Giáo trình Nuôi cấy mô thực vật cung cấp cho người học những kiến thức như: Giới thiệu về nuôi cấy mô thực vật; Các nguyên tắc của nuôi cấy mô và tế bào thực vật; Các ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật; Sự thuần dưỡng; Các sự cố và cách xử lý. Mời các bạn cùng tham khảo!
UỶ BAN NHÂN DÂN TỈNH ĐỒNG THÁP TRƯỜNG CAO ĐẲNG CỘNG ĐỒNG ĐỒNG THÁP GIÁO TRÌNH MƠN HỌC: NI CẤY MƠ THỰC VẬT NGÀNH, NGHỀ: KHOA HỌC CÂY TRỒNG TRÌNH ĐỘ: CAO ĐẲNG (Ban hành kèm theo Quyết định Số:…./QĐ-CĐCĐ-ĐT ngày… tháng… năm 2017 Hiệu trưởng Trường Cao đẳng Cộng đồng Đồng Tháp) Đồng Tháp, năm 2017 TUYÊN BỐ BẢN QUYỀN Tài liệu thuộc loại sách giáo trình nên nguồn thơng tin phép dùng nguyên trích dùng cho mục đích đào tạo tham khảo Mọi mục đích khác mang tính lệch lạc sử dụng với mục đích kinh doanh thiếu lành mạnh bị nghiêm cấm i LỜI GIỚI THIỆU Giáo trình Ni cấy mơ thực vật biên soạn sở kế hoạch đào tạo ngành Khoa học trồng Trường Cao đẳng Cộng đồng Đồng Tháp Giáo trình cung cấp cho sinh viên kiến thức kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật Trong biên soạn, tác giả cố gắng cập nhật kiến thức có liên quan đến nội dung chương trình đào tạo phù hợp với mục tiêu đào tạo Nội dung lý thuyết thực hành biên soạn gắn liền nguyên lý sở với nhu cầu thực tế sản xuất đồng thời có tính thực tiễn cao Nội dung giáo trình biên soạn với thời gian đào tạo hai tín gồm: năm Bài 1: Giới thiệu nuôi cấy mô thực vật Bài 2: Các nguyên tắc nuôi cấy mô tế bào thực vật Bài 3: Các ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật Bài 4: Sự dưỡng Bài 5: Các cố cách xử lý Chân thành cảm ơn! Tất thành viên hội đồng thẩm định phản biện, đóng góp điều chỉnh nội dung giáo trình hồn chỉnh Mặc dù cố gắng biên soạn để đáp ứng mục tiêu đào tạo không tránh khiếm khuyết Rất mong nhận đóng góp ý kiến thầy, giáo, bạn đọc để giáo trình hồn thiện Xin chân thành cảm ơn Đồng Tháp, ngày… tháng năm 2017 Chủ biên Phan Thị Thanh Tuyền ii MỤC LỤC Trang LỜI GIỚI THIỆU ii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU VỀ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 1 Khái niệm Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tên giới Hiện trạng nuôi cấy mô Việt Nam CHƯƠNG 2: CÁC NGUYÊN TẮC CỦA NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT 10 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 1.1 Định nghĩa 11 1.2 Các kiểu nuôi cấy 11 Thực vật mẫu cấy 12 2.1 Thực vật 12 2.2 Mẫu cấy 12 Sự vô trùng 13 3.1 Vô trùng bề mặt mẫu cấy 13 3.2 Vô trùng môi trường dụng cụ nuôi cấy 15 3.3 Tủ cấy vô trùng 16 Môi trường nuôi cấy 17 4.1 Nước 17 4.2 Các nguyên tố khoáng 17 4.3 Nguồn cacbohydrate 20 4.4 