Thí nghiệm hóa sinh và thực hành MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN (Tải: https://link1s.com/yHqvN)

Phương pháp tủa bằng các tác nhân gây tủa là dung môi hữu cơ Ethanol 80%, Aceton Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi củ

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN

I Phương pháp tủa bằng các tác nhân gây tủa là dung môi hữu cơ (Ethanol 80%, Aceton)

Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó

là hằng số điện môi của dung dịch Nhìn chung, những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản sự phân tán của các phân

tử protein trong môi trường Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nước như aceton vào dung dịch chứa protein Sự tủa bằng aceton hoặc ethanol 80% có nhiều thuận lợi hơn vì nó tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzym, do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió

II Phương pháp tủa bằng muối

Người ta có thể dùng muối (NH4)2SO4, NaCl… để tủa protein vì các muối này vừa làm trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại

bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng

Phần thí nghiệm

1 Dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ

Pipet 5ml, 10ml

Becher 50ml, 100ml, 250ml

Bình tia

Máy ly tâm

Hóa chất

Nguyên liệu thơm (dứa) Etanol 96%

Muối (NH4)2SO4

2 Thực hành

Cân khoảng 80g đến 100g thơm, giã nát vắt lấy nước rồi ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút rồi đong xem thể tích của nước thơm là bao nhiêu, ghi nhận thể tích V Sau đó chia đôi thể tích V nước thơm vùa thu được thành hai phần bằng nhau rồi tiến hành tủa protein bắng hai tác nhân tủa khác nhau: Ethanol 80% và muối (NH4)2SO4

Quy trình kết tủa enzym Bromelin bằng cồn 80%

Lưu ý: Phối trộn cồn với dịch dứa theo tỉ lệ 4:1 (1 dứa : 4 cồn)

Làm sạch

Nghiền ép, xay nhuyễn

Lọc

Ly tâm 6000 v/p, trong

15 phút Dịch trong

Chồi ngọn, vỏ quả

Bã

Bã

Tủa cồn 4oC / 2 giờ

Ly tâm 6000 v/p, trong

20 phút

Thu tủa

Sấy khô

Bromelin

Bỏ dịch trong cồn 80%, làm

lạnh 40C

Quy trình thu nhận enzym Bromelin bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4

Lưu ý: Để có muối(NH4)2SO4 bão hòa 70% ta phối trộn với tỷ lệ 47,2g muối trong 100ml nước thơm

Làm sạch Nghiền ép, xay nhuyễn

Lọc

Ly tâm 6000 v/p, 15 –

Bã Chồi ngọn, vỏ quả

Hỗn hợp dịch dứa, để ở nhiệt độ phòng 30 phút

Ly tâm 6000 v/p, trong

15 phút

Thu tủa

Bỏ dịch trong Sấy khô

Bromelin

Dịch trong

Ammonium

sulfate 70%

bão hòa

3 Kết quả: Hãy tính hàm lượng protein có trong 100g nguyên liệu ban đầu.

III Phương pháp tủa protein bằng điểm đẳng điện.

1 Nguyên tắc

Giá trị pH mà tại đó phân tử protein trung hòa điện gọi là điểm đẳng điện của protein (pI), ở giá trị pH = pI phân tử protein trung hòa điện sẽ không chuyển dịch trong điện trường, phân tử protein sẽ kém bền nhất dễ kết tủa

Người ta lợi dụng tính chất này để kết tủa protein

2 Dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ

Máy khuất từ

Máy ly tâm

Cân phân tích

Bercher 100ml, 250ml

Pipet 5ml, 10ml

Hóa chất

Dung dịch NaOH 20%

Dung dịch HCl 10%

Ete Etanol Giấy pH

3 Thực hành

Tách chiết protein cá:

Cân 100g cá đã xay nhuyễn trong một bercher rồi cho 4 lần nước (1 cá : 4 nước, g/l) Khuấy đều rồi cho từ từ NaOH 20% vừa cho vừa khuấy cho đến pH 11 thử bằng giấy pH, khuấy khoảng 45 phút rồi ly tâm, giữ lại dịch chiết trong một bercher 250ml, bã còn lại thêm nước chiết tiếp lần hai rồi ly tâm lấy dịch bỏ bã Dịch thu được cho vào bercher 250ml gộp chung với phần dịch chiết bên trên

Cho từ từ HCl 100% vào dịch chiết vừa cho vừa khuấy đến pH thích hợp là 6 sẽ thấy kết tủa, ly tâm 4000 vòng/phút trong 30 phút, rồi bỏ dịch thu tủa protein, rửa tủa với ete : ethanol với tỷ lệ 2:1, tủa protein sạch khi rửa tủa vài lần với ete : ethanol Cân lượng tủa protein thu được (mg tủa) để tính ra hiệu suất protein có trong 100g cá

