T ng quan về Enzyme Pectin Methylesterase
T ng quan
Enzyme pectinase là nhóm enzyme thủy phân chất pectic có trong thực vật, bao gồm polygalacturonases, pectinlyase và pectin methylesterase Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và hoa quả Enzyme pectinase được ứng dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả Việc kiểm soát hoạt động của enzyme cũng có thể điều chỉnh độ nhuyễn của sản phẩm, giúp enzyme pectinase trở thành một trong những nhóm enzyme được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm, chỉ sau enzyme amylase và protease.
Enzyme pectin methylesterase (PME, EC 3.1.1.11), còn được gọi là pectinesterase (PE), thuộc nhóm pectinase và có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân liên kết methyl ester của pectin Quá trình này giải phóng methanol và tạo thành pectin với độ methoxyl thấp, dẫn đến hình thành các acid peptinic hoặc các acid peptic Enzyme này đặc biệt hiệu suất trong việc phân giải pectin, có thể đạt tới 98% (Nguyễn Đắc Lộc và cộng sự, 2010).
Pectinase là enzyme được tìm thấy trong thực vật, vi khuẩn và nấm Các PME trong thực vật và vi khuẩn hoạt động hiệu quả ở pH 6 - 8, trong khi PME sản xuất từ nấm có pH tối ưu từ 4 – 6 Enzyme pectinase thường được sản xuất từ các chủng vi sinh an toàn.
Aspergillus sp Chúng đ ̣c sử d ng rộng rãi trong ngành ch bi n đ úng n ̣́c trái cây(Samantha Lemke Gonzalez, Neiva Deliberali Rosso, 2011)
PME có kích thước trung bình với phân tử khối từ 25 ÷ 54 kDa và được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, có điểm đẳng điện (pI) không giống nhau Điểm đẳng điện của PME thay đổi từ 3,1 cho đến khoảng 11, tùy thuộc vào nguồn gốc, như trong trường hợp PME ly trích từ cà chua Hầu hết PME chiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm, trong khi PME có pI mang tính acid ít gặp hơn (Marianne Bordenave, 1996).
Cấu trúc không gian ba chiều của PME (Fabienne Micheli, 2001) cho thấy rằng đặc điểm của pectinatease trong cà chua có sự hiện diện của hai loại PE, là PE1 và PE2 Trong giai đoạn đầu của quá trình chín, cả hai enzyme này đều tăng lên Tuy nhiên, khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm, trong khi PE2 tích lũy dần cho đến khi trái chín có màu sắc đặc trưng PE2 có khối lượng phân tử 23kD và pH tối ưu là 7,6 Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67 độ C Ngoài ra, các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme ở nồng độ 0,005M và 0,05M.
PE trong quả cam bao gồm hai loại isoenzyme: PE1 và PE2, với khối lượng phân tử 36kD Hai loại này có điểm đẳng điện khác nhau, lần lượt là 10,05 và lớn hơn hoặc bằng 11,0 pH tối ưu của PE1 là 7,6, trong khi pH tối ưu của PE2 là 8,0.
Enzyme từ vi sinh ṿt: t t c các enzyme vi sinh ṿt không ph i là protein kiềm PE c a Aspergillus có điểm đẳng đi n và pH t ́i u n m trong kho ng acid.
Hoạt động của enzyme PE sinh ra từ A niger đạt tối đa ở pH 4,5 và 40 độ C Các PE acid và kiềm có khả năng methyl hóa pectin theo cùng một kiểu PE kiềm tạo ra các pectin được ester hóa, có khả năng tạo gel với ion calcium, trong khi PE acid sản xuất pectin bề ester hóa có khả năng tạo gel mạnh với ion calcium (Nguyễn Đắc Lộc và cộng sự, 2010).
Vách tế bào thực vật có cấu trúc phức tạp, quyết định kích thước và hình dạng của tế bào, ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển của chúng Thành phần chính của vách tế bào bao gồm các polysaccharides như cellulose, hemicelluloses và pectin, trong đó pectin chiếm khoảng 35% trọng lượng khô của thành tế bào (Fabienne Micheli, 2001).
GVHD là một yếu tố quan trọng trong quá trình sinh học, đóng vai trò kết nối các tế bào với nhau Khi xuất hiện nấm mốc, hàm lượng pectin cao trong nấm mốc có thể gây ảnh hưởng lớn đến quá trình sản xuất Việc bổ sung enzyme vào khối thạch nghiền giúp tăng hiệu suất thu hồi dịch qu Hơn nữa, sự phân hủy một phần tế bào bởi enzyme tạo thuận lợi cho việc tách chiết các chất màu và chất thơm, góp phần cải thiện chất lượng của dịch qu.
Enzyme pectin methylesterase xúc tác quá trình phân cắt các nhóm methyl ester trong pectin Enzyme này tác động lên các nhóm ester methyl của galacturonate, dẫn đến sự phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) thành các nhóm –COOH, tạo ra acid pectinic hoặc acid pectic và methanol.