Vitamin 21 4.5 Chất tạo gel 22 4.6 Chất điều hòa sinh trưởng 22 4.7 Chelate 26 4.8 Tác nhân thẩm thấu 26 4.9 Than hoạt tính 26 4.10 pH 27 iii 4.11 Acid hữu 27 4.12 Thành phần bổ sung không xác định 27 Các kiểu bình chứa nắp đậy sử dụng nuôi cấy mô tế bào 27 Điều kiện nuôi cấy 28 6.1 Nhiệt độ 28 6.2 Ánh sáng 29 6.3 Ẩm độ 29 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 29 7.1 Chuẩn bị hóa chất 29 7.2 Chuẩn bị dung dịch gốc 30 7.3 Nấu môi trường 30 7.4 Đo pH 30 Thực hành: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 30 CHƯƠNG 3: CÁC ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 35 Nhân giống hữu tính 36 Nhân giống vơ tính – vi nhân giống 37 2.1 Lợi ích vi nhân giống 37 2.2 Bất lợi vi nhân giống 37 2.3 Một số kỹ thuật giúp gia tăng sinh trưởng giảm giá thành vi nhân giống 38 Nhân giống từ phơi vơ tính 38 Thực hành: Tái sinh mẫu cấy 39 CHƯƠNG 4: SỰ THUẦN DƯỠNG 42 CẤU TRÚC HÌNH THANI1 VÀ GIẢI PHẪU CỦA CÂY CON CẤY MÔ 42 1.1 Cấu trúc hình thái giải phẫu ống nghiệm 42 1.2 Khí 43 1.3 Lá 43 1.4 Thân 43 iv 1.5 Rễ 43 1.6 Khả giữ nước 43 Quang hợp 43 Kỹ thuật dưỡng 44 3.1 Trong bình ni cấy 44 3.2 Trong môi trường tự nhiên nhà lưới 44 3.3 Cơ sở hạ tầng cho dưỡng 44 3.4 Tự động hóa 46 Tóm tắt thơng số sử dụng hóa chất q trình dưỡng 47 Thực hành: Thuần dưỡng cấy mô 47 CHƯƠNG CÁC SỰ CỐ VÀ CÁCH XỬ LÝ 51 Nhiễm vi sinh vật 52 1.1 Nhiễm virus 52 1.2 Nhiễm vi khuẩn 53 1.3 Nhiễm nấm 54 1.4 Mycoplasma 54 1.5 Nhện nhỏ bọ trĩ 54 Sinh lý sinh thái 54 2.1.Sự vận chuyển nước 54 2.2 Thành phần khí bình ni cấy Error! Bookmark not defined.54 Sự hóa nâu 55 3.1 Triệu chứng 55 3.2 Nguyên nhân 55 3.3 Các biện pháp chữa trị 55 Sự biến dị tế bào soma 55 Sự thừa nước 56 5.1 Triệu chứng 56 5.2 Nguyên nhân 56 5.3 Các biện pháp chữa trị 56 Sự chết chồi 57 v Cấu trúc bất thường 57 Các dạng thể khảm 57 Thực hành: Khảo sát xử lý số trường hợp tạp nhiễm nuôi cấy mô 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 vi GIÁO TRÌNH MƠN HỌC Tên mơn học: NI CẤY MƠ THỰC VẬT Mã mơn học: CNN483 Vị trí, tính chất, ý nghĩa vai trị mơn học: - Vị trí: Là mơn học tự chọn bố trí khung mơn học chun ngành - Tính chất: Đây môn học kỹ quan trọng giúp cho sinh viên có kiến thức nuôi cấy mô thực vật Yêu cầu sinh viên cần phải đảm bảo đủ số lý thuyết thực hành - Ý nghĩa vai trò: Giáo trình cung cấp cho sinh viên kiến thức, kỹ nuôi cấy mô thực vật Mục tiêu môn học: - Về kiến thức: + Trình bày ni cấy mơ trạng nuôi cấy mô giới Việt Nam + Trình bày ngun tắc ni cấy mô tế bào thực vật, ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, kiến thức liên quan đến dưỡng nuôi cấy mô, kiến thức thường gặp cố cách xử lý - Về kỹ năng: + Phân tích trạng ưu nhược điểm kỹ thuật nuôi cấy mô + Thành thạo thao tác chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô, kỹ thuật tái sinh mẫu cấy, kỹ thuật dưỡng nuôi cấy mô - Về lực tự chủ trách nhiệm: Học tập tích cực, chủ động q trình học có ý thức vận dụng kiến thức vào thực tiễn vii Nội dung môn học: Thời gian (giờ) Kiểm tra Tên chương Số TT (định Thực hành, thí Lý thuyết nghiệm, thảo luận, kỳ)/Ơn thi, Thi kết tập thúc môn học môn học Tổng số CHƯƠNG 1: Giới thiệu nuôi cấy mô thực vật 3 4 12 Khái niệm Lịch sử phát triển nuôi cấy mô giới Hiện trạng nuôi cấy mô Việt Nam CHƯƠNG 2: Các nguyên tắc nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào Thực vật mẫu cấy Sự vô trùng Môi trường nuôi cấy Các kiểu bình chứa nắp đậy sử dụng nuôi cấy mô tế bào Điều kiện nuôi cấy Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Thực hành CHƯƠNG 3: Các ứng dụng kỹ thuật ni cấy mơ thực vật Nhân giống hữu tính Nhân giống vơ tính – vi nhân giống viii 1LT Nhân giống từ phơi vơ tính Thực hành Kiểm tra (2) CHƯƠNG 4: Sự dưỡng 4 40 19 19 1TH Cấu trúc hình thái giải phẫu cấy mô Quang hợp Kỹ thuật dưỡng Tóm tắt thơng số sử dụng hố chất q trình dưỡng 5.Thực hành CHƯƠNG 5: Các cố cách xử lý Nhiễm vi sinh vật Sinh lý sinh thái Sự hóa nâu Sự biến dị tế bào soma Sự thừa nước Sự chết chồi Cấu trúc bất thường Các dạng thể khảm 9.Thực hành Ơn thi (3) Thi/kiểm tra kết thúc mơn học (4) Cộng ix Trong số trường hợp, trước cấy vào đất ngâm thuốc diệt nấm bệnh, đất ươm cần sử dụng thêm thuốc trừ sâu Nhiệt độ: Nhiệt độ khơng khí yếu tố quan trọng q trình dưỡng Nhiệt độ khơng khí liên quan đến ánh sáng chiếu vào môi trường Ánh sáng trực xạ chiếu vào vòm phủ plastic gây hiệu ứng nhà kính, làm gia tăng nhiệt độ bên trong, dẫn đến gia tăng hô hấp Phân bón: Phân bón cung cấp cho giai đoạn đầu chưa quan trọng giai đoạn đầu rễ cần phải có thời gian để hồn thiện cấu trúc Khi hấp thu nước, việc cung cấp phân bón cho cần thiết 3.3 Cơ sở hạ tầng cho dưỡng Phòng tăng trưởng: Trong số trường hợp, nơi hóa phịng tăng trưởng đóng kín Các lúc trồng đặt kệ để tiết kiệm khơng gian (Hình 4.1) Hình 4.1 Cây hóa phịng tăng trưởng Nhà vịm: vịm nhà để kiểm sốt khí hậu tối hảo yếu tố quan trọng để tạo thành công cấy mơ Ở vịm tạo thường có ẩm độ tương đối cao (Hình 4.2) 45 Hình 4.2 Nhà vịm dưỡng ni cấy mơ Nhà lưới: Thơng thường diện tích nhà lưới thường rộng thơng thống nhà vịm Chế độ sáng nhà lưới tùy thuộc vào chế độ sáng lưới che sáng (Hình 4.3) Hình 4.3 Nhà lưới dưỡng ni cấy mơ 3.4 Tự động hóa Cấy chun chở từ in vitro vào nơi dưỡng chủ yếu lao động chân tay Các công việc tự động hóa để giảm giá