Thí nghiệm hóa sinh và thực hành MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN (Tải: https://link1s.com/yHqvN)

KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN I Phương pháp tủa tác nhân gây tủa dung môi hữu (Ethanol 80%, Aceton) Độ hòa tan protein dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, số số điện mơi dung dịch Nhìn chung, phân tử dung mơi có số điện mơi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) ổn định tương tác chúng với phân tử protein tạo điều kiện thuận lợi cho hòa tan protein dung dịch Ngược lại, dung môi với số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản phân tán phân tử protein môi trường Do đó, độ hịa tan phân tử protein giảm xảy kết tủa làm giảm số điện môi hữu môi trường Điều có cách thêm dung mơi hòa tan nước aceton vào dung dịch chứa protein Sự tủa aceton ethanol 80% có nhiều thuận lợi tương đối rẻ, có sẵn dạng tinh khiết với chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế enzym, nhiệt độ bay dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym phương pháp sấy nhẹ quạt gió II Phương pháp tủa muối Người ta dùng muối (NH4)2SO4, NaCl… để tủa protein muối vừa làm trung hịa điện (do ion tác động tương hỗ với nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat phân tử protein Các protein khác bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, dùng muối để tách riêng protein khỏi hỗn hợp chúng Phần thí nghiệm Dụng cụ hóa chất Dụng cụ Hóa chất Pipet 5ml, 10ml Nguyên liệu thơm (dứa) Becher 50ml, 100ml, 250ml Etanol 96% Bình tia Muối (NH4)2SO4 Máy ly tâm Thực hành Cân khoảng 80g đến 100g thơm, giã nát vắt lấy nước ly tâm 6000 vòng/phút 15 phút đong xem thể tích nước thơm bao nhiêu, ghi nhận thể tích V Sau chia đơi thể tích V nước thơm vùa thu thành hai phần tiến hành tủa protein bắng hai tác nhân tủa khác nhau: Ethanol 80% muối (NH4)2SO4 KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH Quy trình kết tủa enzym Bromelin cồn 80% Chồi ngọn, vỏ Làm Nghiền ép, xay nhuyễn Lọc Ly tâm 6000 v/p, 15 phút cồn 80%, làm lạnh 40C Bã Bã Dịch Tủa cồn 4oC / Ly tâm 6000 v/p, 20 phút Thu tủa Bỏ dịch Sấy khô Bromelin Lưu ý: Phối trộn cồn với dịch dứa theo tỉ lệ 4:1 (1 dứa : cồn) KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH Quy trình thu nhận enzym Bromelin muối (NH4)2SO4 Chồi ngọn, vỏ Làm Nghiền ép, xay nhuyễn Lọc Ly tâm 6000 v/p, 15 – 20phút Ammonium sulfate 70% bão hòa Bã Bã Dịch Hỗn hợp dịch dứa, để nhiệt độ phòng 30 phút Ly tâm 6000 v/p, 15 phút Thu tủa Bỏ dịch Sấy khơ Bromelin Lưu ý: Để có muối(NH4)2SO4 bão hịa 70% ta phối trộn với tỷ lệ 47,2g muối 100ml nước thơm KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH Kết quả: Hãy tính hàm lượng protein có 100g nguyên liệu ban đầu III Phương pháp tủa protein điểm đẳng điện Nguyên tắc Giá trị pH mà phân tử protein trung hòa điện gọi điểm đẳng điện protein (pI), giá trị pH = pI phân tử protein trung hịa điện khơng chuyển dịch điện trường, phân tử protein bền dễ kết tủa Người ta lợi dụng tính chất để kết tủa protein Dụng cụ hóa chất Dụng cụ Hóa chất Máy khuất từ Dung dịch NaOH 20% Máy ly tâm Dung dịch HCl 10% Cân phân tích Ete Bercher 100ml, 250ml Etanol Pipet 5ml, 10ml Giấy pH Thực hành Tách chiết protein cá: Cân 100g cá xay nhuyễn bercher cho lần nước (1 cá : nước, g/l) Khuấy cho từ từ NaOH 20% vừa cho vừa khuấy pH 11 thử giấy pH, khuấy khoảng 45 