 tháng 01 năm 2022; Chấp nhận đăng ngày 24 tháng 01 năm 2022 Tóm tắt: Lá chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume) chiết xuất phương pháp ngâm lạnh etanol 70% sau chiết phân đoạn dung môi n-hexan, etyl acetat (EtOAc) n-butanol (n-BuOH) Các phân đoạn cao chiết đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro Kết đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase cho thấy phân đoạn n- hexan EtOAc có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase mạnh với giá trị IC50 7,27 ± 0,71 g/mL 7,42 ± 0,95 g/mL Cao chiết toàn phần, phân đoạn BuOH phân đoạn nước tác dụng ức chế enzym α-glucosidase Kết docking phân tử cho thấy hợp chất rutin, isoverbascoside, astragalin, isoquercitrin, verbascoside, stigmasterol, nicotiflorin chevangin B đóng vai trò quan trọng tác dụng ức chế enzym α-glucosidase chè vằng Trong hợp chất này, astragalin, isoquercitrin, verbascoside stigmasterol có tiềm phát triển thành thuốc Kết nghiên cứu cho thấy chè vằng nguồn cung cấp tiềm chất ức chế α-glucosidase Từ khóa: Chè vằng; Jasminum subtriplinerve; enzym α-glucosidase, đái tháo đường, docking phân tử Mở đầu* Đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh lý mãn tính đặc trưng tình trạng tăng đường huyết rối loạn tiết và/hoặc hoạt động insulin ĐTĐ gây rối loạn q trình chuyển hóa carbohydrate, chất béo protein thể chí gây tử vong khơng điều trị kiểm sốt cách [1] Thống kê Hiệp hội đái tháo đường quốc tế, tính đến năm 2021 giới có 537 triệu người trưởng thành từ 2079 tuổi sống chung với bệnh tiểu đường [2] * Tác giả liên hệ Địa email: tungbt.ump@vnu.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1094/vnuees.4386 Con số dự đoán tăng lên 643 triệu vào năm 2030 784 triệu vào năm 2045 Tại Việt Nam, bệnh đái tháo đường dự báo trở thành bảy bệnh gây tử vong tàn tật hàng đầu Việt Nam vào năm 2030 [3] Enzym α-glucosidase (AG) đóng vai trị quan trọng trình thủy phân tinh bột thành glucose [4] Để kiểm sốt mức đường huyết bình thường điều trị bệnh tiểu đường, nhiều nghiên cứu ức chế AG chiến lược điều trị tiềm Tuy nhiên, hợp chất ức chế AG miglitol, 36 L M Ngoc et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 38, No (2022) 34-44 metformin acarbose nhiều hạn chế gây tác dụng phụ nghiêm trọng Vì vậy, tìm kiếm hợp chất nguồn gốc thiên nhiên an toàn hiệu điều trị đái tháo đường ngày trở nên cấp thiết Tại Việt Nam, nhiều dược liệu có chứa hợp chất có tác dụng sinh học flavonoid, anthocyanosid, tannin, polyphenol…được dùng làm thực phẩm, nước uống bổ dưỡng, giải độc ngày, có chè vằng Cây chè vằng dân gian sử dụng rộng rãi để pha trà thức uống hàng ngày, chữa mụn nhọt, sát trùng vết thương, giúp điều trị kinh nguyệt không đau bụng kinh [5] Các tác dụng sinh học chè vằng nghiên cứu trước kháng khuẩn, chống oxy hóa gây độc tế bào [5] Trong năm gần đây, docking phân tử trở thành công cụ hiệu việc khám phá phát triển loại thuốc Phương pháp dựa nguyên tắc phức hợp enzym-cơ chất có lượng liên kết thấp tác dụng dược lý có tiềm lớn Mặt khác, lượng liên kết lại xác định dựa cấu trúc enzym hợp chất Sự kết hợp docking phân tử sàng lọc thực nghiệm in vitro chứng minh giảm đáng kể thời gian, cơng sức chi phí so với phương pháp sàng lọc