kỹ thuật di truyền và các omics Hỗ trợ và Tải tài liệu miễn phí 24/7 tại đây: https://link1s.com/yHqvN

Sự khác nhau căn bản của kĩ thuật mới với phương pháp cũ ở chỗ cho phép trong điều kiện thí nghiệm in vitro trong ống nghiệm tạo thành ghép nối các tổ hợp có hoạt tính khi đưa trở và

CHƯƠNG XII

KỸ THUẬT DI TRUYỀN

VÀ CÁC OMICS

• Vào năm 1972 – 1973, Berg, Boyer và Cohen ở

Mĩ đã tạo nên phân tử DNA tái tổ hợp in vitro từ

ba nguồn vật liệu di truyền khác nhau Tiếp

theo, 1973 – 1974, nhóm Cohen, Helinski, Boyer đã lần đầu tiên nhận được DNA tái tổ hợp có

hoạt tính sinh học Sự khác nhau căn bản

của kĩ thuật mới với phương pháp cũ ở

chỗ cho phép trong điều kiện thí nghiệm in

vitro (trong ống nghiệm) tạo thành (ghép

nối) các tổ hợp có hoạt tính khi đưa trở vào

tế bào sống từ các đoạn DNA khác nhau

có lựa chọn.

Có nhiều thuật ngữ đồng nghĩa để chỉ kĩ thuật này :

• – Kĩ thuật tái tổ hợp DNA (DNA recombinant

technology).

• – Kĩ thuật di truyền (Genetic engeneering)

• – Kĩ thuật gen (Gene engineering) hay Công

nghệ gen (Genetic technology hay gentech).

• – Tạo dòng phân tử (molecular cloning)

• Tuy nhiên, khái niệm kĩ thuật di truyền có nghĩa

rộng hơn, bao trùm hơn

I KĨ THUẬT TÁÙI TỔ

HỢP DNA.

Sơ đôàà kháùi quáùt.

1.Tách DNA plasmid và DNA tế

bào cho (người)

2 Cắt cả hai loại DNA restriction endonuclease tạo các đầu so le cố kết 3 Trộn

2 loại DNA để gắn gen lạ vào plasmid 4 Ligase tạo

liên kết hóa trị (Phosphodiester) 5 Chuyển ADN tái tổ hợp vào

tế bào nhận (vi khuẩn

E.coli)

6 Tạo dòng.

Các dạng đầu mút tạo ra bởi các loại enzyme giới hạn

Enzyme cắt hạn chế (Restriction

endonuclease - RE)

Enzyme cắt hạn chế (Restriction

endonuclease - RE) endonuclease - RE)

2 Thu nhận gen

• a Tách các đoạn DNA từ bộ gen

b Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học

• - Hormone somatostatin

• - Insulin

• c Sinh tổng hợp gen từ mRNA của gen

tương ứng

a Tạo các oạn DNA có chứa đoạn DNA có chứa

gen từ bộ gen

buổi đầu của kỹ thuật di truyền Tồn bộ DNA

của một sinh vật được cắt đoạn nhỏ khoảng 15 - 20.000 cặp base bằng lắc cơ học hay bởi các

restriction endonuclease (RE) Các đoạn DNA

ngắn này được gắn vào các plasmid tái tổ hợp,

mà các plasmid này được biến nạp vào tế bào để tạo dịng đoạn DNA hoặc theo dõi sự biểu hiện

của gen

• Phương pháp này mang nhiều tính chất

mò mẫm, vì nguyên bộ gen, tức toàn bộ

DNA dài của các sinh vật khác nhau, bị cắt

ra nhiều mảnh ngắn và dò tìm đoạn gen

cần thiết Do vậy, nó được gọi bằng tiếng

Anh là Shotgun (bắn đạn chài) Tuy nhiên,

nó phải được sử dụng bắt buộc trong lập

ngân hàng gen hay thư viện gen của các

sinh vật, được gọi là ngân hàngDNA bộ

gen (Bank of genomic DNA) hay thư viện DNA bộ gen (Genomic DNA libraries).