phút ly tâm, giữ lại dịch chiết bercher 250ml, bã lại thêm nước chiết tiếp lần hai ly tâm lấy dịch bỏ bã Dịch thu cho vào bercher 250ml gộp chung với phần dịch chiết bên Cho từ từ HCl 100% vào dịch chiết vừa cho vừa khuấy đến pH thích hợp thấy kết tủa, ly tâm 4000 vòng/phút 30 phút, bỏ dịch thu tủa protein, rửa tủa với ete : ethanol với tỷ lệ 2:1, tủa protein rửa tủa vài lần với ete : ethanol Cân lượng tủa protein thu (mg tủa) để tính hiệu suất protein có 100g cá KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYM BROMELIN (Xác định hoạt tính enzym Bromelin phương pháp Anson cải tiến) Nguyên tắc Phương pháp dựa thủy phân protein casein enzym Bromelin có dịch nghiên cứu, tiếp làm vô hoạt enzym kết tủa protein chưa bị thủy phân dung dịch acid trichloracetic Định lượng sản phẩm tạo thành phản ứng thủy phân phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn Tyrosin để tính lượng sản phẩm enzym xúc tác tạo nên Dụng cụ hóa chất Dụng cụ Hóa chất Ống nghiệm Dung dịch Casein 1% Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml Dung dịch TCA 5% Máy quang phổ Dung dịch NaOH 0,5N Becher 50ml, 250ml, 500ml Thuốc thử Folin Bình tia Dung dịch HCl 0,2N Dung dịch Tyrosin chuẩn mM/l dung dịch HCl 0,2N Chuẩn bị đường chuẩn Tyrosin Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0,2 0,4 0,6 Lượng Tyrosin tương ứng (µM) 0,2 0,4 0,6 Dung dịch HCl 0,2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 Thuốc thử Folin (ml) 3 3 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD bước sóng 660nm 0,8 0,8 4,2 10 1,0 1,0 4,0 10 Ống số ống thử không (TK), ống cịn lại ống thí nghiệm (TN) Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan lượng Tyrosin (µM) ΔOD (ΔOD = ODTN – ODTK) KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH Phương pháp tiến hành Lấy ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm ống thử thật, ống thử không Các bước chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính Ống nghiệm Thử thật Thử không Dung dịch Casein 1% (ml) 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 10 Dung dịch enzym mẫu (ml) 1 o Lắc giữ 35,5 C 20 phút Dung dịch TCA 5% (ml) 10 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch Dung dịch hóa chất Lấy ống nghiệm khác, cho vào ống thứ 5ml dịch lọc ống thử thật cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không Tiếp tục thêm vào ống 10ml NaOH 0,5N 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD bước sóng 660nm Tính ΔOD = OD TT – ODTK, sau dựa vào đồ thị chuẩn suy số µM Tyrosin Tính kết Định nghĩa đơn vị Anson: đơn vị Anson lượng enzym tối thiểu điều kiện thí nghiệm (35,50C: pH 7,6 …) thủy phân Casein phút tạo thành sản phẩm hòa tan TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD bước sóng 660nm tương ứng với 1µM Tyrosin đường chuẩn µM Tyro sin* V * L (UI ) Hđ Protease = t *m *v Với: Hđ Protease : hoạt độ enzym protease (UI/g) V : tổng thể tích hỗn hợp ống thử thật ống thử khơng (ml) v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) t : thời gian thủy phân (phút) m : khối lượng mẫu enzym đem xác định hoạt tính (g) L: độ pha lỗng enzym µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin v (ml) suy từ đường chuẩn KHẢO SÁT HOẠT TÍNH INVERTASE KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH I Nguyên tắc: Invertase enzym thủy giải saccharose thành glucose fructose Trong ta dùng