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYM BROMELIN

(Xác định hoạt tính enzym Bromelin bằng phương pháp Anson cải tiến)

1 Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzym Bromelin có trong dịch nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzym và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch acid trichloracetic Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn của Tyrosin để tính lượng sản phẩm do enzym xúc tác tạo nên

2 Dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ

Ống nghiệm

Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml

Máy quang phổ

Becher 50ml, 250ml, 500ml

Bình tia

Hóa chất

Dung dịch Casein 1%

Dung dịch TCA 5%

Dung dịch NaOH 0,5N Thuốc thử Folin Dung dịch HCl 0,2N Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 mM/l trong dung dịch HCl 0,2N

3 Chuẩn bị đường chuẩn Tyrosin

Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin

Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Lượng Tyrosin tương ứng (µM) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Dung dịch HCl 0,2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0

Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10

Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3

Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm

Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN) Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN – ODTK)

4 Phương pháp tiến hành

Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thử thật, 3 ống thử không

Các bước chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm

Thử thật Thử không Dung dịch Casein 1% (ml) 5 5

Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10

Dung dịch enzym mẫu (ml) 1 1

Lắc đều và giữ ở 35,5 o C trong 20 phút

Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0

Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong

Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử thật và cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không

Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau

10 phút đo OD ở bước sóng 660nm Tính ΔOD = ODTT – ODTK, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra được số µM Tyrosin

5 Tính kết quả

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzym tối thiểu trong điều

kiện thí nghiệm (35,50C: pH 7,6 …) thủy phân Casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1µM Tyrosin trong đường chuẩn

*

*

*

v m t

L V Tyro M



Với: Hđ Protease : hoạt độ enzym protease (UI/g)

V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml)

v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)

t : thời gian thủy phân (phút)

m : khối lượng mẫu enzym đem đi xác định hoạt tính (g)

L: độ pha loãng enzym

µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH INVERTASE

I Nguyên tắc:

Invertase là một enzym thủy giải saccharose thành glucose và fructose

Trong bài này ta dùng enzym invertase trích trong men bia để cho thủy giải saccharose, từ đó tính được hoạt tính của enzym này

II Dụng cụ và thuốc thử

Dụng cụ

Becher 100ml – 250ml

Erlen 250ml

Ống nghiệm 50ml

Pipet 5ml – 10ml

Buret 25ml

Phễu lọc

Hóa chất

dung dịch saccharose 10%

dung dịch NaOH N/10 Dung dịch Iod N/10 Dung dịch H2SO4 N

Hồ tinh bột 1%

Dung dịch Na2S2O3 N/20

III Cách tiến hành

Điều chế dung dịch invertase: cân 0,5g men bia hòa tan trong 50ml nước cất Khuấy đều trong 5 phút Để lắng đem lọc lấy dịch lọc

Thực hiện ba ống nghiệm như sau:

ml dung dịch saccharose 10%

ml nước cất

ml enzym invertase

ml enzym invertase đã đun sôi

10 10

10 10

10

10

Để thủy giải trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Tiếp đó, đem tất cả các ống đun cách thủy trong 2 phút, làm lạnh dưới vòi nước

Hút 5 ml của hỗn hợp cho vào một erlen 250ml và định phân đường glucose như sau: cho thêm vào bình 10ml dung dịch Iod N/10 và 15 ml dung dịch NaOH N/10 Thời gian nhỏ NaOH phải kéo dài khoảng 2 phút (nhỏ từng giọt) Để yên trong bóng tối 15 -20 phút Lấy ra thêm vào 2ml dung dịch H2SO4 N Định phân lượng iod thêm còn thừa bằng dung dịch

Na2S2O3 N/20 (dùng hồ tinh bột cho thêm vào lúc cuối phản ứng để làm chất chỉ thị màu)

IV Kết quả

Hoạt tính của invertase được biểu thị bằng số mol saccharose thủy giải bởi lượng enzym invertase có trong 1g men bia trong 1 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm

Gọi V1 và V2 là số ml Na2S2O3 N/20 dùng định phân ống số 1 và số 2

Có nhận xét gì về kết quả định phân trong ống số 3?