thành sản xuất cách sử dụng số băng chuyền… 46 Tóm tắt thơng số sử dụng hóa chất q trình dưỡng Ẩm độ: Kiểm soát ẩm độ nên tránh chất ướt, nên sử dụng thiết bị tạo sương mù Nhiệt độ: Nhiệt độ cao nên tránh, Nhiệt độ bên nóng thích hợp cho tạo rễ CO2: Một số trường hợp nồng độ CO2 cao (900 ppm) cải thiện trình dưỡng Ánh sáng: Cường độ ánh sáng cao giai đoạn chuyển vào nhà lưới có hại Quang kỳ: Chọn quang kỳ Phân bón: giai đoạn đầu khơng cần phân bón Thuốc BVTV: Sử dụng tối thiểu thuốc bảo vệ thực vật Thực hành: Thuần dưỡng nuôi cấy mô 5.1 Mục đích – yêu cầu Sinh viên thành thạo công việc chuẩn bị vật liệu kỹ thuật dưỡng 5.2 Dụng cụ - hóa chất - Dụng cụ: vỉ ươm cây, màng phủ plastic màu trắng thao đựng nước, bình tưới nước - Vật liệu: giá thể trồng cây, cấy mơ dưỡng phịng thí nghiệm nhà lưới - Hóa chất: thuốc trừ nấm bệnh 5.3 Thao tác * Thuần dưỡng mô bình ni cấy Việc dưỡng bình ni cấy giúp cho cấy mơ thích nghi với điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ tốt Điều giúp tăng tỷ lệ sống sau Bước 1: Chuẩn bị mẫu Chọn ni cấy mơ có đầy đủ rễ, thân ngơi Bước 2: Quan sát ghi nhận đặc điểm cây mô Ghi nhận đặc điểm sau: chiều cao cây, số lá, số Màu sắc lá, trọng lượng 47 Bước 3: Chuyển cấy mơ sang phịng dưỡng Phịng dưỡng có điều kiện ánh sáng, ẩm độ, nhiệt độ quản lý Bước 4: Thuần dưỡng ghi nhận kết - Hằng ngày đưa ánh sáng tự nhiên theo nhịp: 15 phút, 30 phút, 45 phút, giờ, giờ, giờ, giờ, giờ, giờ, ngày Khi đưa ánh sáng tự nhiên cần phải có lớp lưới tản nhiệt che bên - Quan sát ghi nhận thay đổi chiều cao cây, số lá, số Màu sắc lá, trọng lượng Bước 5: Đưa nhà lưới báo cáo kết Khi dưỡng ổn định đặc tính tiến hành đem nhà lưới * Thuần dưỡng mô nhà lưới Bước 1: Chuẩn bị mẫu Chọn ni cấy mơ có đầy đủ rễ, thân ngơi dưỡng phịng thí nghiệm Bước 2: Quan sát ghi nhận đặc điểm cây mô Ghi nhận đặc điểm sau: chiều cao cây, số lá, số Màu sắc lá, trọng lượng Bước 3: Chuẩn bị khay ươm - Giá thể bao gồm hỗn hợp phân hữu cơ, mụn dừa, tro trấu thoát nước giữ ẩm tốt Giá thể ủ loại bỏ độc chất - Cho giá thể vào khay ươm Bước 4: Chuẩn bị cấy vào khay ươm - Cây lấy khỏi môi trường nuôi cấy: lấy theo chiều đưa phần gốc trước - Rửa mơi trường nơi cấy dính (Hình 4.1) 48 Hình 4.4 Rửa mơi trường ni cấy - Nhúng vào thuốc phịng bệnh (Hình 4.2) Hình 4.5 Cây xử lý bàng thuốc bệnh - Cấy vào khay ươm Bước 5: Phủ phastic giữ ẩm cho Bước 6: Thuần dưỡng ghi nhận kết 49 - Sau ngày, gỡ màng plastic từ từ - Ghi nhận đặc điểm sau: chiều cao cây, số lá, số Màu sắc lá, trọng lượng So sánh kết nhóm cây: dưỡng phịng thí nghiệm chưa dưỡng Bước 7: Đưa vườn trồng báo cáo kết CÂU HỎI ƠN TẬP Câu 1: Sự dưỡng gì? Câu 