Pectinesterase th ng đ ̣c ho t hóa b i các ion Ca và Mg
Hình 1.2: Phản ứng thủy phân c ủa PME (Fabienne Micheli, 2001)
Các nghiên cu đ́i v́i PME cũng cho th y ph n ng PME thuộc tr ng ḥp đ n gi n nh t ch có m ột c ch t theo ph ng tr̀nh:
E: enzyme, S: c ch t, P: s n phẩm k 1 , k -1 : là h ng ś t́c độ ph n ng t o thƠnh c ch t ES và phân ly ph c ch t
ES thành E và S. k 2 : h ng ś t́c độ ph n ng t o thành E và P
PME được sử dụng trong lĩnh vực sản xuất công nghiệp rượu vang và nước trái cây từ năm 1930 Các sản phẩm pectinase hiện nay chiếm khoảng 25% lượng enzyme ngừng dùng trong thực phẩm của thế giới PME được sản xuất nhiều và đóng vai trò quan trọng trong quá trình chế biến thực phẩm.
GVHD: Trang 5 nh t từ các ngu n n m (Aspergillus niger ) vƠ đ ̣c ng d ng nhiều trong công nghi p tḥc phẩm (Pooja Kohli và c ộng ṣ, 2015).
Trong sản xuất rượu vang, nước quả, việc tăng hiệu suất trích ly có thể đạt được bằng cách phá vỡ cấu trúc của pectin, giúp giảm độ nhớt của các loại nước ép trái cây và nâng cao hiệu quả lọc và ly tâm Để giảm pectin, PME được sử dụng kết hợp với các loại pectinase khác như polygalacturonases và pectinlyase Trong một số trường hợp, pectinase được kết hợp với cellulase và hemicellulases để phá vỡ hoàn toàn thành tế bào thực vật.
Công nghệ bảo quản rau quả hiện đại bao gồm các quy trình như nhúng, làm lạnh, khử nấm, thanh trùng và tiệt trùng dưới áp dụng để bảo quản trái cây và rau củ Tuy nhiên, những phương pháp này có thể ảnh hưởng đến chất lượng của rau quả Một giải pháp thay thế hiệu quả là sử dụng PME và CaCl2 để cải thiện chất lượng rau quả trong quá trình bảo quản.
Methyl hóa pectin trong mô thực vật chịu ảnh hưởng của enzyme PME và ion canxi (Ca2+) Sự hiện diện của ion Ca2+ giúp pectin khử ester, tạo thành gel và làm cho thành tế bào trở nên cứng chắc hơn Ngược lại, khi thiếu Ca2+, các enzyme polygalacturonases và pectinlyase sẽ hoạt động, phân hủy cấu trúc polymer của pectin, dẫn đến tình trạng rau quả trở nên mềm hơn (Trần Thanh Trúc, 2013).
Trong sản xuất cà phê, pectinase được sử dụng để tách lớp keo trên bề mặt hạt cà phê, thay thế cho vi sinh vật trước đây do quá trình diễn ra không đồng đều và khó kiểm soát Ngoài ra, vỏ cà phê là một phụ phẩm không thể tránh khỏi trong quá trình sản xuất, chứa nhiều hợp chất khó phân hủy tự nhiên Việc ứng dụng hai chủng nấm mốc Trichoderma viride giúp cải thiện hiệu quả xử lý các phụ phẩm này.
ng d ng
PME đã được sử dụng trong lĩnh vực sản xuất công nghiệp rượu vang và nước trái cây từ năm 1930 Các sản phẩm pectinase hiện nay chiếm khoảng 25% lượng enzyme được sử dụng trong thực phẩm trên toàn thế giới PME được sản xuất với nhiều ứng dụng khác nhau, góp phần quan trọng trong quá trình chế biến thực phẩm.
GVHD: Trang 5 nh t từ các ngu n n m (Aspergillus niger ) vƠ đ ̣c ng d ng nhiều trong công nghi p tḥc phẩm (Pooja Kohli và c ộng ṣ, 2015).
Trong sản xuất rượu vang, nước quả có vai trò quan trọng Lợi ích của việc tăng hiệu suất trích ly được thực hiện bằng cách phá vỡ cấu trúc của pectin, giúp giảm độ nhờn của các loại nước ép trái cây, từ đó nâng cao hiệu quả lọc và ly tâm Để giảm pectin, PME được sử dụng kết hợp với các loại pectinase khác như polygalacturonases và pectinlyase Trong một số trường hợp, pectinase được kết hợp với cellulase và hemicellulases để phá vỡ hoàn toàn thành tế bào thực vật.