Hoạt tính invertase được tính theo công thức sau:

phút g mol m t b a

B A V V

/ /

*

* 2

20 10

*

* ) (

3

2 1











a: thể tích lấy ra trong mỗi ống để định đường glucose (ml)

A: thể tích tổng cộng trong mỗi ống (ml)

b: thể tích dung dịch enzym cho vào mỗi ống (ml)

B: tổng thể tích dung dịch enzym có được từ mg – men (ml)

t: thời gian thủy giải tính bằng phút

XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYM ALPHA – AMYLASE

(THEO PHƯƠNG PHÁP SMITH & ROE)

I Nguyên tắc:

Hoạt tính α - amylase biểu thị khả năng của enzym amylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 500C và được thể hiện bằng số đơn vị của enzym trong 1g mẫu Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa được thủy phân hủy sẽ tạo phản ứng màu với iod và được so màu bằng máy so màu quang học ở bước sóng 620 nm

II Dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ

Bình định mức 50ml, 100ml, 250ml

Bếp ổn nhiệt

Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml

Becher 50ml, 100ml, 250ml

Máy quang phổ

Hóa chất

Cồn 960

Dung dịch tinh bột 1% trong đệm pH 5,6 Dung dịch HCl 1N

Dung dịch NaCl 3%

Thuốc thử Lugol

III Thực hành

1 Ly trích Amylase

Amylase là 1 tạp chất protein không tan trong rượu mạnh Cân 10g lúa nảy mầm cho vào cối với 30ml nước cất, giã nát lúa dưới nước Để yên trong 15 phút, đem lọc Lấy tất cả nước qua lọc, thêm 4 lần thể tích cồn 960 Khuấy đều, ta sẽ thấy amylase và các protein khác tủa dưới dạng nùi lớn

Để lắng, ly tâm lấy tủa Hòa tan tủa trong 20ml nước cất Ta có dung dịch amylase khá tinh sạch Đặc biệt dung dịch này không có chất đường khử (thử 1ml dung dịch thuốc thử Fehling, đun cách thủy 3 phút, ta không có kết tủa đỏ xuất hiện)

2 Khảo sát hoạt tính α-amylaseamylase

Lấy sáu ống nghiệm chia thành 2 lô, mỗi lô 3 ống nghiệm gồm thử thật và thử không để lấy trung bình

Tiến hành thí nghiệm theo bảng sau:

Dung dịch hóa chất Ống thử thật (t) Ống nghiệm Ống thử không (o)

Dịch chiết α - amylase 1 0

Dung dịch tinh bột 1% (ml) 1 1

Dung dịch NaCl 3% (ml) 0,5 0,5

Dung dịch HCl 1N (ml) 0 1

Đem ủ ở 50 0 C trong 30 phút

Dung dịch HCl 1N (ml) 1 0

Thuốc thử Lugol (ml) 0,5 0,5

Lắc đều hỗn hợp trong ống nghiệm rồi mang đi so màu ở bước sóng 620nm

IV Kết quả:

Hđ A= ( *)* * ( )

0

t OD

L C OD

OD  t

Với OD0: mật độ quang của ống thử không

ODt: mật độ quang của ống thử thật

C: lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (mg)

T: thời gian phản ứng (phút)

L: hệ số pha loãng mẫu enzym

XÁC ĐỊNH ĐẠM TỔNG SỐ THEO PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL

I Vô cơ hóa:

 Nguyên tắc: Sự vô cơ hóa chất đạm là sự biến đổi tất cả các chất đạm dù nằm dưới dạng

nào (hữu cơ, vô cơ, protein) thành hợp chất vô cơ là amonium sulfat (NH4)2SO4 bằng

 Thực hành: hút chính xác 1ml nếu là nguyên liệu lỏng hay cân chính xác 1g nếu là

nguyên liệu khô đã nghiền nhuyễn để cho đồng nhất, cho vào một bình cổ cao có dung tích từ 60ml đến 100ml (bình kjeldahl) Thêm vào đó 5ml H2SO4 đậm đặc và khoảng 0,5g chất xúc tác Đun sôi hỗn hợp trong tủ hút khí độc từ 2 đến 3 giờ cho đến khi dung dịch trở thành trong suốt và có màu xanh do trời nhạt Để nguội và pha loãng thành 100ml với nước

Chất xúc tác dùng ở đây là hỗn hợp đã xay nhuyễn của: K2SO4 và CuSO4 có tỷ lệ theo trọng lượng là 9: 1

Thực hiện 3 sự thử thật (có chất đạm) và 3 sự thử không có chất đạm (thay chất đạm bằng nước cất)

II Phương pháp kjeldahl:

dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac

Sau đó lượng amoniac được hơi nước nôi cuốn bằng một dụng cụ máy Parnas – Wargner

và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thừa H2SO4 Từ đây cho phép chúng

ta xác định được lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa là xác định được lượng đạm có trong mẫu nguyên liệu

 Dụng cụ và hóa chất:

Dụng cụ:

-amylase Máy cất đạm Parnas – Wargner

-amylase Bình kjeldahl

-amylase Bếp đun

-amylase Bình xịt nước cất

-amylase Becher 250 ml, 100ml, 50ml -amylase Erlen 250ml

-amylase Bình định mức 100ml, 50ml -amylase Buret 25ml

-amylase Pipet 1ml, 5ml, 10ml, 20ml.