2: Trình bày kỹ thuật dưỡng bình ni cấy? Câu 3: Trình bày kỹ thuật dưỡng tự nhiên (nhà lưới) 50 BÀI CÁC SỰ CỐ VÀ CÁCH XỬ LÝ MĐ40-05 Giới thiệu: Trong nuôi cấy mơ, có nhiều cố gặp phải Các cố làm cản trở cho công việc nuôi cấy gây bất lợi không mong muốn (Hình 5.1) Có nhiều ngun nhân gây tượng Sự hiểu biết nguyên nhân cách chữa trị điều cần thiết để cải thiện kỹ thuật ni cấy mơ Hình 5.1 Một số tượng bất thường nuôi cấy mô (A): Hiện tượng nhiễm vi sinh vật, (B): hóa nâu hoại tử rễ hồng, (C): hoại tử chồi đỉnh hoa hồng, (D): hoại tử toàn mẫu cấy hoa hồng , (E): hóa nâu mẫu cấy lan đồng tiền 51 Mục tiêu: - Kiến thức: Trình bày kiến thức thường gặp cố cách xử lý nuôi cấy mô - Kỹ năng: Nhận diện cố thường gặp nuôi cấy mô cách xử lý - Năng lực tự chủ trách nhiệm: Học tập tích cực, chủ động q trình học có ý thức vận dụng kiến thức vào thực tiễn Nhiễm vi sinh vật Trong tự nhiên, thực vật tiếp xúc bị nhiễm nhiều loại vi sinh vật bề mặt vi sinh vật xâm nhiễm vào bên mô tế bào Tuy nhiên, nuôi cấy mô chấp nhận tồn vi sinh vật bề mặt mẫu 1.1 Nhiễm virus Các bệnh virus thực vật gây tổn thất lớn nông nghiệp Trong lĩnh vực cấy mô, điều quan trọng đặc biệt tạo với số lượng lớn phải hoàn toàn bệnh Mẫu cấy bị nhiễm virus tạo vơ số bị nhiễm virus, vi du vi nhân giống từ mẫu vật bị nhiễm dẫn đến sản xuất hàng triệu bị nhiễm bệnh Để loại trừ việc nhiễm virus, điều cần thiết phải biết thực vật thường bị nhiễm virus để làm Kỹ thuật xác định dịng virus thiết lập: - Dùng thị: Chủng virus chủ để xét nghiệm virus gây bệnh phải biết trước Phương pháp thực cách chủng vào vây thị, phản ứng vời nhiễm virus cách sản xuất vết thương biểu Cây thị thường sử dụng Nicotiana sp Gomphena globaosa - Sử dụng kính hiển vi điện tử: Xác định dịch trích mẫu vật cắt ngang kính hiển vi điện tử Sự kết hợp quan sát kính hiển vi xét nghiệm huyết cho kết xác - Xét nghiệm huyết thanh/ELISA: Protein virus hoạt động kháng nguyên, chất có khả kích thích đáp ứng miễn dịch động vật cách kích thích sản xuất kháng thể Kháng thể sử dụng theo nhiều cách để phát virus vật liệu thực vật - Phương pháp ELISA: Sử dụng kháng thể chống lại virus Có nhiều quy trình ngun tắc chung trước hết, virus gắn vào bề mặt giếng 52 dĩa ELISA, kháng thể xây dựng chống lại virus thêm vào Kháng thể thêm vào dư, tất virus có kháng thể gắn vào Phần cịn dư kháng thể rửa Lượng kháng thể lại sau cân với số virus Kháng thể có enzyme liên kết với Một chất khơng thêm vào giếng xét nghiệm Enzyme biến đổi chất thành hỗn hợp có màu, sau đo quang phổ Màu đậm nhiều virus * Cách chữa trị: Những thực vật bị nhiễm virus phục hồi lại thành bệnh cách cấy đỉnh sinh trưởng, vi