Cấu trúc rau quả trong công nghiệp thường sử dụng các quy trình như nhúng, làm lạnh, khử trùng và tiệt trùng đặc áp để bảo quản trái cây và rau quả Tuy nhiên, phương pháp này có thể gây ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng rau quả Một giải pháp thay thế hiệu quả là sử dụng PME và CaCl2 để cải thiện cấu trúc của rau quả.
Methyl hóa pectin trong mô thực vật xảy ra dưới tác động của enzyme PME và ion canxi (Ca2+) Sự hiện diện của Ca2+ giúp pectin khử ester, tạo gel và làm cho thành tế bào cứng hơn Ngược lại, khi thiếu Ca2+, enzyme polygalacturonases và pectinlyase hoạt động, phân hủy mạch polymer của pectin, dẫn đến việc rau củ trở nên mềm hơn (Trần Thanh Trúc, 2013).
Trong sản xuất cà phê, pectinase được sử dụng để tách lớp keo trên bề mặt hạt cà phê, thay thế cho các phương pháp vi sinh vật trước đây, vốn khó kiểm soát và không đồng đều Bên cạnh đó, vỏ cà phê là một sản phẩm phụ không thể tránh khỏi trong quá trình sản xuất, chứa nhiều hợp chất khó phân hủy tự nhiên Việc áp dụng hai chủng nấm mốc Trichoderma viride giúp cải thiện quy trình xử lý này.
Aspergillus niger được sử dụng để sản xuất cellulase và pectinase, giúp tăng tốc quá trình phân hủy chất hữu cơ, từ đó góp phần giảm ô nhiễm môi trường (Trần Thị Thanh Thuận, Nguyễn Đắc Lộc, 2009).
Ngu n thu nḥn
Việc sử dụng vi sinh vật làm nguyên liệu sản xuất enzyme đang thu hút sự quan tâm lớn Hiện nay, hơn 50% tổng lượng enzyme công nghiệp được sản xuất từ nấm men và nấm mốc, trong khi một phần ba được tổng hợp từ nguồn vi khuẩn, và phần còn lại từ thực vật và động vật.
GVHD: Trang 6 Đ ÁN K THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH H C Nhóm: 01
Các vi sinh ṿt có kh năng t ng ḥp pectinase ch y u là vi sinh v ̣t hi u khí, tiêubiểu là các dòng sau:
- N m ḿc: Aspergillus sp., Penicillium glaucum, Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme, Rhizoctonia solani, Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp., Neurospora crassa,…
- Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Bacillus felineus, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella aerogenes, Erwinia carotovora,
Với ưu điểm là nuôi cấy sinh trưởng và phát triển nhanh cho nhiều enzyme trong thời gian ngắn, vi sinh vật đặc biệt là nấm mốc được sử dụng phổ biến để nuôi cấy thu enzyme pectinase Trong đó, A niger được biết đến là chủng sinh enzyme pectinase nhiều nhất (Lê Thị Thu Trang, 2011).
Enzyme pectin methylesterase được tìm thấy trong nhiều loại thực vật như cà chua, cam, đu đủ, táo, kiwi, vỏ bưởi và cam quýt Các loài nấm và vi khuẩn như Aspergillus niger, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas solanacearum thường được sử dụng trong sản xuất các loại rượu, nước trái cây và các ngành công nghiệp thực phẩm khác (Pooja Kohli và cộng sự, 2015).
PME lƠ enzyme đ ̣c sinh t ng ḥp ch y u trong nhóm pectinase t ừ A niger
Các nghiên cu về vai trò c a dòng n m ḿc đ n kh năng sinh enzyme cũng đư xác nḥn ho t tính c a enzyme pectin methylesterase đ ̣c thu nḥn từ n m ḿc
Aspergillus niger cao h n hẳn so v́i các loài n m ḿc kh́c H n th nữa A niger còn đ ̣c công nh ̣n là dòng n m có đặc tính an toàn d phát triển và phân l ̣p (Tr nThanh Trúc, 2013).
T ng quan về n m Aspergillus niger
Phân lo i
Hình 1.3: Aspergillus niger (Ngu n:https://www.drthrasher.org)
C u trúc vi thể: bào t ử dính dƠi tr n không mƠu hay nơu, thể b̀nh 2 đ́y, túi n m tròn đ u xòe A.niger sinh s n b ng hình th c bào t ử dính không có túi bao ḅc.
C thể d ng ṣi, g̣i là khu ẩn ty hay ṣi n m (hypha), nhiều ṣi (lypha), ḥp l i thành h ṣi n m (mycelium).Khuẩn ty c a n m ch tăng tr ng ng̣n và có v́ch ngăn, g m hai lo i:
Khuẩn ty dinh d ̃ng là loại khuẩn ty có kích thước nhỏ, màu trắng, phát triển trong môi trường nuôi cấy Chúng thường bện chặt thành một khối rắn chắc, có khả năng hút dưỡng chất từ môi trường xung quanh Khi già, khuẩn ty sẽ chuyển sang màu vàng.