Chất đạm (NH4)2SO4

H

2SO

4 đậm đặc Xúc tác, t0

(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH4OH + Na2SO4

-amylase ống đong 25ml

Hóa chất:

-amylase Dung dịch NaOH đậm đặc (10N)

-amylase Dung dịch H2SO4 N/100

-amylase Dung dịch NaOH N/100 (dung dịch

này sau khi pha xong dùng ngày thì

đúng nồng độ, nhưng để lâu sẽ bị carbonat hóa nên nồng độ không còn đúng như ban đầu, vì thế phải xác

định lại hệ số chỉnh lý x bằng cách

định phân nó với dung dịch acid chuẩn (acid oxalic, acid phtalic…)

-amylase Dung dịch đỏ metil 0,5% pha trong

rượu etylic

 Cách thực hành:

Đun sôi bình nước máy Parnas – Wargner Đặt erlen có chứa 25ml H2SO4N/100 và vài giọt đỏ metil vào phần đuôi của máy sao cho phần nhọn nhúng chìm vào dung dịch Hút 10ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng thành 100ml, đem đổ vào máy Parnas – Wargner; thêm vào đó 10ml NaOH đậm đặc ( ghi nhó là khi cho mẫu cũng như NaOH đậm đặc vào máy, phải cho xuống từ từ bằng kẹp Mohr, nếu cho chảy xuống quá nhanh thì dung dịch sẽ

bị máy hút ra ngoài) Tiếp tục đun sôi bình nước và để cho hơi nước lôi cuốn amoniac sang erlen trong 3 phút, hạ erlen xuống và tiếp tục đun thêm 2 phút nữa, tráng vòi của máy bằng một tia nước cất, tất cả đều cho chảy vào erlen đựng H2SO4 N/100 Lấy erlen ra và định phân

H2SO4 thừa bằng dung dịch NaOH có chuẩn độ là x N/100 cho đều Khi dung dịch đổi màu (từ màu hồng nhạt sang màu da cam): thực hiện 3 sự thử thuật và 3 sự thử không để lấy trị số trung bình

 Cách tính:

Nếu nguyên liệu là chất lỏng, thông thường lượng đạm được tính bằng số gam đạm trong

1 lít, nếu nguyên liệu là chất rắn, thì trước hết phải tính độ ẩm, sau đó lượng đạm đươc tính bằng phần trăm (số gam đạm có trong 100g nguyên chất liệu) theo độ khô tuyệt đối)

Giả sử nguyên liệu là chất lỏng Lấy 1ml nguyên liệu đem vô cơ hóa và pha loãng thành 100ml, sau đó hút 10ml đem chưng cất bằng máy Parnas – Wargner

Gọi V0 là thể tích dung dịch NaOH x N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử không)

Gọi Vt thể tích dụng dịch NaOH x N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử thật)

Vậy:

t V V

là lượng NaOH tương đương với lượng amoniac phóng thích bởi 10ml dung dịch vô cơ hóa

đã pha loãng

1mol amoniac tương đương với 1mol NaOH

Do đó số mol amoniac phóng thích bởi 10ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng là:

mol Vx

mol Vx

1000

) 100 / 1









Số gam đạm có trong 10ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng là:

g x

V 10 5

.



Số gam đạm có trong 1000gl dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng hay trong 1ml nguyên liệu

g Vx

10

14 10

100 10







Số gam đạm có trong 1 lít nguyên liệu:

lít xg V lít

g x

.





MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH CHẤT ĐƯỜNG

I Phản ứng màu tổng quát (phản ứng Molish)

Tất cả các chất đường đều cho màu tím đối với dung dịch α – Naphthol trong H2SO4

đậm đặc Đổ trong ống nghiệm 1 ml dung dịch đường 1% và 2 giọt dung dịch α – Naphthol 15% trong rượu Lắc đều, nghiêng ống và cho H2SO4 đậm đặc từ từ theo thành ống Có sự tạo thành một lớp màu tím hiện ra ở mặt ngăn cách 2 chất lỏng