ghép, nhiệt trị 1.2 Nhiễm vi khuẩn Nhiễm vi khuẩn thường gặp nuôi cấy in vitro Một số vi khuẩn gây nhiễm vi khuẩn gây bệnh cho chủ, số khác vi khuẩn gây bệnh Các vi khuẩn vi khuẩn sống tự khơng khí đất Sự diện vi khuẩn môi trường nuôi cấy gây nhiều bất lợi Nó gây chết làm chậm sinh trưởng mẫu vật nuôi cấy Các loại vi khuẩn thường gặp là: + Agrobacterium 3% + Bacillus 13% + Enterobacter 12% + Pseudomonas 19% + Lactobacillus 11% + Staphylococcus 26% Nhiễm vi khuẩn gặp bất lợi sau: - Rất khó chứng minh nuôi cấy vi khuẩn - Đôi triệu chứng nhiễm bệnh thấy rõ ràng thực vật môi trường nuôi cấy mô - Các triệu chứng thấy xuất chậm môi trường nuôi cấy sau vài lần cấy truyền - Chúng khơng xuất hồn tồn, tạo nhiều trở lại giai đoạn đầu dưỡng - Không phải tất vi khuẩn gây bệnh, đơi vi khuẩn có lợi * Cách chữa trị: Sử dụng kháng sinh 53 1.3 Nhiễm nấm Nấm vi sinh vật phổ biến dễ bị nhiễm q trình ni cấy mơ Có nhiều loại nấm khơng gây bệnh cho thực vật diện nhiều khơng khí mẫu cấy Các loại nấm thường gặp nuôi cấy mô Aspergillus, Candida, Microsprium, Phialophora * Nguyên nhân nhiễm nấm: - Khử trùng bề mặt mẫu cấy chưa chất khử trùng chưa thích hợp - Nhiễm thao tác cấy chuyền - Sự du nhập bào tử nấm côn trùng nhỏ * Cách chữa trị: - Khử trùng hóa chất thích hợp - Thao tác cấy chuyền phải thật kỹ lưỡng - Tránh diện côn trùng nhỏ 1.4 Mycoplasma Phát mycoplasma khó chúng khó ni khó định danh 1.5 Nhện nhỏ bọ trĩ Hầu hết phịng ni cấy mơ lâu năm dễ bị nhiễm loại nhện nhỏ bọ trĩ Những vô hại tác nhân du nhập nấm vi khuẩn vào môi trường Chữa trị cách: Phủ lớp nơng dược có keo bề mặt kệ nơi để bình ni cấy Sinh lý sinh thái 2.1 Sự vận chuyển nước Nước quan trọng diện bình ni cấy Nồng độ đường mơi trường chồi ni cấy khơng có hiệu di chuyển nước, nồng độ agar có hiệu Khi nồng độ agar tăng cao hiều nước di chuyển qua chồi đến vùng xung quanh Vì chồi có khả giữ nước tốt 2.2 Thành phần khí bình ni cấy Thành phần khơng khí bên khoảng trống bình ni cấy tạo tùy thuộc vào giống, loài, giai đoạn phát triển thể qua phóng thích CO2 ethylene 54 Chu trình phóng thích CO2 ngày/đêm ni cấy mơ thay đổi 24 Trong thời gian tối (đêm) nồng độ CO2 nâng lên hô hấp cao nồng độ CO2 giảm thời gian sáng (ngày) Lưu ý: bình ni cấy khác có biến động nồng độ CO2 khác Sự hoá nâu 3.1 Triệu chứng Mẫu cấy môi trường thường trở nên nâu đen sau cấy, sau thời gian mô thường chết Sự sinh trưởng bị ảnh hưởng nặng lồi có nồng độ tanin cao hợp chất phenol lan Hồ điệp Sự hóa nâu bị ảnh hưởng theo thời gian năm mà mô lấy mẫu, diện chất gây nhiễm, phương pháp khử trùng… 3.2 Nguyên nhân Mô hóa đen hoạt động enzyme oxidase chứa đồng (ví dụ polyphenoloxidase tyrosinases) phóng thích tổng hợp diện điều kiện oxy hóa mơ bị thương Sự ngăn cản sinh trưởng khơng thể phục hồi lại phenol bị oxy hóa sang hỗn hợp quinone hoạt hóa cao, lúc cyclise, polymerise oxy hóa protein để thành lập hỗn hợp melanin 3.3 Các biện pháp chữa trị - Để mẫu cấy vào tối nơi ánh sáng - Cấy mơi trường lỏng - Sự ngoại hấp than hoạt tính - Cấy chuyền nhiều lần, có thêm chất oxy hố vào mơi trường nuôi cấy - Ngâm nước máy chất oxy hoá Acid ascorbic (Vitamin C); acid citric Sau khử trùng mẫu cấy ngâm nước cất khử trùng 1-2 tuỳ đặc tính mô cấy Sự biến dị tế bào soma Biến dị soma hay cịn gọi biến dị vơ tính tượng biến động cao cá thể cấy mô chồi bất định Sự biến dị kiểu hình kiểu gen sau di truyền chế niểu sinh theo nguồn gốc * Lợi ích biến dị soma: - Lợi ích cải thiện 55 - Tạo thêm biến dị di truyền - Các đặc tính biến dị vơ tính làm giàu cấy mô bao gồm độc chất bệnh, thuốc trứ cỏ chịu đựng với stress mơi trường hóa chất gia tăng biến dưỡng thứ cấp * Bất lợi biến dị soma: khơng có lợi cho hoạt động ni cấy mơ mà cần có đồng dịng Để giảm biến dị soma nên tránh sử dụng 2,4D nuôi cấy mô Sự thừa nước 5.1 Triệu chứng Hiện tượng thừa nước biểu lóng ngắn bình thường, mộng nước, giịn, dễ gẫy, màu sắc bất thường Khoảng trống gian bào lớn, phát triển hệ mạch giảm làm lớp biểu bì hư, lớp sáp thay đổi, hoạt động 5.2 Nguyên nhân - Mẫu cấy: tuỳ loài giống, độ dài thời gian cấy chuyền, số lần cấy chuyền, cách đặt mẫu cấy môi trường - Môi ttrường: loại nồng độ agar, nồng độ khoáng, loại nồng độ auxin - Bình chứa định thành phần nồng độ khí - Mơi trường bên (vi khí hậu): nhiệt độ, cường độ phẩm chất ánh sáng, ẩm độ tương đối, di chuyển khơng khí 5.3 Các biện pháp chữa trị + Tăng nồng độ agar, sử dụng cytokinin nồng độ thấp, giảm nồng độ ion amonium vi lượng mơi trường + Bình chứa có màng thơng khí plactic thấm khí để gia tăng trao đổi khí + Tăng cường độ ánh sáng môi trường xung quanh + Sử dụng kỹ thuật hai phase (lỏng đặc) + Thêm acid hữu citric acid, succinic acid, malic acid để giúp đồng hóa ion ammonium + Thay đường sucrose fructose galactose 56 Sự chết chồi Sự chết chồi thường gặp nuôi cấy thân gỗ Có nhiều nguyên nhân chết chồi: thiếu calcium, thiếu hormone nội sinh, khoảng thời gian cấy chuyền, nhiễm khí bên bình cấy sử dụng cồn khử trùng dụng cụ cấy Chữa trị: cung cấp thêm calcium môi trường cấy, giảm ô nhiễm khí, sử dụng mơi trường lớp đặc lỏng Cấu trúc bất thường Cấu trúc bất thường trình biến đổi thành quan (chồi, rễ, phơi vơ tính) từ mẫu cấy từ callus khơng hoàn tất ngừng hẳn Cấu trúc bất thường có nhiều loại: cấu trúc giống lá, rễ bất thường, quan giống