Khuẩn ty sinh sần là loại khuẩn ty phát triển trong không khí, có kích thước lớn hơn khuẩn ty dinh dưỡng rất nhiều Chúng hướng vào không khí để lấy oxy và có khả năng tạo bào tử khi già.
Tóm lại, khi già h ṣi có nhiều biến đổi, một số khuẩn ty dinh dưỡng tạo thành các hình ảnh màu vàng Đồng thời, khuẩn ty sinh sản hình thành các bào tử đính lơm, khiến bề mặt khuẩn lạc có màu đen.
2013) Thành c a khuẩn ty n m có c u t o ṣi, thành ph n hóa h ̣c chính là chitin và glucan.
Cấu trúc sinh sản của cây có dương nhựa hoa cúc bao gồm cuống bào tử tròn nhẵn, trong suốt hoặc nâu nhạt Cuống bào tử có phần phình to đầu, tạo thành bọng lớn dạng cầu gọi là bọng đính giá hình cầu (vesicle), trên bọng này xuất hiện những thể bình.
GVHD: Trang 8 Đ ÁN K THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC Nhóm: 01 A.niger là một loài nấm đặc biệt trong chi Aspergillus, được phân biệt bởi khả năng sản xuất bào tử đính (conidia) từ ngọn thể bình sinh, tạo thành các chuỗi bào tử đính màu đen.
A.niger có th ể sinh s n theo hai hình th c chính:
Sinh sản sinh dưỡng là quá trình mà từ một đơn khuẩn ty riêng lẻ có thể phát triển thành một hệ sinh thái mới Khuẩn ty của nấm mốc có khả năng lẫn vào môi trường, bay đi khắp nơi, và khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ nhanh chóng phát triển thành khuẩn lạc mới.
A.niger sinh sản vô tính thông qua bào tử trần (conidium), với hình thức bào tử ngoại sinh được hình thành bên ngoài tế bào sinh bào tử trần (cell conidiogen) Các bào tử này phát triển trực tiếp trên khuẩn ty hoặc đặc biệt là cuống bào tử trần (conidiophone).
Kh năng đ ng hóa các lo i đ ng khác nhau
A.niger đ ng hóa t ́t các lo i đ ng nh glucose, fructose, saccharose, mannose Đ́i v́i đ ng sorbose, galactose, A.niger đ ng hóa m c khá ́tt, còn đ ng lactose th̀ đ ng hóa m c trung bình.
A.niger có kh năng sử d ng ure làm ngu n N và ch t điều ch nh pH, dúi tác d ng c a enzyme urease, ure phân h y thành CO 2 và NH 3 A.niger đ ng hóa các múi amon Vi c sử d ng ngu n N hữu c , urease vƠ ćc múi amon đều g n liền v́i vi c tách NH ra r i h p thu vƠo c thể Nh ṿy NH lƠ trung tơm con đ ng
3 3 dinh d ̃ng nit c a vi sinh ṿt.
Ngu n dinh d ̃ng khoáng phospho
Sự hiện diện của các hợp chất phospho và nồng độ của chúng trong môi trường ảnh hưởng lớn đến quá trình trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật Thay đổi nồng độ các hợp chất phospho trong môi trường sẽ dẫn đến sự biến đổi trong quá trình tổng hợp hàng loạt các chất hợp phân của tế bào, bao gồm cả tế bào và chất nhân Bên cạnh đó, phospho trong môi trường còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính của enzyme, ảnh hưởng đến các loại thực ăn carbon.
Kh năng sinh t ng ḥp enzyme
A.niger có kh năng sinh ćc enzyme nh amylase, protease, peptinase, α - amylase, glucoamylase
Aspergillus niger là một loại nấm phổ biến trong tự nhiên, thường xuất hiện trong đất, xác thực vật và hoa quả, đặc biệt ở những vùng có khí hậu ẩm Chúng có thể sống hoại sinh hoặc ký sinh, không có khả năng quang hợp để tạo ra chất hữu cơ, mà thay vào đó, chúng hấp thụ các loại chất hữu cơ có sẵn qua bề mặt của khuẩn ty.
1.3 Các yu t nhăh ngăđ n quá trình sn xu t
1.3.1 nhăh ng c a thành ph nămôiătr ng
Nguồn carbon là thành phần quan trọng trong sự phát triển của vi sinh vật, đặc biệt trong quá trình sinh tổng hợp PME Các enzyme trong nhóm pectinase cần nguồn carbon giàu pectin có độ methoxyl hóa cao, giúp tạo ra các phân tử như acid pectic và D-galacturonate Những thành phần này không chỉ cung cấp nguồn carbon cho vi sinh vật mà còn đóng vai trò như một chất xúc tác trong quá trình sinh tổng hợp PME.
