Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9131:2011 THỨC ĂN CHĂN NI – ĐỊNH TÍNH ZEARALENONE Animal feeding stuffs – Qualitative determination of zearalennone Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp định tính zearalenone thức ăn chăn ni đặc biệt ngô Phương pháp dùng cho mục đích sàng lọc Giới hạn phép xác định zearalenone khoảng 50 μg/kg CHÚ THÍCH Mặc dù lúa miến cho vết huỳnh quang nhiễu giống vết huỳnh quang zearalenone, phương pháp áp dụng cho thức ăn chăn ni giá trị R f khác sau phát triển sắc phổ theo chiều thứ hai Các vết chấm không triển khai kỹ thuật khẳng định riêng Nguyên tắc Phần mẫu thử chiết hỗn hợp axetonitril dung dịch kali clorua sau lọc phần dịch lọc khử béo isooctan, sau tinh hỗn hợp axetonitril, nước chì axetat với có mặt diatomit Sau lọc, phần dịch lọc chiết cloroform sau cho bay Chất chiết khơ hịa tan hỗn hợp benzen axetonitril Tiến hành sắc ký lớp mỏng hai chiều phần dịch dịch Hàm lượng zearalenone xác định cách quan sát đo cường độ huỳnh quang vết chấm ánh sáng tử ngoại cách so sánh với cường độ huỳnh quang lượng zearalenone biết thực sắc ký Việc nhận biết zearalenone khẳng định cách sử dụng thuốc thử benzidin bis-diazo hóa Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích nước cất nước khử khống nước có độ tinh khiết tương đương 3.1 Axetonitril 3.2 Isooctan 3.3 Cloroform CẢNH BÁO – Cloroform chất độc Tránh hít tiếp xúc với cloroform Làm việc tủ hút khí độc xử lý dung mơi dung dịch chúng 3.4 Benzen/axetonitril, hỗn hợp 98 + 2, tính theo thể tích CẢNH BÁO – Benzen độc hít phải tiếp xúc với da dễ cháy 3.5 Dung môi triển khai 3.5.1 Toluen/etyl axetat/axit focmic, hỗn hợp + + 1, tính theo thể tích 3.5.2 Cloroform/etanol, hỗn hợp 95 + 5, tính theo thể tích 3.6 Kali clorua, dung dịch 40 g/l 3.7 Dung dịch chì axetat, chuẩn bị sau: Cân 200 g chì axetat cho vào bình định mức vạch 1000 ml, thêm ml axit axetic, pha loãng nước đến vạch trộn 3.8 Thuốc thử benzidin bis-diazo hóa, chuẩn bị sau CẢNH BÁO – Benzidin chất gây ung thư, gây độc hít vào, tiếp xúc với da nuốt phải 3.8.1 Chuẩn bị dung dịch benzidin g/l Lấy 0,5 g benzidin cho vào bình 100 ml có chứa 20 ml nước 1,5 ml axit clohydric thêm nước đến vạch Bảo quản dung dịch chai thủy tinh màu nâu tránh ánh sáng 3.8.2 Chuẩn bị thuốc thử LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Làm nguội thể tích dung dịch benzidin (3.8.1) dung dịch natri nitrit 100 g/l đến khoảng từ oC đến oC Trộn kỹ hai dung dịch Dung dịch thu có màu tím sẫm đục Đưa dung dịch nhiệt độ phòng (màu vàng) trước sử dụng Chuẩn bị thuốc thử sử dụng 3.9 Diatomit (celit 545), rửa axit clohydric 3.10 Nitơ 3.11 Zearalenone, dung dịch chuẩn có nồng độ 10 μg/ml benzen Xác định phổ hấp thụ dung dịch dải bước sóng từ 300 nm đến 330 nm máy đo phổ, sử dụng cuvet quang học thạch anh 10 mm sử dụng benzen làm chất