enzym invertase trích men bia thủy giải saccharose, từ tính hoạt tính enzym II Dụng cụ thuốc thử Dụng cụ Hóa chất Becher 100ml – 250ml dung dịch saccharose 10% Erlen 250ml dung dịch NaOH N/10 Ống nghiệm 50ml Dung dịch Iod N/10 Pipet 5ml – 10ml Dung dịch H2SO4 N Buret 25ml Hồ tinh bột 1% Phễu lọc Dung dịch Na2S2O3 N/20 III Cách tiến hành Điều chế dung dịch invertase: cân 0,5g men bia hòa tan 50ml nước cất Khuấy phút Để lắng đem lọc lấy dịch lọc Thực ba ống nghiệm sau: Số ống ml dung dịch saccharose 10% ml nước cất ml enzym invertase ml enzym invertase đun sôi 10 10 10 10 10 10 Để thủy giải 30 phút nhiệt độ phịng Tiếp đó, đem tất ống đun cách thủy phút, làm lạnh vòi nước Hút ml hỗn hợp cho vào erlen 250ml định phân đường glucose sau: cho thêm vào bình 10ml dung dịch Iod N/10 15 ml dung dịch NaOH N/10 Thời gian nhỏ NaOH phải kéo dài khoảng phút (nhỏ giọt) Để yên bóng tối 15 -20 phút Lấy thêm vào 2ml dung dịch H2SO4 N Định phân lượng iod thêm thừa dung dịch Na2S2O3 N/20 (dùng hồ tinh bột cho thêm vào lúc cuối phản ứng để làm chất thị màu) IV Kết KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH Hoạt tính invertase biểu thị số mol saccharose thủy giải lượng enzym invertase có 1g men bia phút nhiệt độ phịng thí nghiệm Gọi V1 V2 số ml Na2S2O3 N/20 dùng định phân ống số số Có nhận xét kết định phân ống số 3? Hoạt tính invertase tính theo công thức sau: (V1 − V2 ) * A * B mol / g / phút 10 ∗ 20 ∗ ∗ a ∗ b * t * m a: thể tích lấy ống để định đường glucose (ml) A: thể tích tổng cộng ống (ml) b: thể tích dung dịch enzym cho vào ống (ml) B: tổng thể tích dung dịch enzym có từ mg – men (ml) t: thời gian thủy giải tính phút XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYM ALPHA – AMYLASE KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH (THEO PHƯƠNG PHÁP SMITH & ROE) I Nguyên tắc: Hoạt tính α - amylase biểu thị khả enzym amylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột đến dextrin phút 50 0C thể số đơn vị enzym 1g mẫu Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột lại chưa thủy phân hủy tạo phản ứng màu với iod so màu máy so màu quang học bước sóng 620 nm II Dụng cụ hóa chất Dụng cụ Hóa chất Bình định mức 50ml, 100ml, 250ml Cồn 960 Bếp ổn nhiệt Dung dịch tinh bột 1% đệm pH 5,6 Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml Dung dịch HCl 1N Becher 50ml, 100ml, 250ml Dung dịch NaCl 3% Máy quang phổ Thuốc thử Lugol III Thực hành Ly trích Amylase Amylase tạp chất protein không tan rượu mạnh Cân 10g lúa nảy mầm cho vào cối với 30ml nước cất, giã nát lúa nước Để yên 15 phút, đem lọc Lấy tất nước qua lọc, thêm lần thể tích cồn 96 Khuấy đều, ta thấy amylase protein khác tủa dạng nùi lớn Để lắng, ly tâm lấy tủa Hòa tan tủa 20ml nước cất Ta có dung dịch amylase tinh Đặc biệt dung dịch khơng có chất đường khử (thử 1ml dung dịch thuốc thử Fehling, đun cách thủy phút, ta khơng có kết tủa đỏ xuất hiện) Khảo sát hoạt tính α-amylase KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH Lấy sáu ống nghiệm chia thành lô, lô ống nghiệm gồm thử thật thử không để lấy trung bình Tiến hành thí nghiệm theo bảng sau: Ống nghiệm Ống thử thật (t) Ống thử không (o) Nước cất (ml) Dịch chiết α - amylase Dung dịch đệm (ml) 1 Dung dịch tinh bột 1% (ml) 1 Dung dịch NaCl 3% (ml) 0,5 0,5 Dung dịch HCl 1N (ml) Đem ủ 50 C 30 phút Dung dịch HCl 1N (ml) Nước cất (ml) 5,5 5,5 Thuốc thử