Nitơ đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp protein, axit nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác trong tế bào sinh vật Môi trường có đủ lượng carbon và nitơ cần thiết để tích lũy enzyme lớn nhất Hơn nữa, axit amin là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme, và chúng có ảnh hưởng tích cực đến sinh lý của vi sinh vật.
GVHD: Trang 10 Đ ÁN K THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH H C Nhóm: 01 nh quá trình sinh t ng ḥp enzyme Acid amin có th ể đ ng carbon, ngu n nitrogen và là ngu n năng l ̣ng (Nguy n Đ c L
Ngu năc ch t th i vừa là ngu n ̣ng, 2004). Đặc điểm chung c a môi tr ng nuôi c y vi sinh ṿt thu enzyme pectinase cũng nh Ngu năkhoángădinhăd ỡng
PME là s ̣ có m ặt ch t c m ng (Nguy n Đ c L ̣ng, 2004).
Các nguyên tố vi lượng đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Phospho cần thiết để tổng hợp các thành phần quan trọng của tế bào và nhiều coenzyme Phospho ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh sản của nấm men.
2+ có nh h ng đ n độ bền nhi t c a enzyme. cácvi sinh ṿt khác Cation Mg
L-Glutathione chứa các acid amin quan trọng như methionine và cysteine, đóng vai trò tích cực trong việc kích thích sự hình thành enzyme Bên cạnh đó, các khoáng chất như canxi, mangan và coban cũng ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzyme.
Nhiệt độ ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc, đồng thời làm giảm hoạt động của enzyme Để A.niger phát triển và lên men hiệu quả, nhiệt độ lý tưởng nằm trong khoảng 30-40 độ C.
Hình th c sinh s n
A.niger có th ể sinh s n theo hai hình th c chính:
Sinh sản sinh dưỡng là quá trình mà từ một đơn khuẩn ty riêng lẻ có thể phát triển thành một hệ sinh thái mới Khuẩn ty của nấm mốc có khả năng lan tỏa vào môi trường như bầu không khí, và khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng nhanh chóng phát triển thành khuẩn lạc mới.
A niger sinh sản vô tính thông qua việc tạo ra bào tử trần (conidium) Hình thức sinh sản này liên quan đến các bào tử ngoại sinh, được hình thành bên ngoài tế bào sinh bào tử trần (conidiogenóu cell) Các bào tử này phát triển trực tiếp trên khuẩn ty hoặc đặc biệt là trên cuống bào tử trần (conidiophone).
Kh năng đ ng hóa các lo i đ ng khác nhau
A.niger đ ng hóa t ́t các lo i đ ng nh glucose, fructose, saccharose, mannose Đ́i v́i đ ng sorbose, galactose, A.niger đ ng hóa m c khá ́tt, còn đ ng lactose th̀ đ ng hóa m c trung bình.
A.niger có kh năng sử d ng ure làm ngu n N và ch t điều ch nh pH, dúi tác d ng c a enzyme urease, ure phân h y thành CO 2 và NH 3 A.niger đ ng hóa các múi amon Vi c sử d ng ngu n N hữu c , urease vƠ ćc múi amon đều g n liền v́i vi c tách NH ra r i h p thu vƠo c thể Nh ṿy NH lƠ trung tơm con đ ng
3 3 dinh d ̃ng nit c a vi sinh ṿt.
Ngu n dinh d ̃ng khoáng phospho
Sự hiện diện của các hợp chất phospho và nồng độ của chúng trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật Thay đổi nồng độ các hợp chất phospho trong môi trường sẽ dẫn đến sự biến đổi trong quá trình tổng hợp hàng loạt các chất hợp phân của tế bào, bao gồm cả tế bào và chất nhân Hơn nữa, phospho trong môi trường còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính của enzyme, ảnh hưởng đến các loại thức ăn carbon.
Kh năng sinh t ng ḥp enzyme
A.niger có kh năng sinh ćc enzyme nh amylase, protease, peptinase, α - amylase, glucoamylase
Aspergillus niger là một loại nấm phổ biến trong tự nhiên, thường xuất hiện trong đất, xác thực vật và hoa quả, đặc biệt ở những vùng khí hậu ẩm ướt Chúng là những sinh vật hiếu khí, có khả năng sống hoại sinh hoặc ký sinh, nhưng không có khả năng quang hợp để tổng hợp chất hữu cơ Thay vào đó, Aspergillus niger hấp thụ các loại chất hữu cơ có sẵn qua bề mặt khuẩn ty.
1.3 Các yu t nhăh ngăđ n quá trình sn xu t
1.3.1 nhăh ng c a thành ph nămôiătr ng
Nguồn carbon là thành phần quan trọng trong sự phát triển của vi sinh vật, đặc biệt trong quá trình sinh tổng hợp PME và các enzyme pectinase Nguồn carbon giàu pectin có độ methoxyl hóa cao cung cấp các phân tử như acid pectic, D-galacturonate và các carbohydrate khác, đóng vai trò không chỉ là nguồn carbon cho vi sinh vật mà còn là chất xúc tác cho quá trình sinh tổng hợp PME.