hoa, giả mầm, cấu trúc giống củ, giả hành, phôi bất thường… Các dạng thể khảm Thể khảm tế bào hai lớp phân sinh mơ có di truyền khác Nó tạo tế bào đột biến tồn cá thể tạo nên pha trộn hai kiểu gen cá thể Các kiểu thể khảm - Thể khảm hình quạt: nêm lớp tế bào khác di truyền diện xuyên qua tất lớp tế bào phân sinh mô chồi - Thể khảm vòng cung: Một phần lớp tế bào [hân sinh mô di truyền riêng biệt - Thể khảm theo chu vi: Một lớp tế bào mơ phân sinh hồn tồn di truyền khác Thực hành: Khảo sát xử lý số trường hợp tạp nhiễm ni cấy mơ 9.1 Mục đích – yêu cầu Sinh viên nhân diện đặc điểm tác nhân gây tạp nhiễm nuôi cấy mô 9.2 Dụng cụ - hóa chất - Kính hiển vi - Mẫu vật bị tạp nhiễm 9.3 Thao tác Bước 1: Ôn luyện kiến thức Sinh viên trình bày tạp nhiễm thường gặp triệu chứng chúng Bước 2: Quan sát mẫu nhận diện 57 - Sinh viên làm việc theo nhóm: quan sát nhận diện tác nhân gây tạp nhiễm mẫu - So sánh tạp nhiễm phương pháp nuôi cấy mô khác Bước 3: Kiểm tra mẫu nhận diện - Giáo viên kiểm tra nhận diện mẫu bị tạp nhiễm sinh viên hay sai - Sinh viên làm việc cá nhân: quan sát nhận diện tác nhân gây tạp nhiễm mẫu Bước 4: Rút kinh nghiệm việc nhận diện mẫu bị tạp nhiễm biện pháp khắc phục CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Những cố thường gập ni cấy mơ gì? Câu 2: Trình bày cách nhận diện bị virus? Câu 3: Trình bày đặc điểm cách chữa trị mẫu cấy mô bị nhiễm vi khuẩn? Câu 4: Nguyên nhân cách chữa trị mẫu cấy mô bị nhiễm nấm? Câu 5: Sự hóa nâu: Triệu chứng, nguyên nhân, cách chữa trị? Câu 6: Dấu hiệu cấy mô bị thừa nước? Cách chữa trị tác nhân này? Câu 7: Tại nuôi cấy mô gặp tượng chết chồi? 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thuỷ Tiên (2002), Công nghệ tế bào, NXB ĐHQG Tp HCM Lâm Ngọc Phương, Lê Minh Lý (2012), Giáo trình nhân giống vơ tính thực vật, NXB Đại học Cần Thơ Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nơng nghiệp Hà Nội Nguyễn Bảo Tồn (2010), Giáo trình ni cấy mơ tế bào thực vật, NXB Đại học Cần Thơ 59 ... THIỆU Giáo trình Ni cấy mơ thực vật biên soạn sở kế hoạch đào tạo ngành Khoa học trồng Trường Cao đẳng Cộng đồng Đồng Tháp Giáo trình cung cấp cho sinh viên kiến thức kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật. .. thiệu nuôi cấy mô thực vật 3 4 12 Khái niệm Lịch sử phát triển nuôi cấy mô giới Hiện trạng nuôi cấy mô Việt Nam CHƯƠNG 2: Các nguyên tắc nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào Thực vật. .. nuôi cấy mô tế bào thực vật? Ni cấy mơ gì? Tóm tắt giai đoạn lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật? Hiện trạng nuôi cấy mô tế bào thực vật Việt Nam? BÀI CÁC NGUYÊN TẮC CỦA NUÔI CẤY MÔ