đối chứng Ghi lại độ hấp thụ tối đa, A, gần với bước sóng 317 nm Tính nồng độ zearalenone dung dịch miligam mililit (mg/ml), sử dụng cơng thức sau: Trong 318 khối lượng phân tử zearalenone; 6060 hệ số tắt phân tử Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 4.1 Máy nghiền, thích hợp để chuẩn bị sản phẩm cho lọt hết qua rây cỡ lỗ mm 4.2 Máy lắc, thực 100 dao động phút 4.3 Giấy lọc, loại trung bình (giấy lọc nhanh làm cho dung dịch đục, giấy loại chậm làm cho giấy dễ bị tắc) 4.4 Bộ quay có bình cầu đáy tròn 4.5 Thiết bị dùng cho sắc ký lớp mỏng, ví dụ: thiết bị cần thiết để chuẩn bị sắc ký (4.6) dụng cụ chấm (pipet mao quản microxyranh), bể triển khai sắc ký, dụng cụ phun thuốc thử (3.8) lên sắc ký 4.6 Bản thủy tinh dùng cho sắc ký lớp mỏng, kích thước 200 mm x 200 mm, chuẩn bị sau (lượng vừa đủ để chuẩn bị bản) Cân 30 g silica gel G-HR cho vào bình nón, thêm 60 ml nước, đậy kín trộn kỹ Dàn thành lớp sắc ký cho tạo thành lớp dày 0,25 mm Để khơ khơng khí bảo quản sắc ký bình hút ấm Hoạt hóa sắc ký trước sử dụng cách đặt chúng tủ sấy, trì 110 oC ± oC h Có thể sử dụng sắc ký chuẩn bị có bán sẵn thị trường cho kết tương đương với kết thu từ sắc ký chuẩn bị phần 4.7 Đèn UV bước sóng ngắn (bước sóng 253 nm) Cường độ tia sáng phải đạt cho phân biệt rõ chấm 25 ng zearalenone sắc ký lớp mỏng đèn đặt cách sắc ký 100 mm CẢNH BÁO – Do ánh sáng UV có hại cho mắt, cần mang tính bảo vệ mắt 4.8 Ống nghiệm, dung tích 10 ml, có nắp polyetylen 4.9 Máy đo huỳnh quang (tùy chọn, nên có) 4.10 Nồi cách thủy, trì nhiệt độ 60 oC ± oC 4.11 Bình nón, dung tích 500 ml, có nút thủy tinh mài 4.12 Phễu chiết, dung tích 250 ml 4.13 Ống đong, dung tích 100 ml 250 ml 4.14 Pipet, dung tích 50 ml 100 ml LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn 4.15 Microxyranh Lấy mẫu Lấy mẫu phòng thử nghiệm sản phẩm cần kiểm tra theo tiêu chuẩn thích hợp liên quan đến sản phẩm, trừ việc lấy mẫu để xác định zearalenone không bao gồm áp dụng Nếu khơng có tiêu chuẩn cụ thể hành, bên liên quan thỏa thuận vấn đề này, có tính đến đặc tính sản phẩm cần lấy mẫu Cách tiến hành 6.1 Chuẩn bị mẫu thử Nghiền mẫu cho hết qua rây có cỡ lỗ mm Trộn kỹ 6.2 Phần mẫu thử Cân 50 g mẫu thử cho vào bình nón 500 ml (4.11), xác đến 0,01 g 6.3 Chiết Dùng ống đong (4.13) thêm cẩn thận 180 ml axetonitril (3.1) 20 ml dung dịch kali clorua (3.6) vào bình Đậy bình, trộn lắc 30 máy lắc (4.2) Lọc qua giấy lọc (4.3) Dùng pipet (4.14) chuyển 100 ml dịch lọc vào phễu chiết (4.12) loại chất béo cách chiết hai lần liên tục lần dùng 50 ml isooctan (3.2) Thu lấy pha axetonitril vào bình cầu đáy trịn cô quay (4.4) cho bay đến khô áp suất giảm 6.4 Tinh Dùng ống đong (4.13) thêm cẩn thận 20 ml axetonitril (3.1), 60 ml nước 20 ml dung dịch chì axetat (3.7) vào lượng lại thu sau bay Trộn để tách pha 10 nồi cách thủy (4.10) trì 60 oC