Ảnh hưởng của dịch trích lá cây cải củ (Raphanus sativus L.) lên sự ức chế hình thành tinh thể calcium oxalate gây bệnh sỏi thận trong điều kiện in vitro

Nghiên cứu sử dụng cao chiết lá cây cải củ trong dung dịch ethanol 80% để đánh giá khả năng ức chế tinh thể Calcium oxalate ở 03 giai đoạn chính là hình thành, phát triển và ngưng tụ. Cao chiết lá cây cải củ có khả năng ức chế sự hình thành hạt nhân; sự phát triển và sự ngưng tụ của tinh thể calcium oxalate với giá trị IC50 lần lượt là 3,26 mg/mL; 1,09mg/mL; 1,13 mg/mL.

INHIBITION OF CALCIUM OXALATE CRYSTALLISATION CAUSING KIDNEY STONES IN VITRO BY AN EXTRACT OF Raphanus sativus L LEAVES Nguyen Pham Tuan1, Bang Hong Lam2, and Nguyen Pham Tu1 An Giang Biotechnology center, Chau Thanh district, An Giang province An Giang University, Viet Nam Nation University, Ho Chi Minh City *Corresponding author: ngphamtuan1983@gmail.com Tel +84.988202055 Abstarct Study of using Raphanus sativus L leaves extract in ethanol 80% to inhibit the formation of Calcium oxalate, including three main phases: nucleation, growth, and aggregation is conducted Method used to evaluate inhibition of nucleation; growth and aggregation of calcium oxalate crystals respectively measured spectroscopy UVVis at λmax = 620nm; λmax = 214 nm, t = 600s; λmax = 620nm at t = 30, 60, 90, 180 and 360 Raphanus sativus L leaves extract has the ability to inhibit nucleation, growth and aggregation of Calcium oxalate crystallisation with an IC50 value of 3.26 mg/mL; 1.09 mg/mL; 1.13 mg/mL respectively Keywords: calcium oxalate, kidney, inhibitor, Raphanus sativus, IC50 228 ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH TRÍCH LÁ CÂY CẢI CỦ (Raphanus sativus L.) LÊN SỰ ỨC CHẾ HÌNH THÀNH TINH THỂ CALCIUM OXALATE GÂY BỆNH SỎI THẬN TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Nguyễn Phạm Tuấn1, Bằng Hồng Lam2 Nguyễn Phạm Tú1 Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang, huyện Châu Thành, tỉnh An Giang Trường Đại học An Giang, Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: ngphamtuan1983@gmail.com Số điện thoại: 0988.202055 Tóm tắt Nghiên cứu sử dụng cao chiết cải củ dung dịch ethanol 80% để đánh giá khả ức chế tinh thể Calcium oxalate 03 giai đoạn hình thành, phát triển ngưng tụ Phương pháp sử dụng để đánh giá ức chế trình hình thành; phát triển ngưng tụ tinh thể calcium oxalate tương ứng đo quang phổ UVVis λmax = 620nm; λmax = 214 nm, t = 600s; λmax = 620nm thời điểm t = 30, 60, 90, 180 360 Cao chiết cải củ có khả ức chế hình thành hạt nhân; phát triển ngưng tụ tinh thể calcium oxalate với giá trị IC50 3,26 mg/mL; 1,09mg/mL; 1,13 mg/mL Từ khóa: Calcium oxalate, cải củ, sỏi thận, ức chế, IC50 229 Giới thiệu Trên Thế giới có khoảng 12% dân số gặp vấn đề sỏi thận (Thomas Han, 2005) Sỏi thận tinh thể dạng rắn, cứng hình thành thận, sỏi thận có dạng: sỏi Calcium oxalate (CaOx) sỏi Calcium phosphate hỗn hợp sỏi thận hai loại tinh thể (chiếm 85%), sỏi struvite, sỏi uric acid sỏi cysteine Trong tinh thể calcium oxalate thành phần 60% trường hợp sỏi thận người tinh thể tồn hai dạng Calcium oxalate monohydrate (COM) Calcium oxalate dihydrate (COD) Trong thể người, sỏi thận có dạng kích thước: nhỏ lớn Sỏi có kích thước nhỏ, thể người thải ngồi mà không gây ảnh hưởng đến sức khỏe người bệnh Ngược lại, sỏi có kích thước lớn làm tắt nghẽn đường tiết niệu gây đau cho bệnh nhân (Atodariya et al., 2013) Hiện nay, thị trường có số