truyền thống Trong nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế α-glucosidase in vitro chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume.) xác định hợp chất chè vằng có tác dụng ức chế α-glucosidase phương pháp docking phân tử Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu Lá chè vằng, tên khoa học Jasminum subtriplinerve Blume., thu hái Hà Nội vào tháng 10 năm 2021 Mẫu nghiên cứu lưu giữ Trường Đại Học Y Dược, ĐHQGHN Lá chè vằng khô nghiền nhỏ (500 g) ngâm lạnh với dung mơi EtOH 70% nhiệt độ phịng, lần x ngày với tỷ lệ dược liệu/dung môi 1:10 (kg/l) Lọc loại bã dược liệu, gộp dịch chiết cất thu hồi dung môi áp suất giảm thu 71,79 g cao EtOH 70% Phân tán nước nóng, sau chiết lỏng - lỏng tỉ lệ 1:2, lần lít x lần với dung mơi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, EtOAc BuOH Gộp dịch chiết cất thu hồi dung môi áp xuất giảm thu 1,04 g cao n-hexan, 14,66 g cao EtOAc, 21,78 g cao BuOH 29,81g cắn nước Hóa chất: acid ascorbic (99%, SigmaAldrich, Singapore); enzyme Yeast glucosidase; p-nitrophenyl-α-Dglucopyranoside (pNPG), 4-Nitrophenol (Sigma);; loại hóa chất khác đạt độ tinh khiết cao 2.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym αglucosidase Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase mẫu nghiên cứu thực theo phương pháp Moradi-Afrapoli F cộng [6] Cụ thể sau: - Chất thử hịa tan DMSO pha lỗng phosphate buffer 10 mM (pH 6.8) 50 l đưa vào giếng khay 96 giếng để có nồng độ 256 g/ml, 64 g/ml; 16 g/ml; g/ml; g/ml; - 20 µl α- glucosidase (0,5U/ml) 130 µl phosphate buffer 100 mM (pH 6.8) thêm vào giếng, trộn ủ 37oC 15 phút Cơ chất p-nitrophenyl-α-Dglucopyranoside (pNPG) đưa tiếp vào giếng thí nghiệm ủ tiếp 37oC 60 phút - Đĩa thí nghiệm có mẫu thử , phosphate buffer pNPG sử dụng làm đối chứng trắng (blank) Giếng thí nghiệm có DMSO 10%, phosphate buffer, enzyme pNPG sử dụng làm đối chứng Thí nghiệm lặp lại lần để đảm bảo xác - Dừng thí nghiệm cách thêm vào 80 µl Na2CO3 0,2M đo OD bước sóng 405nm máy đo ELISA Plate Reader (Bio-Rad) - Khả ức chế enzyme α-glucosidase mẫu thử xác định theo công thức sau: % ức chế = 100% - (Amẫu thử/ A đối chứng *100) L M Ngoc et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 38, No (2022) 34-44 Trong đó: A đối chứng = OD đối chứng - OD blank Amẫu thử = ODmẫu thử - OD blank mauthu Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve2Dv4 2.3 Docking phân tử Chuẩn bị cấu trúc protein: Cấu trúc tinh thể isomaltase (ID: 3A4A) chứng minh tương đồng với alpha- glucosidase từ Saccharomyces cerevisiae lựa chọn lấy từ sở liệu RCSB (www.rscb.org) [7] Sau đó, cấu trúc phối tử đồng kết tinh alpha-Dglucopyranose phức hợp 3A4A tách riêng đánh giá cấu dạng tương quan cấu trúc- tác dụng với phân tử đồng kết tinh Cuối cùng, cấu trúc protein loại bỏ phân tử nước, thêm nguyên tử hydro điện tích sau tái thiết lập vùng hoạt động enzyme qua phần mềm MGL Autodock tools 1.5.7 Trung tâm hoạt động theo công bố gồm acid amin chính: ASP215, GLU277 VÀ ASP352 [8] Grid Box cho docking thiết lập với thông số tọa độ trung tâm X, Y Z 21.284, −0.761 18.638 độ rộng tương ứng 28 Å X 28 Å X 28 Å với khoảng cách ô lưới 1Å (Hình 1) [9] Chuẩn bị cấu trúc phối tử: Dựa theo nghiên cứu