Kết tủa tạo thành Thêm g diatomit (3.9) lọc qua giấy lọc (4.3) Dùng pipet (4.14) chuyển 50 ml dịch lọc vào phễu chiết thực chiết ba lần liên tiếp, lần dùng 50 ml cloroform (3.3) Làm khô phần cloroform natri sulfat Thu phần cloroform bình cầu đáy trịn quay (4.4) làm bay gần đến khô áp suất giảm Chuyển lượng lại sau bay vào ống nghiệm (4.8) dùng cloroform để tráng rửa, sau làm bay đến khơ dịng khí nitơ (3.10) nồi cách thủy (4.10) Cẩn thận dùng microxyranh thêm 0,5 ml hỗn hợp benzen/axetonitril (3.4) đậy chặt nắp ống nghiệm 6.5 Sắc ký lớp mỏng hai chiều 6.5.1 Sử dụng dung dịch (xem Hình 1) Vạch lên sắc ký (4.6) hai đường thẳng song song sát với hai cạnh liền kề (ở 50 mm 60 mm tương ứng tính từ từ cạnh) để đánh dấu giới hạn dịch chuyển dung môi phía trước Đưa dung dịch sau lên sắc ký cách dùng microxyranh - điểm A, 25 μl dịch chiết tinh (6.4); - điểm B, 10 μl dung dịch chuẩn (3.11); - điểm C, μl dung dịch chuẩn (3.11); - điểm D, 10 μl dung dịch chuẩn (3.11); - điểm E, 15 μl dung dịch chuẩn (3.11) Làm khô dịng khơng khí nitơ Các vết chấm thu phải có đường kính khoảng mm 6.5.2 Khai triển Phát triển sắc phổ theo hướng l sử dụng dung môi khai triển (3.5.1) (lớp 10 mm bể bão hịa) tránh ánh sáng, dung mơi đạt đến vạch đánh dấu Lấy sắc ký hỏi bể để khơ 15 nhiệt độ môi trường, tránh ánh sáng Để thuận tiện hơn, sau khai triển theo hướng l, quan sát sắc phổ nhanh ánh sáng tử ngoại 253 nm khoanh chấm zearalenone nhanh bút chì (chấm điểm B cho thấy vị trí zearalenone) LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn Hình – Chấm mẫu triển khai sắc ký đồ Sau đó, khai triển sắc ký theo hướng ll sử dụng dung môi triển khai (3.5.2) (lớp 10 mm bể chưa bão hịa) tránh ánh sáng, dung mơi đến vạch đánh dấu Lấy sắc ký khỏi bể để khô nhiệt độ môi trường, tránh ánh sáng 6.6 Xác định 6.6.1 Yêu cầu chung Có thể sử dụng hai phương pháp xác định: quan sát mắt thường đo mật độ huỳnh quang Nếu có sẵn máy đo mật độ huỳnh quang nên dùng phương pháp 6.6.2 Quan sát mắt thường Xác định lượng zearalenone điểm chấm mẫu cách so sánh cường độ huỳnh quang ánh sáng UV điểm chấm từ chất chiết với cường độ điểm chấm C, D E dung dịch chuẩn, với sắc ký đặt cách đèn UV (4.7) 10 cm Dùng phương pháp nội suy, cần Nếu cường độ huỳnh quang điểm chấm 25 μl chất chiết lớn so với điểm chấm 15 μl dung dịch chuẩn, dùng thể tích nhỏ điểm A pha loãng chất chiết với hỗn hợp benzen/axetonitril (3.4) lặp lại sắc ký lớp mỏng (6.5) 6.6.3 Đo mật độ huỳnh quang Đo cường độ huỳnh quang chấm sử dụng máy đo mật độ huỳnh quang (4.9), ví dụ, bước sóng kích thích 313 nm bước sóng phát xạ 443 nm (bước sóng phát xạ cực đại 470 nm) Xác định hàm lượng zearalenone chấm mẫu cách so sánh cường độ huỳnh quang điểm chấm từ chất chiết với cường độ điểm chấm C, D E từ dung dịch chuẩn 6.7 Phép khẳng định zearalenone Phun thuốc thử benzidin