tân dược có khả điều trị sỏi thận tân dược có nguồn gốc tự nhiên giúp tăng cường chức thận giúp thận tiết sỏi thận khơng có khả điều trị sỏi thận dạng sỏi Calcium oxalate Ngoài ra, biện pháp y khoa có hiệu việc điều trị sỏi Calcium oxalate có nguy tái phát 50% gây nhiều tác dụng phụ tổn thương mạch máu thận quan xung quanh, tăng nguy cao huyết áp,… (McAteer et al., 2008;) Trong loại thảo dược, cải củ (Raphanus sativus L.) có khả điều trị bệnh tiết niệu sỏi thận (Syed et al., 2017) Trong nghiên cứu này, chúng tơi trình bày kết việc đánh giá khả ức chế sụ hình thành, phát triển ngưng tụ tinh thể calcium oxalate cao chiết ethanol 80% từ cải củ thu hái An Giang Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên vật liệu Nguyên liệu lấy từ vùng trồng cải củ hộ nơng dân xã Bình Thủy, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang Hóa chất thiết bị gồm máy đo quang phổ (Human, Hàn Quốc), máy đông khô chân khơng (Christ, Đức), cân phân tích (Ohaus, Mỹ), máy đo pH (Hanna, Nhật Bản), Sodium oxalate, Sodium citrate, Tris HCl (Merck, Mỹ),… hóa chất thiết bị cần thiết khác 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp tạo cao chiết từ cải củ Lá cải củ rửa sạch, loại bỏ bị sâu bệnh hại đông khô máy đông khô chân khô 96 nghiền thành bột mịn 200 g mẫu khô ngâm với ethanol 80% với tỷ lệ dung môi nguyên liệu 1: 10 (w/v), nhiệt độ phòng, 72 để tối để tránh q trình oxy hóa Sau đó, dịch trích thu cách lọc qua giấy lọc, thu dịch lọc dịch lọc ly tâm 5.000 vòng/phút để thu dịch lọc bỏ phần cặn Dịch lọc tiến hành cô quay chân không dịch lọc 500C để đuổi dung môi Phần dịch lọc sau cô quay chân không đuội sung môi đông khô máy đông khô chân không để thu cao chiết thô bảo quản -200C thực thí nghiệm 2.2.2 Định tính hợp chất có hoạt tính sinh học cao chiết cải củ Các hợp chất có hoạt tính sinh học tồn cao chiết ethanol cải củ định tính phương pháp sử dụng thuốc thử đặc trưng theo nghiên cứu Yadav et al (2014) (Bảng 1) 230 Bảng Định tính hợp chất cao chiết ethanol cải củ Hợp chất Thực nghiệm Hiện tƣợng Alkaloid (Mayer) 1mL dịch trích + vài giọt TT Mayer Kết tủa màu nâu Flavonoid 1mL dịch trích + 2mL Pb(OAc)4 10% Xuất màu vàng Saponin (Foam) 3mL dịch trích+ 6mL H2O→ đun Xuất bọt nóng Steroid (Salkowski) 1mL dịch trích + 2mL CHCl3 + 2mL Xuất vòng đỏ nâu H2SO4đậm đặc lớp Tannin phenol 0,5mL dịch trích + 10mL H2O + 2-3 Kết tủa xanh dương đen giọt FeCl3 0,1% ( Braymer) Terpenoid 2mL dịch trích + 2mL (CH3CO)2O + Xuất màu đỏ đậm 2-3 giọt H2SO4 đậm đặc 2.2.3 Khảo sát khả ức chế hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate cao chiết cải củ Phương pháp thử nghiệm khả ức chế hình thành tinh thể Calcium oxalate cao chiết cải củ thực theo phương pháp Phatak et al (2015) Tất phản ứng thực nhiệt độ 370C máy khuấy từ gia nhiệt Chuẩn bị dung dịch calcium chloride mM natri oxalate nồng độ 50 mM dung dịch đệm gồm Tris 0,05 M Natri chloride 0,15 mM điều kiện pH = 6,5 Q trình phân tích ức chế hình thành tinh thể CaOx thực cách, 950 µL calcium chloride trộn với 100 µL cao chiết cải củ nồng độ khác mẫu đối chứng mẫu khơng có cao chiết (nước cất) Quá trình tạo hạt nhân sỏi calcium oxalate bắt đầu hỗn hợp phản ứng với 950 µL natri oxalate Lắc hỗn hợp 2-3 phút Sự tạo thành tinh thể calcium oxalate % Ức chế = (C-S)/C x 100 Trong đó: C: mật đọ quang mẫu đối chứng; S: mật đọ quang mẫu có cao chiết Thực tương tự chất chuẩn dung dịch natri citrate nước Chất chuẩn sử dụng để so