Lugol (ml) 0,5 0,5 Dung dịch hóa chất Lắc hỗn hợp ống nghiệm mang so màu bước sóng 620nm IV Kết quả: (OD0 − ODt ) * C * L (UI ) Hđ A= OD0 * t Với OD0: mật độ quang ống thử không ODt: mật độ quang ống thử thật C: lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (mg) T: thời gian phản ứng (phút) L: hệ số pha loãng mẫu enzym XÁC ĐỊNH ĐẠM TỔNG SỐ THEO PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL I Vơ hóa: 10 KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH • Ngun tắc: Sự vơ hóa chất đạm biến đổi tất chất đạm dù nằm dạng (hữu cơ, vô cơ, protein) thành hợp chất vô amonium sulfat (NH 4)2SO4 cách đun sôi với H2SO4 đậm đặc chất xúc tác H2SO4 đậm đặc Chất đạm Xúc tác, t0 (NH4)2SO4 • Thực hành: hút xác 1ml nguyên liệu lỏng hay cân xác 1g nguyên liệu khô nghiền nhuyễn đồng nhất, cho vào bình cổ cao có dung tích từ 60ml đến 100ml (bình kjeldahl) Thêm vào 5ml H 2SO4 đậm đặc khoảng 0,5g chất xúc tác Đun sôi hỗn hợp tủ hút khí độc từ đến dung dịch trở thành suốt có màu xanh trời nhạt Để nguội pha loãng thành 100ml với nước Chất xúc tác dùng hỗn hợp xay nhuyễn của: K 2SO4 CuSO4 có tỷ lệ theo trọng lượng 9: Thực thử thật (có chất đạm) thử khơng có chất đạm (thay chất đạm nước cất) II Phương pháp kjeldahl: • Ngun tắc: Chất đạm vơ hóa nằm dạng Amonium sulfat đem cho tác dụng với chất kiềm mạnh NaOH phóng thích amoniac (NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH4OH + Na2SO4 Sau lượng amoniac nước nôi dụng cụ máy Parnas – Wargner dẫn đến bình tam giác có chứa lượng thừa H 2SO4 Từ cho phép xác định lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa xác định lượng đạm có mẫu ngun liệu • Dụng cụ hóa chất: - Dụng cụ: Máy cất đạm Parnas – Wargner - Bình kjeldahl Bếp đun 11 KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG - - THÍ NGHIỆM HĨA SINH Bình xịt nước cất Becher 250 ml, 100ml, 50ml Erlen 250ml Bình định mức 100ml, 50ml Buret 25ml Pipet 1ml, 5ml, 10ml, 20ml ống đong 25ml - Hóa chất: Dung dịch NaOH đậm đặc (10N) - Dung dịch H2SO4 N/100 Dung dịch NaOH N/100 (dung dịch sau pha xong dùng ngày nồng độ, để lâu bị carbonat hóa nên nồng độ khơng cịn ban đầu, phải xác định lại hệ số chỉnh lý x cách định phân với dung dịch acid chuẩn (acid oxalic, acid phtalic…) Dung dịch đỏ metil 0,5% pha rượu etylic • Cách thực hành: Đun sơi bình nước máy Parnas – Wargner Đặt erlen có chứa 25ml H 2SO4N/100 vài giọt đỏ metil vào phần đuôi máy cho phần nhọn nhúng chìm vào dung dịch Hút 10ml dung dịch vơ hóa pha lỗng thành 100ml, đem đổ vào máy Parnas – Wargner; thêm vào 10ml NaOH đậm đặc ( ghi nhó cho mẫu NaOH đậm đặc vào máy, phải cho xuống từ từ kẹp Mohr, cho chảy xuống nhanh dung dịch bị máy hút ngoài) Tiếp tục đun sơi bình nước nước lơi amoniac sang erlen phút, hạ erlen xuống tiếp tục đun thêm phút nữa, tráng vòi máy tia nước cất, tất cho chảy vào erlen đựng H 2SO4 N/100 Lấy erlen định phân H2SO4 thừa dung dịch NaOH có chuẩn độ x N/100 cho Khi dung dịch đổi màu (từ màu hồng nhạt sang màu da cam): thực thử thuật thử khơng để lấy trị số trung bình • Cách tính: Nếu nguyên liệu chất lỏng, thông thường lượng đạm tính số gam đạm lít, ngun liệu chất rắn, trước hết phải tính độ ẩm, sau lượng đạm đươc tính phần trăm (số gam đạm có 100g nguyên chất liệu) theo độ khô tuyệt đối) Giả sử nguyên liệu chất lỏng Lấy 1ml ngun liệu đem vơ hóa pha lỗng thành 100ml, sau hút 10ml đem chưng cất máy Parnas – Wargner Gọi V0 thể tích dung dịch NaOH x N/100 (trị số trung bình lần thử khơng) Gọi Vt thể tích dụng dịch NaOH x N/100 (trị số trung bình lần thử thật) Vậy: ∆V = V0 − Vt 12 KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH lượng NaOH tương đương với lượng amoniac phóng thích 10ml dung dịch vơ hóa pha loãng 1mol amoniac tương đương với 1mol NaOH Do số mol amoniac phóng thích 10ml dung dịch vơ hóa pha lỗng là: CM = ∆Vx(1 / 100) mol = ∆Vx10 −5 mol 1000 Số gam đạm có 10ml dung dịch vơ hóa pha loãng là: 14.∆V x.10 −5 g Số gam đạm có 1000gl dung dịch vơ hóa pha loãng hay 1ml nguyên liệu 14.∆Vx.10 −5.100 = 14.∆Vx10 − g 10 Số gam đạm có lít nguyên liệu: 14.∆V x.10 −4 1000 g / lít = 1,4.∆V xg / lít MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH CHẤT ĐƯỜNG 13 KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH I Phản ứng màu tổng quát (phản ứng Molish) Tất chất đường cho màu tím dung dịch α – Naphthol H2SO4 đậm đặc Đổ ống nghiệm ml dung dịch đường 1% giọt dung dịch α – Naphthol 15% rượu Lắc đều, nghiêng ống cho H 2SO4 đậm đặc từ từ theo thành ống Có tạo thành lớp màu tím mặt ngăn cách chất lỏng II Phân biệt monosaccharid disaccharid (phản ứng Barfoed) Khả khử monosaccharid lớn nhiều khả khử disaccharid cho nên, thay sử khử môi trường base, khử môi trường acid yếu giúp ta phân biệt monosaccharid disaccharid Trong ống nghiệm đựng 2ml thuốc thử Barfoed, ta thêm vào 1ml dung dịch đường muốn khảo sát Ta thực đồng thời ba thử chứng với dung dịch glucose 1% , lactose 1% nước cất Đun sôi cách thủy phút Làm lạnh, quan sát ống có trầm đỏ Đun tiếp tục phút, quan sát ống có trầm đỏ Giải thích tượng III Phản ứng với thuốc khử Fehling Thuốc khử dung dịch CuSO4 với dung dịch soude đậm đặc tartrat kép natrium kalium Tác dụng dung dịch soude đậm đặc lên CuSO cho hydroxyd đồng (CuO, H2O) tan dung dịch nhờ diện tartrat Trong ống nghiệm, đổ 1ml thuốc thử Fehling 1ml dung dịch glucose Đun sôi cách thủy phút có trầm đỏ gạch Cu 2O nhờ khử đồng nhị thành đồng glucose KHẢO SÁT LIPID 14 KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH I Khảo sát tính hịa tan lipid Ngun tắc: Lipid khơng hịa tan nước có sức căng bề mặt cao Nếu dùng lực học tác động vào hỗn hợp lipid nước chúng phân tán thành hạt nhỏ, ngưng tác dụng chúng lại phân thành lớp: lipid nước Nếu ta thêm vào hỗn hợp chất muối kiềm, xà phòng, mật có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt hạt lipid việc trở lại hai lớp khó dung dịch lúc có màu trắng đục sữa (nhũ tương), lipid dạng hạt nhỏ liti micell tượng nhũ hóa mỡ Nếu thay nước dung mơi hữu cơ: acetone, ether, chloroform, benzen lipid hịa tan vào dung mơi nói Hóa chất Dầu thực vật hay mỡ động vật Dung môi hữu cơ: alcohol, acetone, bezen Cách làm Cho vào ba ống nghiệm: Ống 1: 2ml alcohol Ống 2: 2ml acetone Ống 3: 2ml benzen Nhỏ thêm vào ống giọt dầu mỡ, lắc nhẹ, quan sát hịa tan lipid ba dung mơi hữu II Khảo sát số số đặc trưng chất béo Chỉ số acid: Là số mg KOH dùng trung hòa acid béo tự 1g chất béo Nguyên tắc Dùng KOH 0,1N rượu để trung hòa chất béo tự 1g nguyên liệu, chất thị màu phenolphtalein Dụng cụ hóa chất Dụng cụ Hóa chất Erlen 100ml KOH 0,1N Pipet 10ml Ether ethylic Becher 100ml Phenolphtalein 0,5% alcohol Bình tia Dầu để khảo sát Cách làm 15 KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH Cân 1g (1ml) chất béo cho vào erlen, thêm 10ml ether