bis-diazo hóa (3.8) lên sắc ký thu 6.5 Zearalenone cho chấm màu gạch đỏ tươi nhiệt độ phòng, nhạt dần sau tiếp xúc với khơng khí 15 Biểu thị kết 7.1 Phương pháp quan sát mắt thường Hàm lượng zearalenone, biểu thị microgam kilogam sản phẩm, tính công thức sau: LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Trong đó: c nồng độ zearalenone dung dịch chuẩn (3.11), tính microgam mililit (μg/ml); m khối lượng phần mẫu thử tương ứng với thể tích chất chiết phụ thuộc vào trình tinh (12,5 g), tính gam (g); V1 thể tích cuối dịch chiết có tính đến khả pha lỗng, tính microlit (μl); V2 V3 thể tích tương ứng chất chiết dung dịch chuẩn zearalenone (3.11) áp dụng cho sắc ký, cho cường độ huỳnh quang tương tự, tính microlit (μl) 7.2 Phép đo máy đo mật độ huỳnh quang Hàm lượng zearalenone, biểu thị microgam kilogam sản phẩm, tính theo cơng thức sau: Trong đó: m khối lượng phần mẫu thử (trong trường hợp 12,5 g) tương ứng với thể tích chất chiết phụ thuộc vào trình tinh (12,5 g), tính gam (g); m1 khối lượng zearalenone chấm chất chiết (có tính đến thể tích V 2), suy từ phép xác định, tính nanogam (ng); V1 thể tích cuối dịch chiết có tính đến khả lỗng, tính microlit (μl); V2 thể tích dịch chiết đưa vào sắc ký (trong trường hợp 25 μl), tính microlit (μl) Độ chụm Các chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm độ chụm phương pháp nêu Phụ lục A Các giá trị thu từ phép thử liên phịng thử nghiệm khơng áp dụng cho dải nồng độ chất khác với dải nồng độ chất nêu Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: - thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; - phương pháp thử dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - phương pháp xác định sử dụng (quan sát mắt thường sử dụng máy đo huỳnh quang); - tất chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, tùy chọn với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết quả; - kết thu PHỤ LỤC A (Tham khảo) PHÉP THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM Một phép thử liên phịng thử nghiệm quốc tế gồm có 20 phịng thử nghiệm tham gia (chỉ 16 phòng thử nghiệm số cung cấp kết sử dụng cho ngơ B) phịng thử nghiệm tiến hành ba phép xác định, cho kết thống kê (đánh giá theo ISO 5725:1986 1)) cho liệu nêu Bảng A.1 Bảng A.1 – Kết thử nghiệm liên phòng 1) ISO 5725 (đã hủy bỏ) sử dụng để thu liệu độ chụm LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Ngô B Mẫu Ngô A (mẫu ngơ A pha lỗng đến 1/3) Số lượng phòng thử nghiệm lại sau trừ ngoại lệ 20 15 Trung bình, μg/kg 734 219 Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, μg/kg 78 34 Hệ số biến thiên lặp lại, % 11 15 Giới hạn lặp lại, r(2,83 sr), μg/kg 221 96 Độ lệch chuẩn tái lập, sR, μg/kg 282 125 Hệ số biến thiên tái lập, % 38 57 Giới hạn tái lập, R (2,83 sR), μg/kg 798 354 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162