sánh hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể calcium oxalate với cao chiết cải củ chất Natri citrate pha nước cất thực mức nồng độ tương tự cao chiết Đánh giá hiệu ức chế dựa vào IC50 IC50 giá trị dùng để đánh giá khả ức chế mạnh yếu mẫu khảo sát IC50 nồng độ (mg/mL) mẫu, mà ức chế 50% gốc tự do, tế bào enzyme Để xác định giá trị IC50, tiến hành khảo sát hoạt tính mẫu nhiều nồng độ khác Với mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, vẽ đường thẳng y = ax + b qua tất điểm (với y % ức chế x nồng độ); Với mẫu có hoạt tính khơng biến thiên tuyến tính với nồng độ, cách gần đúng, chọn 231 hai nồng độ ức chế 50% tiến hành vẽ đường thẳng y = ax + b  thu phương trình y = ax + b với hệ số a, b biết Từ phương trình y = ax + b biết, thay y = 50% vào phương trình thu giá trị x, nồng độ ức chế 50% gốc tự (IC50) 2.2.4 Khảo sát khả ức chế phát triển tinh thể Calcium oxalate cao chiết cải củ Phương pháp thử nghiệm khả ức chế phát triển tinh thể Calcium oxalate cao chiết cải củ thực theo phương pháp Chaudhary et al (2010) Phản ứng thực cách thêm mL calcium chloride mM mL natri oxalate mM vào 1,5 mL dung dịch buffer chứa natri chloride (90 mM) Tris HCl (10 mM) điều kiện pH = 7,2 Sau đó, thêm vào hỗn hợp 30 µL tinh thể Calcium oxalate monohydrate (1,5 mg/mL) chuẩn bị buffer natri acetate 50 mM (pH = 5,7) Phản ứng Calcium chloride natri oxalate với tinh thể hạt nhân dẫn tới phân bố CaOx bề mặt tinh thể Mẫu đối chứng: phản ứng calcium chloride natri oxalate diễn 10 phút Thêm 0,5 mL nước cất đo độ hấp thu bước sóng λ = 214 nm để xác định độ giảm gốc oxalate tự ban đầu Đo giá trị OD phút lần vẽ đồ thị tính hệ số góc Mẫu thử: phản ứng calcium chloride natri oxalate diễn 10 phút, thêm 0,5 mL cao chiết cải củ nồng độ khác thêm vào đo bước sóng λ = 214 nm Đo giá trị OD phút lần vẽ đồ thị tính hệ số góc % Ức chế = (C-S)/C x 100 Trong đó: C: hệ số góc chất ức chế; S: hệ số góc chất đối chứng 2.2.5 Khảo sát hiệu ức chế ngƣng tụ tinh thể Calcium oxalate cao chiết cải củ Chuẩn bị hỗn hợp tinh thể Calcium oxalate monohydrate theo phương pháp Saha et al (2013) Trộn hỗn hợp gồm Calcium chloride Natri oxalate nồng độ 50 mM Sau đó, hỗn hợp ủ bể điều nhiệt nhiệt độ 600C nhằm tinh thể cân ổn định (khơng phát triển hay hịa tan dung môi) (Hess et al., 1989) làm mát 370C qua đêm Hỗn hợp ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút 10 phút, thu phần cặn, bỏ phần dịch, thu tinh thể Calcium oxalate monohydrate bảo quản tinh thể điều kiện nhiệt độ 40C Thử khả ức chế ngưng tụ tinh thể COM cao chiết cải củ theo phương pháp Saha et al (2013) Tinh thể Calcium oxalate monohydrate hòa tan buffer gồm Tris 0,05 M calcium chloride 0,15 M chuẩn bị pH = 6,5, nhiệt độ 370C nồng độ cuối mg/mL Thêm 500 µL nước cất Đo độ hấp thu giá trị OD đối chứng khơng có dịch trích λ = 620 nm vào khoảng thời gian 30, 60, 90, 180 360 phút Phản ứng ức chế ngưng tụ tinh thể Calcium oxalate monohydrate cao chiết cải củ thực nồng độ khác Tinh thể hòa tan dung dịch đệm gồm Tris 0,05 M natri chloride 0,15 M chuẩn bị pH = 6,5, nhiệt độ 370C nồng độ cuối mg/mL Thêm 0,5 mL cao chiết nồng độ đo độ hấp thu bước sóng λ = 620 nm vào khoảng thời gian 30, 60, 90, 180 360 phút 232 % Ức chế ngưng tụ = (1-Si/Sc) x 100 Trong đó: Si: hệ số góc chất ức chế; Sc: hệ số góc chất đối chứng 2.3 Phƣơng pháp thống kê Số liệu xử lý phần mềm Excel thống kê phần mềm Statgraphics plus 16.0 Kiểm tra khác biệt trung bình