ethylic, lắc cho tan chất béo Cho giọt phenolphtalein chuẩn độ KOH 0.1N xuất màu hồng bền 30 giây Tính tốn kết quả: Chỉ số acid = 5.61 * V/m 5,61 số mg KOH tương ứng 1ml KOH 0.1N V số ml KOH m trọng lượng lipid cân (gram) Chỉ số savon Là số mg KOH cần thiết để savon hóa ester chứa 1g chất béo Nguyên tắc: Cho nguyên liệu kết hợp với lượng thừa KOH để savon hóa chất béo Định lượng KOH thừa HCl giúp suy số savon Dụng cụ hóa chất: Dụng cụ Hóa chất Erlen KOH 0.5N rượu Pipet 10ml HCl 0.5N Becher 100ml Ethanol tuyệt đối Bộ chưng cất hoàn lưu Phenolphtalein 0,5% alcohol Chất béo để khảo sát Cách làm: Cân xác 500mg chất béo cho vào erlen, thêm 10ml KOH 0.5N Đun sơi hồn lưu 45’, định phân KOH HCl 0.5N với chất thị màu phenolphtalein Thực bình đối chứng thay 500mg chất béo 500mg nước Tính tốn kết quả: Chỉ số savon = 28.05 * (V0 – V1)/m 28.05 số mg KOH tương ứng 1ml HCl 0.5N V0 thể tích dung dịch HCl 0.5N bình đối chứng V1 thể tích dung dịch HCl 0.5N bình thí nghiệm m trọng lượng chất béo cân (gram) ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C 16 KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH (Phương pháp định lượng vitamin C IOD) Nguyên tắc Để xác định nhanh chóng hàm lượng vitamin C nguyên liệu có chất màu người ta thường dùng phương pháp chuẩn độ iod Tất acid ascorbic bị oxi hóa iod Phần iod thừa cho màu xanh với dung dịch tinh bột Điều nói lên phản ứng kết thúc Dụng cụ hóa chất Dụng cụ Hóa chất - Erlen 100ml - Dung dịch HCl 5% - Pipet 5ml, 10ml - Dung dịch Na2S2O3 0,01N - Buret - Dung dịch tinh bột 1% - Bình định mức 50ml - Dung dịch iod 0,01N - Becher - Cối chày sứ - Phễu thủy tinh Cách thực hành a Chuẩn bị mẫu vật: Cân N (g) mẫu vật nghiền nhanh chóng cối sứ với 5ml HCl 5% Vitamin C dễ bị oxi hóa khơng khí có diện ion kim loại (Fe, Cu) Vì chuẩn bị mẫu phải cắt nghiền dao không rỉ làm nhanh Dịch chiết thu cho vào bình định mức 50ml thêm nước cất (rửa cối chày bã vài lần nước cất đổ vào bình), khuấy lọc b Định phân: - Định chuẩn lại dung dịch iod N/100 với dung dịch Na 2S2O3 0,01N để tính hệ số hiệu chỉnh T dung dịch iod - Chuẩn bị hai erlen Hút vào bình 20ml dịch chiết có chứa vitamin C, -10 giọt dung dịch hồ tinh bột 1% chuẩn độ dung dịch iod 0,01N đến có màu xanh Kết 17 KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH Số mg vitamin C 1g mẫu vật tính sau: x% = 0,00088.a.T V 100 v.N a: thể tích (ml) dung dịch iod 0,01N dùng chuẩn độ T: hệ số hiệu chỉnh dung dịch iod 0,01N với dung dịch Na 2S2O3 0,01N V: thể tích chung dịch chiết (50ml) v: thể tích dịch chiết lấy để chuẩn độ (20ml) N: trọng lượng mẫu phân tích 0,00088: số gram vitamin C tương ứng với 1ml dung dịch iod 0,01N 18 ... rửa tủa với ete : ethanol với tỷ lệ 2:1, tủa protein rửa tủa vài lần với ete : ethanol Cân lượng tủa protein thu (mg tủa) để tính hiệu suất protein có 100g cá KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM... Ống số ống thử khơng (TK), ống cịn lại ống thí nghiệm (TN) Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan lượng Tyrosin (µM) ΔOD (ΔOD = ODTN – ODTK) KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH Phương pháp. .. phản ứng (phút) L: hệ số pha loãng mẫu enzym XÁC ĐỊNH ĐẠM TỔNG SỐ THEO PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL I Vơ hóa: 10 KHOA CN SINH HỌC – MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH • Ngun tắc: Sự vơ hóa chất đạm biến đổi