b Tổng hợp gen bằng phg pháp hóa học

• Lần đầu tiên vào năm 1977, K Itakura và Boyer

đã thành công trong việc cho gen tổng hợp nhân

tạo, mã hóa hormone somatostatin của động vật

có vú, biểu hiện trong tế bào E.coli Gen

somatostatin đã nhận được nhờ biết cấu trúc

peptide của hormone chỉ gồm có 14 amino acid

Sau đó, các dòng E.coli mang gen tổng hợp khác được tạo ra, chúng sản sinh hormone tăng

trưởng ở người (Somatotropin) và các hormone

peptid khác Gen hormone tăng trưởng người

gồm 584 cặp nucleotide là gen dài nhất được

tổng hợp nhân tạo vào cuối những năm 1970

c Sinh tổng hợp gen từ mRNA của gen

tương ứng

dụng rộng rãi Phương pháp này dựa vào phiên

mã ngược nhờ enzyme reverse transcriptase,

DNA-polymerase phụ thuộc RNA Enzyme tổng

hợp mạch đơn c-DNA (complementary DNA) từ

khuôn mRNA hoặc từ một đoạn RNA tổng hợp hóa học Sau đó, DNA polymerase chép mạch

đơn thành c-DNA mạch kép, chính là đoạn gen không chứa các intron Nhờ enzyme này có thể

tổng hợp hầu như bất cứ gen riêng biệt nào miễn

có mặt mRNA của nó Phương pháp này tạo ra

thư viện c-DNA (c-DNA librairies)

LIBRARIES (CÁC THƯ VIỆN GEN)

•Thư viện DNA bộ gen (Genomic DNA libraries)

•– Chứa tất cả DN bộ gen của tế bào, gồm một

loạt các đoạn chồng lắp (lots of overlap), có tất cả các đoạn DNA hiện diện Nếu đoạn chèn vào là

40 kb, thì sẽ có 75,000 dòng DNA người

•– Thư viện cDNA – Thư viện các DNA chép từ

mRNA nhờ phiên mã ngược (reverse

Transcription), chỉ chứa các gen có biểu hiện

(only those genes expressed will be represented

Wadsworth Center

3 CÁC VECTOR CHUYỂN GEN

• - Vector plasmid

• - Phage lamda

• - Cosmid = plasmid + trình tự cos (phage λ)

• - YAC (Yeast artificial chromosome –NST nhân tạo của nấm men)

• - Ti-plasmid từ vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens

• - Phage M13 (DNA mạch đơn).

Các vector chuyển gen phải thoả mãn các yêu cầu tối thiểu :

• – Có các trình tự khởi sự sao chép (ori) để tự sao

chép mà tồn tại độc lập.

• – Có các trình tự nhận biết, nơi cắt để hở làm

chỗ ráp đoạn gen lạ vào.

• – Các trình tự điều hòa (promoter) tạo thuận lợi

cho sự phiên mã gen lạ.

• – Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ

hợp.

• – Có các gen đánh dấu để dễ dàng phát hiện ra

chúng hoặc các gen lạ.

Các vector chuyển gen plasmid

Các vector chuyển gen plasmid

4.363 kp

Plasmid pBR322

Các vector chuyển gen có 5 ứng dụng

quan trọng chủ yếu :

• – Tạo dòng và khuếch đại trình tự của

DNA (nhiều bản sao giống nhau).

• – Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn

trình tự DNA.

• – Chuyển gen vào tế bào các sinh vật khác.

• – Sản xuất RNA.

• – Sản xuất protein từ gen được tạo dòng.

a) Các vector plasmid

• Một trong những plasmid được sử dụng rộng rãi

nhất là pBR322 Như mô tả, plasmid này có gen kháng ampicilline (ampR), gen kháng

tetracyline (tetR), trình tự xuất phát sao chép

(ori) và nhiều trình tự nhận biết đặc hiệu cho

các RE như EcoRI , HindIII, BamHI, SalI, Nó có khả năng sao chép độc lập với bộ gen tế bào

E.coli và tồn tại với số lượng trung bình 20 – 30

bản sao cho mỗi tế bào

khuếch đại cĩ chọn lọc làm tăng số plasmid đến hơn 1000 bản sao cho một tế bào

Plasmid pBR322

b Các vector chuyển gen là phage 

gen vì nhiều phage có khả năng thực hiện tải nạp, chuyển gen từ tế bào cho (donor) sang tế bào

nhận (recipient) Vector phage  được sử dụng

rộng rãi để lập ngân hàng gen, vì nó mang được đoạn DNA lớn hơn (15-23 Kb), dễ bảo quản, dễ

tách gen ra phân tích

c Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men

• Cho đến nay ở Eukaryotae người ta chỉ tìm

được một loại plasmid duy nhất đĩ là plasmid

vịng trịn 2 micromet (2 circle plasmid) cĩ

chiều dài khoảng 6300 cặp base (lớn hơn

plasmid pBR322) và cĩ nhiều trong tế bào nấm men Sự cải tiến plasmid này qua nhiều bước

dẫn đến tạo thành NST nhân tạo (artificial

chromosome) nấm men, gọi tắt là YAC (Yeast

Artificial Chromosome)