theo phép thử Duncan Kết thảo luận 3.1 Kết tạo cao chiết từ cải củ Từ 3.000 gram cải củ tươi thu 400 gram (khô), độ ẩm cải củ 86,67% hiệu suất chiết cao đạt 3,58% (Bảng 2) Hiệu suất trích cao cải củ cao so với nghiên cứu Syed et al (2017) đạt 1,34% (w/w), nguyên nhân sử dụng phương pháp trích ly ngâm dầm dung môi sử dụng nước nên hiệu suất thu hồi thấp phương pháp trích ly sử dụng dung mơi ethanol 80% Ngồi ra, sử dụng cồn tuyệt đối giảm hiệu suất chiết cao ethanol khó thấm vào mẫu Vì vậy, sử dụng ethanol 80% làm dung môi tạo môi trường tối ưu cho việc ly trích, tăng tiếp xúc mẫu dung mơi, tăng hiệu suất trích ly bảo quản mẫu khỏi vi sinh vật (Bandar et al., 2013) Bảng Độ ẩm, hiệu suất chiết định tính hợp chất có hoạt tính sinh học cao chiết cải củ Chỉ tiêu theo dõi Kết Khối lượng mẫu tươi (g) 3.000 Độ ẩm (%) 87,66 Khối lượng mẫu khô (g) 400 Khối lượng cao khô (g) 15,39 Hiệu suất chiết (%) 3,58 3.2 Định tính hợp chất có hoạt tính sinh học cao chiết cải củ Cao chiết cải củ có diện hợp chất alkaloid, terpenoid, saponin, flavonoid, tanin phenol (Bảng 3) tương đồng kết Agarwal Varma (2014) định tính cao chiết cải củ Theo Saranya et al (2014), hợp chất saponin, flavonoid terpenoids có khả ức chế hình thành làm tan tinh thể Calcium oxalate Saponin có đặc tính chống kết tinh cách ngăn cản trình mucoprotein, chất thúc đẩy trình kết tinh (Joshi et al., 2005) Flavonoid ức chế kết tinh canxi oxalate nước tiểu người mơ hình động vật lắng đọng tinh thể 3.3 Khả ức chế hình thành hạt nhân tinh thể CaOx cao chiết cải củ Các hợp chất muối citrate chất ức chế trình hình thành sỏi Calcium oxalate Calcium phosphate Chúng tạo thành phức chất với ion Calcium nên làm giảm nồng độ tinh thể Calcium oxalate, tăng hiệu ức chế ngưng tụ kết tinh sỏi cách tăng hoạt tính urine macromolecule Natri citrate hay Kali citrate giúp tăng độ hòa tan acid uric, ngăn ngừa kết tủa muối Calcium 233 oxalate (Gupta et al., 2011) Vì vậy, chúng tơi sử dụng Natri Citrate chất chuẩn cho thí nghiệm ức chế trình hình thành sỏi Calcium oxalate, gồm ba giai đoạn: hạt nhân, phát triển ngưng tụ Ở nồng độ Natri citrate 10 mg/mL, hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate đạt 88,10±0,14%; nồng độ natri citrate mg/mL, hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate đạt 80,62±0,48% thấp mẫu đối chứng, hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate đạt 0% (Bảng 3) Tiến hành xây dựng đường biểu diễn hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate natri citrate suy giá trị IC50 Natri citrate 1,16 mg/mL Ở nồng độ cao chiết cải củ 10 mg/mL, hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate đạt 73,25±0,13%; nồng độ cao chiết cải củ mg/mL, hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate đạt 68,74±0,54% thấp mẫu đối chứng, hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate đạt 0% (Bảng 4) Tiến hành xây dựng đường thể khả ức chế hình thành hạt nhân Calcium oxalate giá trị IC50 cao chiết 3,26 mg/mL Bảng 3: Kết ức chế hình thành hạt nhân, phát triển ngƣng tụ tinh thể Calcium oxalate Natri citrate Nồng độ (mg/mL) Phần trăm ức chế hạt nhân (%) natri citrate Phần trăm ức chế phát triển (%) natri citrate Phần trăm ức chế ngưng tụ (%) natri citrate 0l 0l 0l 0,25 30,42k± 0,39 29,29k± 0,56 20,60k± 0,65 0,50 39,48h± 0,51 39,84h± 0,51 35,13h± 0,14 0,75 45,42g± 0,42 44,55g± 0,55 40,11g± 0,22 49,55f± 0,57 54,10f± 0,43 44,77f± 0,71 53,47e± 0,47 59,70e± 0,56 49,99e± 