Nito đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp protein, axit nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác trong tế bào sinh vật Môi trường cần có đủ lượng carbon và nito để tích lũy enzyme một cách hiệu quả Hơn nữa, axit amin không chỉ là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme mà còn có ảnh hưởng tích cực đến sinh lý của vi sinh vật.
GVHD: Trang 10 Đ ÁN K THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH H C Nhóm: 01 nh quá trình sinh t ng ḥp enzyme Acid amin có th ể đ ng carbon, ngu n nitrogen và là ngu n năng l ̣ng (Nguy n Đ c L
Ngu năc ch t th i vừa là ngu n ̣ng, 2004). Đặc điểm chung c a môi tr ng nuôi c y vi sinh ṿt thu enzyme pectinase cũng nh Ngu năkhoángădinhăd ỡng
PME là s ̣ có m ặt ch t c m ng (Nguy n Đ c L ̣ng, 2004).
Các nguyên tố vi lượng đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Phospho cần thiết để tổng hợp các thành phần quan trọng của tế bào và nhiều coenzyme Phospho ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh sản của nấm men.
2+ có nh h ng đ n độ bền nhi t c a enzyme. cácvi sinh ṿt khác Cation Mg
L-phenylalanine là một amino acid quan trọng, góp mặt trong việc hình thành các enzyme thông qua các acid amin như methionine và cysteine Ngoài ra, các khoáng chất như canxi, mangan và coban cũng đóng vai trò thiết yếu trong quá trình tổng hợp enzyme (Nguyễn Đắc Lộc, 2004).
Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng tiêu cực đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc, đồng thời làm giảm hoạt động của enzyme Nhiệt độ lý tưởng cho A.niger phát triển và lên men là từ 30-40 độ C.
Khi nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt, môi trường có độ ẩm cao và hàm lượng dinh dưỡng thấp khiến giá trị pH của dịch trích sau lên men thường ít thay đổi trong suốt thời gian nuôi cấy Tuy nhiên, giá trị pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của vi sinh vật và quá trình tạo thành enzyme Khi pH môi trường chuyển dịch về phía acid hoặc kiềm, sự hình thành sinh khối và enzyme có thể bị ức chế Giá trị pH tối ưu trong quá trình lên men là 4,0 (Vinod Kumar Joshi et al., 2006).
Th i gian lên men nh h ng đ́ng kể đ n kh năng sinh t ng ḥp enzyme và ho t tính c a enzyme Vi sinh ṿt c n th i gian để phát triển và s n sinh enzyme.
Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường không thích hợp sẽ dẫn đến sự phát triển kém, làm giảm hoạt tính enzyme Bên cạnh đó, việc tạo bào tử cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Đối với A niger, quá trình tổng hợp enzyme diễn ra mạnh mẽ nhất khi bắt đầu hình thành bào tử (Nguyễn Đắc Lộc, 2004).
GVHD: Trang 11 đ ̣c t ng ḥp từ A niger đ ̣c nuôi c y trong th i gian 96 gi (Vinod Kumar Joshi et al., 2006)
Quá trình nuôi cấy A niger để thu nhận PME có thể thực hiện bằng hai phương pháp lên men khác nhau: lên men bề mặt trên môi trường rắn (SSF) và lên men bề mặt trên môi trường lỏng (SmF).
Nghiên cứu cho thấy enzyme thu được từ phương pháp lên men rắn (SSF) có hoạt tính cao hơn so với phương pháp lên men lỏng (SmF) khi nuôi cấy trên cùng một loại vi sinh vật Cụ thể, hoạt tính của PME trong phương pháp SSF cao hơn 2,3 lần so với SmF (Vinod Kumar Joshi et al., 2006).
1.4.1 Ph ngăphápănuôiăc y bề sâu SmF
Nuôi cây chìm hay nuôi cây bề sâu cần phải chú ý đến sự phân tán của vi sinh vật trong môi trường Vi sinh vật cần được phân bố đều khắp mọi điểm và xung quanh bề mặt để tiếp xúc với dung dịch dinh dưỡng Đặc điểm này yêu cầu trong suốt quá trình nuôi cây phải cung cấp oxy liên tục Hệ thống khuấy trộn tốt sẽ giúp toàn bộ môi trường nuôi cây trở thành một hệ thống đồng nhất.
Cho phép kiểm sót đ ̣c toàn b ộ quá trình lên men ộmt cách thụn ḷi
Ít t́n kém mặt b ng, ti t ki m di n tích s n xu t
D c gíi hóa và t ̣ động hóa trong quá trình s n xu t
Nh căđi m Đ u t nhiều kinh phí cho trang thi t b
C n ph i khu y và s c khí lên t c.
Đòi hỏi trang b k thụt cao, d nhi n trùng toàn b ộ
D hỏng c quá trình lên men, gâýtn kém ́ln
Ph li u ph i kèm theo công ngh xử lý ch ́ng ô nhi m môi tr ng.
1.4.2 Ph ngăphápănuôiăc y bề mặt SSF
Phân b ́
Aspergillus niger là một loại nấm phổ biến trong tự nhiên, thường xuất hiện trong đất, xác bã thực vật và hoa quả, đặc biệt ở những vùng có khí hậu ẩm ướt Chúng có khả năng sống hoại sinh hoặc ký sinh và không có khả năng quang hợp Thay vào đó, Aspergillus niger hấp thụ các loại chất hữu cơ có sẵn qua bề mặt khuẩn ty.
1.3 Các yu t nhăh ngăđ n quá trình sn xu t
1.3.1 nhăh ng c a thành ph nămôiătr ng
Nguồn carbon là thành phần quan trọng trong sự phát triển của vi sinh vật, đặc biệt trong quá trình tổng hợp PME Các enzyme trong nhóm pectinase cần nguồn carbon giàu pectin với độ methoxyl hóa cao, bao gồm acid pectic và D-galacturonate Những thành phần này không chỉ cung cấp carbon cho sự phát triển của vi sinh vật mà còn đóng vai trò chất xúc tác trong quá trình tổng hợp PME.
Nitơ đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp protein, axit nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào sinh vật Môi trường có đủ lượng carbon và nitơ là điều kiện cần thiết để tích lũy enzyme lớn nhất Hơn nữa, do axit amin là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme, axit amin cũng có ảnh hưởng tích cực đến sinh lý của vi sinh vật.
GVHD: Trang 10 Đ ÁN K THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH H C Nhóm: 01 nh quá trình sinh t ng ḥp enzyme Acid amin có th ể đ ng carbon, ngu n nitrogen và là ngu n năng l ̣ng (Nguy n Đ c L
Ngu năc ch t th i vừa là ngu n ̣ng, 2004). Đặc điểm chung c a môi tr ng nuôi c y vi sinh ṿt thu enzyme pectinase cũng nh Ngu năkhoángădinhăd ỡng
PME là s ̣ có m ặt ch t c m ng (Nguy n Đ c L ̣ng, 2004).
Các nguyên tố vi lượng đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Phospho cần thiết để tổng hợp các thành phần quan trọng của tế bào và nhiều coenzyme Phospho ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh sản của vi sinh vật.
2+ có nh h ng đ n độ bền nhi t c a enzyme. cácvi sinh ṿt khác Cation Mg
L-phenylalanine là một amino acid quan trọng, đóng vai trò trong việc kích thích sự hình thành enzyme, cùng với các amino acid khác như methionine và cysteine Ngoài ra, các khoáng chất như canxi, mangan và coban cũng góp phần quan trọng trong quá trình tổng hợp enzyme (Nguyễn Đắc Lộc, 2004).
Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc, đồng thời làm giảm hoạt động của enzyme Nhiệt độ lý tưởng cho A.niger phát triển và lên men là từ 30-40 độ C.
Khi nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt, môi trường có độ ẩm cao và hàm lượng dinh dưỡng thấp khiến giá trị pH của dịch trích sau lên men thường ít thay đổi trong suốt quá trình nuôi cấy Tuy nhiên, giá trị pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của vi sinh vật và sự sản xuất enzyme Khi pH môi trường chuyển dịch về phía acid hoặc kiềm, sự sản xuất sinh khối cũng như enzyme sẽ bị ảnh hưởng Giá trị pH tối ưu trong quá trình lên men được xác định là 4,0 (Vinod Kumar Joshi et al., 2006).
Th i gian lên men nh h ng đ́ng kể đ n kh năng sinh t ng ḥp enzyme và ho t tính c a enzyme Vi sinh ṿt c n th i gian để phát triển và s n sinh enzyme.
Nhu cầu dinh dưỡng của môi trường sinh sống có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của vi sinh vật, dẫn đến hoạt tính enzyme giảm sút Ngoài ra, việc tạo bào tử cũng làm giảm hoạt tính của enzyme Đối với Aspergillus niger, quá trình sinh tổng hợp enzyme đạt mức cao nhất khi bắt đầu hình thành bào tử (Nguyễn Đắc Lộc, 2004).
GVHD: Trang 11 đ ̣c t ng ḥp từ A niger đ ̣c nuôi c y trong th i gian 96 gi (Vinod Kumar Joshi et al., 2006)
Quá trình nuôi cấy A niger để thu nhận PME có thể thực hiện bằng hai phương pháp lên men khác nhau: lên men bề mặt trên môi trường rắn (SSF) và lên men bề mặt trên môi trường lỏng (SmF).