hợp chất có thành phần chè vằng [5; 10; 11] tổng hợp 39 hợp chất để tiến hành đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase Các cấu trúc lấy từ sở liệu PubChem vẽ phần mềm Chem Office 19.0 chuyển thành cầu trúc 3D nhờ phần mềm Avogadro Sau đó, tất hợp chất gắn trường lực 37 Merck Molecular Force Field (MMFF94) tối ưu hóa mức lượng Thực docking phân tử: Các phối tử dock vào trung tâm hoạt động protein sử dụng phần mềm Autodock vina Đánh giá kết docking: Để đánh giá kết trình docking, phối tử từ đồng tinh thể re-dock lại vào vị trí hoạt động protein Q trình thành cơng giá trị độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) không vượt 1.5 Å [12] Khả liên kết hợp chất cần docking đánh giá thông qua tương tác chúng với acid amin hốc phản ứng lượng tương tác tính hàm tính điểm (scoring function) Autodock vina 2.4 Đánh giá quy tắc tiêu chí Lipinski Quy tắc tiêu chí Lipinski áp dụng để đánh giá hợp chất có đặc tính giống thuốc hay khơng [13] Chúng tơi đánh giá quy tắc tiêu chí Lipinski thơng qua cơng cụ online (http://www.scfbio-iitd.res.in/software/drugdesign /lipinski.jsp) [14] Cấu trúc hóa học hợp chất lấy từ sở liệu Pubchem (www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) 2.5 Dự đốn thơng số dược động học Kết phân tích thơng số dược động học bao gồm hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ độc tính (ADMET) hợp chất giống thuốc đánh giá với trợ giúp công cụ pkCSM (http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/ prediction) [15] Bảng Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase mẫu nghiên cứu Nồng độ (µg/mL) 500 100 20 IC50 EtOH Hexan EtOAc Butanol PĐ H2O Acarbose 19,92 ± 1,56 2,74 ±0,89 2,47 ±2,89 1,93 ±1,24 >500 104,60 ±4,72 99,75 ±3,26 89,97 ±2,19 16,66 ±0,10 7,27 ± 0,71 102,19 ±2,33 99,88 ±1,07 89,54 ±3,51 15,57 ±1,07 7,42 ± 0,95 17,14 ± 0,37 4,24 ±0,82 2,74 ±0,28 1,53 ±0,16 >500 12,76 ±1,07 0,97 ±1,75 1,25 ±0,19 1,73 ±1,47 >500 75,20± 0,62 48,57 ± 1,96 20,64 ± 0,34 8,32 ± 0,62 127,53± 1,73 L M Ngoc et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 38, No (2022) 34-44 38 Kết bàn luận 3.1 Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase Kết tác dụng ức chế enzym αglucosidase mẫu nghiên cứu thể Bảng Kết đánh giá tác dụng ức chế enzym αglucosidase cho thấy phân đoạn n- hexan EtOAc có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase mạnh với giá trị IC50 7,27 ± 0,71 g/mL 7,42 ± 0,95 g/mL Chất đối chứng dương acarbose hoạt động ổn định thí nghiệm 3.2 Docking phân tử 3.2.1 Đánh giá mơ hình Docking Để đánh giá mức độ phù hợp thông số docking, phối tử đồng tinh thể re-dock lại vào vị trí hoạt động protein đích để xác định độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) (Hình 1) Xác định giá trị RMSD đánh giá tương đồng cấu dạng, phần mềm Chimera 1.15 thu kết trùng khớp cấu trúc phối tử đồng tinh thể trước sau re-dock, với giá trị RMSD 0.324 Å < 1.5 Å chứng tỏ mô hình docking phân tử vào protein mục tiêu đáng tin cậy (Hình 2) 3.2.2 Tiến hành docking hợp chất có tiềm ức chế alpha-glucosidase Sau phối tử chuẩn bị, 39 hợp chất thành phần chè vằng tiến hành docking vào enzyme α-glucosidase Kết thu được thể Bảng Kết docking Bảng cho thấy có hợp chất