0,80 65,16d± 0,50 65,15d± 0,22 53,32d± 0,23 75,29c± 0,46 69,98c± 0,12 57,18c± 0,47 80,62b± 0,48 75,29b± 0,15 60,47b± 0,36 10 88,10a± 0,14 79,97a± 0,21 63,61a± 0,13 Phương trình, giá trị R2 Y = 4,5554x + 44,713 R2=0,9829 Y = 28,52x + 24,777 R2=0,963 Y = 2,3065x + 43,82 R2=0,9452 IC50 (mg/mL) 1,16 0,89 2,68 Trong cột giá trị theo sau kí tự khơng khác biệt mức ý nghĩa 5% 234 y = 4.5554x + 44.713 88.10 R² = 0.9829 75.29 80.62 100 (a) 80 60 49.55 65.16 45.42 53.47 40 20 Phần trăm ức chế hạt nhân (%) Phần trăm ức chế hạt nhân (%) Hiệu ức chế hình thành sỏi thận Calcium oxalate cao chiết Natri citrate đánh giá qua giá trị IC50 Kết quả, giá trị IC50 cao chiết (3,26 mg/mL) cao IC50 Natri citrate (1,16 mg/mL) Nguyên nhân Natri citrate loại hợp chất hóa học kết hợp mạnh với ion Ca2+ tạo thành muối tan giảm mật độ tinh thể nhanh chóng so với cao chiết (Gupta et al., 2011) Kết cao so với nghiên cứu Syed et al (2017) cho rằng, cao chiết nước cải củ có khả ức chế hình thành hạt nhân tinh thể CaOx nồng độ 0,5 mg/mL mg/mL, hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể CaOx đạt 26,66% 40% y = 3.5807x + 38.336 R² = 0.9563 80 (b) 57.59 60 42.59 40 73.25 68.74 53.16 49.83 36.88 20 0 10 10 Nồng độ cao chiết (mg/mL) Nồng độ Natri citrate (mg/mL) Hình Hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể CaOx Natri citrate (a) cao chiết cải củ (b) Khi tiến hành so sánh với nghiên cứu khác cho thấy, Pareta et al (2011), cao chiết A indica Linn đạt 67,36% mức nồng độ 20% Nirmaladevi et al (2012), dịch trích hoa H rosa-sinensis Linn ức chế hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate đạt khoảng 30% nồng độ 1,4 mg/mL Agarwal et al (2015) khả ức chế hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate cao đạt 60,06±0,19% cao chiết A aspera L mg/mL đạt 49,93±0,07% cao chiết B pinnatum Lam nồng độ mg/mL Trần Đức Tài (2016), giá trị IC50 cao chiết thân Bùm sụm cho hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate với IC50 = 1,76 mg/mL 3.4 Khả ức chế phát triển tinh thể CaOx cao chiết cải củ Hiệu ức chế phát triển tinh thể Calcium oxalate đạt cao 79,97±0,21% nồng độ Natri citrate 10 mg/mL; kế đến, nồng độ natri citrate mg/mL, hiệu ức chế phát triển tinh thể Calcium oxalate đạt 75,29±0,15% thấp nhất, hiệu ức chế phát triển tinh thể Calcium oxalate đạt 0% mẫu đối chứng Tiến hành xây dựng đường biểu diễn hiệu ức chế phát triển tinh thể Calcium oxalate natri citrate suy giá giá trị IC50 Natri citrate 0,89 mg/mL (Bảng 3) Tương tự, hiệu ức chế phát triển tinh thể Calcium oxalate đạt cao 71,62±0,21% nồng độ cao chiết mg/mL; kế đến, nồng độ cao chiết mg/mL, hiệu ức chế phát triển tinh thể Calcium oxalate đạt 64,52±0,12% thấp nhất, hiệu ức chế phát triển tinh thể Calcium oxalate đạt 0% mẫu đối chứng (Bảng 4) Tiến hành xây dựng đường biểu diễn hiệu ức chế phát triển tinh thể Calcium oxalate cao chiết cải củ suy giá trị IC50 cao chiết 1,09 mg/mL 235 Chất chuẩn Natri citrate có IC50 = 0,89 mg/mL cao IC50 cao chiết IC50 = 1,09 mg/mL nên cao chiết có khả ức chế mạnh trình phát triển tinh thể Calcium oxalate có khả hình thành hợp chất tan với ion calcium ion oxalate làm giảm khả hình thành sỏi (Gupta et al., 2011) Cao chiết cải củ có khả ức chế phát triển sỏi Calcium oxalate cách bao phủ bên hạt tinh thể nên ngăn cản khả kết hợp chúng, hợp chất thiên nhiên tương tác ngăn cản kết hợp ion Calcium ion Oxalate, ngăn ngừa phát triển sỏi (De Cógáin et al., 2015) Khi