• YAC gồm những trình tự nucleotide căn bản :

Ori, CEN (centromer -tâm động), EcoRI, TEL

(telomer là 2 trình tự đầu mút của NST) và ở

phía trước 2 TEL có 2 BamHI (RE) Khi cắt

bằng EcoRI và BamHI, YAC bi đứt thành 2 đoạn

A và B, mỗi cái có 1 đầu TEL và đầu kia là

EcoRI Nếu DNA, ví dụ của người, cũng bi cắt

rất nhẹ bằng EcoRI thì nhờ các đầu cố kết, chúng

sẽ gắn vào trình tự EcoRI và nối A với B thành

nhiễm sắc thể nhân tạo có khả năng sao chép nhờ Ori và phân chia đều về các cực của tế bào nhờ

CEN YAC có khả năng mang đoạn gen rất dài,

có thể đến 1 - 2 triệu cặp nucleotide (1 - 2

Megabase - Mb)

Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men

11,4 kb

TYPES OF VECTORS DOUBLE-STRANDED CÁC KIỂU VECTOR MẠCH KÉP

KHẢ NĂNG CHỨA ĐOẠN DNA DÀI NHẤT

•Plasmids polylinker, abr gene, rec screen 0-10 kb

•Bacteriophage bacterial virus, ~20 kb

•Cosmids “cos” sequence + plas “mid”, ~30-44 kb

•BACs > 300kb, low copy = low DNA yield, F-factor

•Bacteriophage P1 about 70-100 kb

•PACs vector combining P1 and F-factor attributes

130-150 kb

•YACs tiny functional chromosomes (CEN, TEL,

ARS) 2 to 2 Mb can be cloned Wadsworth Center

4 TẠO PLASMID TÁI TỔ HỢP

• 1 Phương pháp đơn giản dùng các đầu cố kết

• 2 Phương pháp dùng các đoạn nối (linkers)

• 3 Phương pháp dùng enzyme terminal transferase

4 TẠO PLASMID TÁI TỔ HỢP

• Bước tiếp theo là gắn các đoạn DNA lạ hay các

c-DNA vào vector chuyển gen để tạo plasmid tái

tổ hợp cĩ mang DNA lạ Phương pháp gắn các

đoạn DNA vào vector đơn giản dùng các đầu

mút cố kết hay “đầu dính”.

• Phương pháp này dựa trên cơ sở sự gắn các

đoạn DNA với nhau, mà mỗi một trong chúng

cĩ “đầu dính” tương tự, nhận được do bị cắt bởi cùng một loại RE (restriction endonuclease) Sơ

đồ mơ tả quá trình gắn DNA lạ vào vector

chuyển gen nhờ các đầu “dính” hay “cố kết”

• Vector là DNA vòng tròn được cắt bởi một

loại RE như EcoRI chuyển thành dạng

thẳng có hai đầu cố kết Các phân tử DNA

của bộ gen khác được cắt bởi cùng một loại

RE (EcoRI) sẽ tạo ra nhiều đoạn DNA

thẳng có các “đầu dính” Trộn lẫn DNA

thẳng của vector cắt hở với các đoạn DNA

lạ Các “đầu dính” của hai loại DNA bắt

cặp bổ sung với nhau Enzyme ligase hàn

dính liền các loại DNA lại với nhau tạo ra

plasmid tái tổ hợp (còn gọi DNA tái tổ hợp –

Recombinant DNA)

BIẾN NẠP DNA TÁI TỔ HỢP

VÀO TẾ BÀO

• a Hóa biến nạp

• b Điện biến nạp.