có lượng liên kết thấp nhất: Rutin; isoverbascoside, astragalin, isoquercitrin, verbascoside, stigmasterol, nicotiflorin chevangin B (3) với lượng liên kết -10,4 (kcal/mol); -9,2 (kcal/mol); -9,1 (kcal/mol); -9,4 (kcal/mol); - 9,7 (kcal/mol); 9,2 (kcal/mol), -10,4 (kcal/mol), -9,1 (kcal/mol) Acarbose thuốc điều trị đái tháo đường theo chế ức chế enzym α-glucosidase, chứng dương để so sánh với hợp chất sàng lọc Cả chất có lượng liên kết thấp acarbose (-8.9 kcal/mol) Hình Vùng hoạt động Isomaltase Hình Kết re-docked alpha-D-glucopyranose Bảng Kết docking 39 hợp chất thành phần chè vằng vào enzyme α-glucosidase STT Hợp chất 3β-acetyl-oleanolic acid Lupeol Năng lượng liên kết (kcal/mol) -7,6 -7,9 STT 21 22 Hợp chất Chevangin C (5) Chevangin D (6) Năng lượng liên kết (kcal/mol) -7,6 -8,6 L M Ngoc et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 38, No (2022) 34-44 Stigmast-5-en-3β-ol 6′-O-menthiafoloylverbascoside -8,8 -7,5 23 24 Rutin -10,4 25 Isoverbascoside Astragalin -9,2 -9,1 26 27 Isoquercitrin -9,4 28 10 11 12 13 14 15 Verbascoside 3,4-dihydroxybenzoic acid 3,4,5-trihydroxybenzoic acid Oleanolic acid Betulinic acid β- sitosterol Stigmasterol -9,7 -5,9 -6,2 -7,8 -7,7 -8,7 -9,2 29 30 31 32 33 34 35 16 Nicotiflorin -10,4 36 17 18 19 20 6'''-epi-anatolioside A(1) Chevangin A (2) Chevangin B (3) 6-epi-Chevangin B (4) -7,4 -8,5 -9,1 -8,7 37 38 39 40 (Z)-3-hexen-1-ol (Z)-2-hexen-1-ol Cis-2,6-dimethyl-2,6octadiene β-Myrcene p-Mentha-1,5,8-triene Cis-linalool oxide (pyranoid) α-terpineol Geraniol p-Menth-1-en-7-al Teresantalol α-copaene Trans-sobrerol (E)-Nerolidol 6,10,14-trimethyl-2pentadecanone Phytol Limonene Linalool Acarbose (chứng dương) 39 -4,3 -4,7 -5,8 -5,7 -5,4 -5,7 -6,3 -6 -5,8 -5,7 -7,2 -6,5 -6,8 -6,2 -5,9 -6,1 -5,9 -8,9 Bảng Liên kết hợp chất tiềm với acid amin α-glucosidase Hợp chất Rutin Isoverbascoside Astragalin Liên kết Hydro ASP352, ASP307, ARG315, THR310, GLU277 ASP215, ASP242, SER311, SER240, ASN415, ARG442, GLU411, GLN279 THR310, ASP352, GLN353, ARG315, PRO312 Isoquercitrin ASP307, ASP242, ARG315, HIS280, PRO312 Verbascoside ASP307, HIS280, PRO312, SER241, ASP242, SER240, ARG315, ARG442 Stigmasterol PRO312 Nicotiflorin Chevangin B ARG315, TYR158, THRR310, GLU277 ARG315, ASP242, GLU277, ASP352 Acarbose ASP352, GLU277, ASP69, GLN279, ASP307, ASP242, HIS280, PRO312, SER311, ASP215 Liên kết kị nước PRO312, HIS280 TYR158 GLU277, ASP352, ARG442, GLN279, SER157, LYS156, SER240, THR310, SER311, PHE303, TYR158, GLN353 GLU277, ASP352, TYR158, THR310, VAL308, GLN279, PHE303, PHE 178, PHE159, GLU411, TYR316, ASN415, SER311, LEU313, LYS156, SER157, PHE314 GLU277, ASP352, ARG446, ASP69, GLN279, HIS280, LEU313, SER240, PHE314, ARG315, ARG213, HIS351, ASP215, ARG442, PHE159,PHE178,HIS112, TYR158 HIS280 TYR158, ASP307 ARG442, LEU313, PHE314, ARG315, TYR158, PHE303, PHE159, VAL216, HIS112, GLN181, TYR72, PHE178, HIS351, ARG446 L M Ngoc et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 38, No (2022) 34-44 40 3.2.3 Kết đánh giá quy tắc tiêu chí Lipinski Quy tắc tiêu chí Lipinski giúp phân biệt phân tử giống thuốc không giống thuốc Các hợp chất gọi “giống thuốc” chúng đáp ứng tiêu chí qui tắc Lipinski: i) Khối lượng phân tử