tăng hiệu ức chế (10 mg/mL), hiệu ức chế giảm cao chiết gia tăng hình thành tinh thể Calcium oxalate dihydrate lên giảm hình thành Calcium oxalate, tinh thể Calcium oxalate dihydrate khơng có lực lớn nên dễ dàng loại thải ngoài, giảm nguy sỏi thận nên cao chiết cải củ có khả ức chế phát triển Bảng Kết ức chế hạt nhân, phát triển ngƣng tụ tinh thể Calcium oxalate cao chiết cải củ Nồng độ (mg/mL) 0,25 0,50 0,75 10 Phần trăm ức chế hạt nhân (%) cao chiết 0l 19,54k± 0,55 31,38h± 0,70 36,88g± 0,53 42,59f± 0,86 49,83e± 0,11 53,16d± 0,36 57,59c± 0,50 68,74b± 0,54 73,25a± 0,13 Phương trình, Y = 3,5807x + 38,336 giá trị R2 R2=0,9563 IC50 (mg/mL) Phần trăm ức chế phát triển (%) cao chiết 0l 17,58k± 0,09 33,33h± 0,11 40,49g± 0,08 49,59e± 0,25 54,32d± 0,26 59,17c± 0,11 64,52b± 0,12 71,62a± 0,21 46,89f± 0,73 Y = 4,7333x + 44,857 R2=1 3,26 1,09 Phần trăm ức chế ngưng tụ (%) cao chiết 0k 19,20h± 0,40 35,42g± 1,30 40,23f± 0,24 49,62d± 0,44 55,32c± 0,23 63,48b± 0,28 72,19a± 0,09 44,44e± 0,31 39,02f± 0,33 Y = 5,6967x + 43,927 R2=1 1,13 Trong cột giá trị theo sau kí tự khơng khác biệt mức ý nghĩa 5% 236 (a) y = 28.52x + 24.777 R² = 0.963 44.55 54.10 40 39.84 20 0 0.5 Phần trăm ức chế phát triển (%) Phần trăm ức chế phát triển(%) 60 Nồng độ Natri citrate (mg/mL) y = 4.7333x + 44.857 R² = 60 54.32 (b) 49.59 30 0 Nồng độ cao chiết (mg/mL) Hình Hiệu ức chế phát triển tinh thể CaOx Natri citrate (a) cao chiết cải củ (b) Kết cao so với nghiên cứu Syed et al (2017) cho rằng, cao chiết nước cải củ có khả ức chế phát triển tinh thể CaOx nồng độ 0,5 mg/mL mg/mL, hiệu ức chế sự phát triển tinh thể CaOx đạt 31,42% 45,71% Khi so sánh với nghiên cứu khác cho thấy, Nirmaladevi et al (2012), cao chiết nước H rosa-sinensis Linn đạt hiệu ức chế phát triển tinh thể Calcium oxalate 35% mức nồng độ 1,4 mg/mL Kalpana et al (2013), cao chiết ethanol thân B cultivar Monthan đạt hiệu 70% ức chế phát triển hạt nhân tinh thể Calcium oxalate nồng độ 1,6 mg/mL 3.5 Hiệu ức chế ngƣng tụ tinh thể CaOx cao chiết cải củ Ngưng tụ bước quan trọng trình hình thành sỏi, giai đoạn tinh thể nhỏ kết tụ lại lực liên kết hóa học học hay tĩnh điện, làm kích thước sỏi lớn dần khơng thể đào thải ngồi thể, dẫn đến hình thành sỏi thận Cao chiết cải củ có khả ức chế mạnh giai đoạn hợp chất thiên nhiên cao chiết bao phủ bên ngồi tinh thể khiến chúng khơng thể kết tụ lại với nhau, thêm vào cải củ có chứa hợp chất saponin, terpenoid chất có khả ức chế hình thành sỏi cách tương tác ức chế với mucoprotein, ngun nhân gây q bão hịa tinh thể Calcium oxalate, khiến chúng ngưng tụ tạo nên sỏi, nên hiệu ức chế cao chiết tăng lên nghiên cứu động vật Hiệu ức chế ngưng tụ tinh thể Calcium oxalate có khác biệt nồng độ natri citrate khảo sát (Bảng 3) Mẫu đối chứng, hiệu ức chế ngưng tụ tinh thể Calcium oxalate đạt 0%; đó, hiệu ức chế ngưng tụ tinh thể Calcium oxalate đạt cao 63,61±0,13% nồng độ Natri citrate 10 mg/mL Tiến hành xây dựng đường biểu diễn hiệu ức chế ngưng tụ tinh thể Calcium oxalate natri citrate suy giá trị IC50 Natri citrate 2,68 mg/mL 237 (a) 60 49.99 53.32 57.18 40 44.77 20 Phần trăm ức chế ngƣng tụ (%) Phần trăm ức chế ngƣng tụ (%) y = 2,3065x + 43,82 R² = 0,9452 80 90 (b)y = 5.6967x + 43.927 R² = 55.32 60 49.62 30 0 Nồng độ Natri citrate (mg/mL) Nồng độ cao chiết (mg/mL) Hình Hiệu ức chế ngƣng tụ tinh thể CaOx Natri citrate (a) cao chiết cải củ (b) Tương tự, hiệu ức chế ngưng tụ tinh thể Calcium oxalate có khác