• c Vi tiêm (micro-injection)

• d Bắn DNA vào tế bào

• Các hạt kim loại tungsten hay vàng

Vi tieâm (Microinjection)

Suùng baén DNA

5 Tạo dòng phân tử

• DNA tái tổ hợp tiếp theo được đưa vào tế bào

bằng nhiều phương pháp khác nhau như biến

nạp hĩa học, điện biến nạp, vi tiêm hoặc bắn vào

tế bào Từ những dịng tế bào nhận được chọn ra đúng dịng cĩ mang gen lạ, kiểm tra lại Những dịng tế bào cĩ mang đúng gen lạ được đem nhân lên và như vậy gen ban đầu được nhân lên vơ số bản sao Nếu những dịng này cĩ khả năng biểu hiện tốt trong sinh tổng hợp protein thì được sử dụng để tạo sản phẩm

6 Kỹ thuật PCR

phương pháp đơn giản để khuếch đại nhanh

nhiều bản sao (amplification) của các đoạn DNA

mà không qua tạo dòng Kỹ thuật này được gọi

là polymerase chain reaction, viết tắt là PCR,

được hiểu là phản ứng polymerase dây chuyền

Kỹ thuật này được ứng dụng nhanh và có ý nghĩa cách mạng đối với sự phát triển của sinh học

phân tử và KTDT

• – DNA polymerase chịu nhiệt (thermostable).

• – dNTP : các loại nucleotide triphosphate.

• – Dung dịch đệm (buffer) thích hợp và MgCl 2.

• Bổ sung mồi 1, mồi 2, dNTP

và Taq polymerase

• Tăng đến 95oC để tách mạch

• Giảm đến 60oC để mồi bắt cặp

• Tăng đến 95oC để tách mạch

• Giảm đến 60oC để mồi bắt cặp

• Mồi P2DNA mục tiêu

• Ở 60oC mồi được kéo dài nhờ

DNA mục tiêu

Bổ sung mồi 1, mồi 2, dNTP và Taq polymerase

Tăng đến 95 o C để tách mạch Giảm đến 60 o C để mồi bắt cặp Mồi P1

• PCR là kỹ thuật khuếch đại một đoạn trình tự

DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme

DNA polymerase, được thực hiện nhờ các chu

trình nhiệt lặp lại (có thể đến 35 lần) gồm đun

nóng (950C), làm nguội (37 – 650C) và ủ dài ở

720C Trong dung dịch có các primer (đoạn mồi)

P1 và P2, mỗi loại sẽ bắt cặp bổ sung với đầu

mạch đơn tương ứng (hình 12.4) Nhờ vậy 1

mạch kép DNA, sau phản ứng sẽ thành 2 mạch DNA kép và có thể thực hiện chu trình khuếch

đại mới: 2 thành 4 và 4 thành 8 theo cấp số nhân

• Phản ứng được thực hiện trong ống

nghiệm plastic nhỏ, có mẫu DNA, primer

và Taq polymerase (DNA polymerase chịu nhiệt), được gắn vào hệ thống nung nóng

có điều chỉnh thành chu kì nung nóng và làm nguội theo chương trình định sẵn gọi

là thermocycler, đây chính là máy PCR.

• Phương pháp này có ý nghĩa lớn vì nhiều

lí do:

Giá trị sử dụng

• – Thời gian thực hiện cực nhanh, chỉ cần mất 3

giờ để khuếch đại một trình tự DNA được quan tâm tạo dòng của kĩ thuật tái tổ hợp DNA phải mất cả tuần hoặc lâu hơn.

• – Đơn giản và ít tốn kém : Nó được thực hiện

trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm các thành

phần tối thiểu và được sử dụng đồng thời

• – Độ tinh sạch của mẫu không cần cao : PCR có

thể thực hiện với các mẫu nucleic acid thô Ví dụ, mẫu máu hay các dấu vết trong phân tích pháp y

Sự hoàn thiện nhanh và mở rộng ứng dụng PCR

• Từ khi ra đời đến nay, PCR có vai trò cách

mạng hoá trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và

ứng dụng khác nhau như chẩn đoán nhanh, giải

kí tự chuỗi bộ gen, gây đột biến điểm định

hướng, Có thể thực hiện PCR in situ (ngay

trong tế bào) với cả DNA và RNA Sức mạnh

của PCR kết hợp với các kĩ thuật khác của tạo dòng phân tử giúp sinh học xâm nhập vào nhiều lĩnh vực mà trước đây khó với tới

• Tóm lại, PCR đã phát triển nhanh từ mẫu ban

đầu là DNA đến cả mẫu RNA, từ định tính tiến tới định lượng và cả các loại hình khác, mà ở đây

chưa kể hết.