Nghiên cứu cho thấy enzyme thu được từ phương pháp nuôi cấy rắn (SSF) có hoạt tính cao hơn so với phương pháp nuôi cấy lỏng (SmF) khi sử dụng cùng một loại vi sinh vật với chất lên men Cụ thể, hoạt tính của PME trong phương pháp SSF cao gấp 2,3 lần so với SmF (Vinod Kumar Joshi et al., 2006).
1.4.1 Ph ngăphápănuôiăc y bề sâu SmF
Nuôi cây chìm hay nuôi cây bề sâu yêu cầu sự phân tán đồng đều của vi sinh vật trong môi trường Các vi sinh vật này cần được phân bổ khắp mọi điểm và xung quanh bề mặt để tiếp xúc với dung dịch dinh dưỡng Để đảm bảo sự phát triển của cây, quá trình nuôi cần được cung cấp oxy liên tục thông qua hệ thống khuấy trộn hiệu quả Nhờ vào hệ thống khuấy trộn tốt, toàn bộ môi trường nuôi cây sẽ trở thành một hệ thống đồng nhất, hỗ trợ tối ưu cho sự phát triển của cây trồng.
Cho phép kiểm sót đ ̣c toàn b ộ quá trình lên men ộmt cách thụn ḷi
Ít t́n kém mặt b ng, ti t ki m di n tích s n xu t
D c gíi hóa và t ̣ động hóa trong quá trình s n xu t
Nh căđi m Đ u t nhiều kinh phí cho trang thi t b
C n ph i khu y và s c khí lên t c.
Đòi hỏi trang b k thụt cao, d nhi n trùng toàn b ộ
D hỏng c quá trình lên men, gâýtn kém ́ln
Ph li u ph i kèm theo công ngh xử lý ch ́ng ô nhi m môi tr ng.
1.4.2 Ph ngăphápănuôiăc y bề mặt SSF
Phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường hoặc trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm bao gồm việc sử dụng nguyên liệu chính là bột cám mì, bã cà phê, bột bắp nghiền, hạt thóc nảy mầm, cùng với việc bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác như amonium sulfate, amonium chloride và amonium phosphate.
GVHD: Trang 12 Đ ÁN K THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH H C Nhóm: 01
Môi tr ng nuôi c y đn gi n;
Một ś c ch t có th ể đ ̣c sử d ng tṛc ti p lƠm môi tr ng r n hoặc b sung thêm một ś ch t dinh ḍ̃ng;
S n phẩm thu nḥn có n ng độ cao, d dàng tinh s ch;
Sử d ng k t ḥp ćc c ch t ṭ nhiên có ngu n ǵc tḥc ṿt, bào t ử hoặc t bào; Độ ẩm th p và m ̣t độ n m ḿc ĺn nên h n ch đ ̣c ṣ lây nhi m c a nhiều lo i vi sinh ṿt khác;
L ̣ng t p ch t sinh ra th p h n trong SmF;
Enzyme ít nh y c m v́i các ch t c ch d hóa ho ặc c m ng;
Trong điều ki n thi t b đ n gi n, không có thi t b ph n ng sinh ḥc, vi c lên men SSF Ơl ph ng th c hi u qu , d tḥc hi n, có tính kh thi cao
Việc cung cấp oxy cho vi sinh vật thủy sinh là rất quan trọng, vì hàm lượng oxy trong không khí thường cao hơn nhiều so với hàm lượng oxy hòa tan trong dịch lên men Do đó, diện tích tiếp xúc của vi sinh vật với không khí trong môi trường rắn cũng lớn hơn so với diện tích tiếp xúc của vi sinh vật với bọt khí trong môi trường lỏng.
Chi phí năng l ̣ng th p h n.
Ṿn hƠnh quy tr̀nh lên men cũng đ n gi n h n, không đòi hỏi tr̀nh độ chuyên môn cao.
Các vi sinh ṿt nuôi c y b i ph ng ph́p SSF b h n ch b i rào c n về độ ẩm c a môi tr ng;
Việc xác định các thông số như độ ẩm, pH, oxy tự do, CO2 và độ lên men trong quá trình lên men là rất quan trọng Tuy nhiên, việc duy trì những thông số này trong thời gian lên men gặp nhiều khó khăn do tính chất biến đổi của chúng.
Ṣ đ o trộn khó, d ̃n đ n vi c lên men khó đ ̣c đ ng nh t.
Trong nhiều tr ng ḥp, vi c thu s n phẩm khó khăn h n so v́i lên men trong môi tr ng lỏng.
Trong kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật, có hai loại môi trường nuôi cấy: môi trường bán rắn và môi trường lỏng Môi trường lỏng cho phép vi sinh vật phát triển trên bề mặt dung dịch lỏng, nơi có sự tiếp xúc giữa pha lỏng và pha khí Vi sinh vật tạo thành những ván phim kín trên bề