biệt nồng độ cao chiết khảo sát (Bảng 4) Mẫu đối chứng, hiệu ức chế ngưng tụ tinh thể Calcium oxalate đạt 0%; đó, hiệu ức chế ngưng tụ tinh thể Calcium oxalate đạt cao 72,19±0,09%% nồng độ cao chiết cải củ mg/mL Tiến hành xây dựng đường biểu diễn hiệu ức ngưng tụ tinh thể Calcium oxalate cao chiết cải củ suy giá trị IC50 cao chiết 1,13 mg/mL Natri citrate có IC50 = 2,68 mg/mL cao IC50 cao chiết IC50 = 1,13 mg/mL Cao chiết cải củ có khả ức chế mạnh giai đoạn ngưng tụ hợp chất thiên nhiên cao chiết bao phủ bên ngồi tinh thể khiến chúng khơng thể kết tụ lại với cảo củ có chứa hợp chất saponin, terpenoid chất có khả ức chế hình thành sỏi cách tương tác ức chế với mucoprotein, nguyên nhân gây bão hòa tinh thể Calcium oxalate, khiến chúng ngưng tụ tạo nên sỏi, nên hiệu ức chế cao chiết tăng lên nghiên cứu động vật Tuy nhiên tăng mức nồng độ cao chiết (8-10 mg/mL), hiệu ức chế giảm cao chiết giảm hình thành tinh thể Calcium oxalate dihydrate lên nhiều lần, gia tăng hình thành Calcium oxalate monohydate, tinh thể Calcium oxalate dihydrate khơng có lực lớn nên dễ dàng loại thải ngồi, khơng giảm q bảo hịa tinh thể Calcium oxalate thể, giảm nguy sỏi thận nên cao chiết cải củ có khả ức chế ngưng tụ (Atmani et al., 2000) Khi so sánh với nghiên cứu khác cho thấy, Vyawahare et al (2014), cao chiết M Charantia L đạt hiệu ức chế ngưng tụ sỏi Calcium oxalate 30% nồng độ 0,5 mg/mL Nghiên cứu Agarwal et al (2015) P niruri L hiệu ức chế ngưng tụ sỏi Calcium oxalate đạt mức 58,62%±0,02% nồng độ mg/mL Kết luận kiến nghị Cao chiết ethanol cải củ có khả ức chế hình thành, phát triển, ngưng tụ làm tan tinh thể Calcium oxalate gây bệnh sỏi thận điều kiện in vitro với giá trị IC50 3,26 mg/mL; 1,09 mg/mL 1,13 mg/mL Tiếp tục nghiên cứu đánh giá hiệu cao chiết điều kiện in vivo phân lập hoạt chất có khả ức chế trình hình thành, phát triển ngưng tụ tinh thể 238 Calcium oxalate từ cao chiết cải củ nhằm nâng cao giá trị sử dụng loài thực tiễn Lời cảm ơn Xin chân thành cảm ơn Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An Giang tạo điều kiện hỗ trợ để thực nghiên cứu Tài liệu tham khảo Agarwal, K., and Varma, R (2014) Investigating Antiuroliathiatic Potential of Phyllanthus niruri L A Member of the Family Euphorbiaceae American Journal of Phytomedicine and Clinical Therapeutics, (7): 823-831 Agarwal, K., and Varma, R (2015) In-vitro Calcium oxalate crystallization inhibition by Achyranthes aspera L and Bryophyllum pinnatum Lam British Journal of Pharmaceutical Research, (2): 146-152 Atmani, F., and Khan, S.R (2000) Effects of an extract from Herniaria hirsuta on calcium oxalate crystallization in vitro Bju International, 85 (6): 621-625 Atodariya, U., Barad, R., Upadhyay, S., and Upadhyay, U (2013) Anti-Urolithiatic Activity of Dolichos Biflorus Seeds Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2(2): 209-213 Bandar, H., Hijazi, A., Rammal, H., Hach, A., Saad, Z and Badran, B (2013) Techniques for the extraction of bioactive compounds from Lebanese Urtica Dioica American J of Phytomedicine and C Therapeutics, 6: 507-513 Chaudhary, A., Singla, S.K and Tandon, C (2010) In vitro evaluation of Terminalia arjuna on calcium phosphate and calcium oxalate crystallization Indian journal of pharmaceutical sciences, 72 (3): 340-345 De Cógáin, M.R., Linnes, M.P., Lee, H.J., Krambeck, A.E., Mendonỗa Uchụa J.C., Kim, S.H and Lieske, J.C (2015) Aqueous extract of Costus arabicus inhibits