• Do dễ thực hiện, đơn giản và cĩ nhiều ứng dụng

rộng rãi, nên PCR được hồn thiện khơng ngừng Trong một thời gian ngắn, nhiều biến dạng PCR mới ra đời Tĩm lại, PCR đã phát triển nhanh từ mẫu ban đầu là DNA đến cả mẫu RNA, từ định

tính tiến tới định lượng và cả các loại hình khác,

mà ở đây chưa kể hết

II GENOMICS VÀ CÁC – OMICS KHÁC

• 1 Genomics.

• 2 Proteomics.

• 3 BỘ GEN NGƯỜI.

• 4 Các –omics khác.

Công nghệ gen xâm nhập phố Wall

• Nhờ kỹ thuật tạo dòng phân tử, các gen có thể

được nhân ra nhiều bản sao và tương ứng thu

được số lượng lớn DNA của gen Nhờ vậy, phân

tử DNA trở nên dễ nghiên cứu Nhiều phương

pháp dẫn xuất bắt nguồn từ tạo dòng phân tử

nhanh chóng ra đời và trở thành những công cụ mới trong nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn Đặc

biệt, phương pháp xác định trình tự nối tiếp chuỗi (sequencing) nucleotide của gen hay gọi ngắn gọn

là giải ký tự chuỗi giúp cho sự hiểu biết về gen

ngày nay đạt đến trình tự sắp xếp từng nucleotide

của gen

• Ngoài ra, trước đây việc nghiên cứu DNA và

protein thường tách rời rồi đối chiếu kết quả với nhau Nay có thể biết được quá trình liên tục từ DNA đến RNA rồi protein Điều này giúp giải

quyết nhiều vấn đề sinh học mà trước đây khó

với tới như nghiên cứu chi tiết các gen ung thư,

đi sâu vào các bí ẩn của bộ não người

• Sự hiểu biết chi tiết về DNA bộ gen dẫn đến di

truyền ngược: khởi sự từ DNA truy ra hiệu quả

kiểu hình Khác với di truyền cổ điển bắt đầu từ kiểu hình rồi đến DNA Bước đầu, hướng này có tiến triển tốt trong việc truy tìm nhiều bệnh

1 Genomics : khoa học

nghiên cứu bộ gen bao gồm giải ký tự chuỗi và xác định chức năng gen

1 Genomics

• Mỗi tế bào đều chứa bộ gen là DNA, chi

phối mọi biểu hiện sống Sự hiểu biết trọn

vẹn bất kì quá trình sinh học nào chỉ có thể đạt được khi phân tích được chi tiết cấu

trúc và chức năng DNA bộ gen Từ 1990

đến nay, việc giải ký tự chuỗi DNA của hàng

loạt sinh vật đã được thực hiện Đến năm

2008, gần 850 loài đã giải ký tự chuỗi xong,

mà một số ít điển hình được nêu ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Một số bộ gen giải ký tự chuỗi hoàn toàn

Mô hình nghiên cứu cây có hoa

ĐV nhỏ dự báo chính xác phát triển Đối tượng mô hình

di truyền động vật Được nghiên cứu kỉ nhất

580.000(580Kb) 4.639.000

(4,639 Mb) 12.069.000 (12,069Mb.)

~ 142.000.000 (142 Mb)

~ 97.000.000 (97 Mb)

~ 137.000.000 (137 Mb)

~ 3.200.000.000 (3,2 Gb)

468 4289

Các loại bản đồ :

a Di

truyền tế bào.

b Liên kết.

C Vật lý.

d Kí tự chuỗi

Sự xác định vị trí cụ thể từng nucleotide của gen hay gọi ngắn gọn là giải ký tự chuỗi (sequencing) hàng

loạt các sinh vật đã dẫn đến

Genomics :

•khoa học nghiên cứu bộ gen bao gồm

giải ký tự chuỗi và xác định chức

năng gen

PTN 42 sequencer tự động ở Nhật Bản

2 BỘ GEN NGƯỜI

• Dự án bộ gen người.

• Đầu năm 1990, chương trình giải trình tự

nucleotide bộ gen người (Human Genome

Project – HGP), gọi ngắn gọn là chương

trình bộ gen người bắt đầu với kinh phí 3 tỉ USD trong 15 năm, kết thúc vào 2005

James Watson, người phát minh mô hình

chuỗi xoắn kép DNA Watson- Crick năm

1953, là người chủ trì đầu tiên của chương trình ở các Viện sức khỏe Quốc gia Hoa Kỳ NIH (National Institutes of Health) đến năm

1992 từ chức.