calcium oxalate crystal growth and adhesion to renal epithelial cells Urolithiasis, 43 (2): 119-124 Gupta, M., Bhayana, S and Sikka, S.K (2011) Role of urinary inhibitors and promoters in calcium oxalate crystallisation International J of Research in Pharmacy and Chemistry, 1: 793-798 Hess, B., Nakagawa, Y and Coe, F.L (1989) Inhibition of calcium oxalate monohydrate crystal aggregation by urine proteins Am J Physiol., 257: 99-106 Joshi, V.S, Parekh, B.B., Joshi, M.J., and Vaidya, A.B (2005) Herbal extract of Tribulus terrestris and Bergenia ligulata inhibit of calcium oxalate monohydrate crystals in vitro J Cyst Growth, 275: 1403-1408 Kalpana, S., Nirmaladevi, R., Rai, T.S and Karthika, P (2013) Inhibition of Calcium oxalate crystallization in vitro by extract of Banana cultivar monthan International J of P and Pharmaceutical Sciences, (4): 649-653 McAteer, J.A., and Evan, A.P (2008) The acute and long-term adverse effects of shock wave lithotripsy In Seminars in nephrology, 28 (2): 200-213 239 Nirmaladevi, R., Kalpana, S., Kavitha, D and Padma, P.R (2012) Evaluation of antilithiatic potential of Hibiscus rosa-sinensis Linn, in vitro Journal of Pharmacy Research, (8): 4353-4356 Pareta, S.K., Patra, K.C and Harwansh, R (2011) In-vitro Calcium oxalate crystallization inhibition by Achyranthes indica linn Hydroalcoholic extract: An approach to antilithiasis Int J Pharm Bio Sci, 2: 432-437 Phatak, R.S., and Hendre, A.S (2015) In-vitro antiurolithiatic activity of Kalanchoe pinnata extract International Journal of Pharmacognosy and Phytochemical Research, 7: 275-279 Saha, S., and Ramtej, J.V (2013) Inhibition of calcium oxalate crystallisation in vitro by an extract of Bergenia ciliata Arab J of Urology, 11: 187-192 Saranya, R., and Geetha, N (2014) Inhibition of calcium oxalate (caox) crystallization in vitro by the extract of beet root (Beta Vulgais L.) International J of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, (2): 361-365 Syed, S.A., Mular, S.M., Khan, N.D., Khan Z.H and Sohail, S (2017) In vitro study of aqueous leaf extract of Raphanus sativus var for inhibittion of calcium oxalate crystallization Bioscience discovery, (2): 153-157 Thomas, B., and Han, J (2005) An overview on Urolithialis Urothilialis Surgery (Oxford), 23: 129-133 Vyawahare, J.N., Shelke, P.A., Aragade, P.D and Baheti, D.G (2014) Inhibition of calcium oxalate crystallization in vitro by extract of Momordica charantia Linn International Journal Of Pharmaceutical And Chemical Sciences, (2): 448-452 Yadav, M., Chatterji, S., Gupta, S.K and Watal, G (2014) Preliminary phytochemical screening of six medicinal plants used in traditional medicine International J.of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, (5): 539-542 240 .. .ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH TRÍCH LÁ CÂY CẢI CỦ (Raphanus sativus L.) LÊN SỰ ỨC CHẾ HÌNH THÀNH TINH THỂ CALCIUM OXALATE GÂY BỆNH SỎI THẬN TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Nguyễn Phạm Tuấn1,... sụm cho hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate với IC50 = 1,76 mg/mL 3.4 Khả ức chế phát triển tinh thể CaOx cao chiết cải củ Hiệu ức chế phát triển tinh thể Calcium oxalate đạt... 2.2.3 Khảo sát khả ức chế hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate cao chiết cải củ Phương pháp thử nghiệm khả ức chế hình thành tinh thể Calcium oxalate cao chiết cải củ thực theo phương