CHUYÊN ĐỀ: “Nhân giống lan Hồ Điệp bằng phương pháp vi nhân giống Bioreactor”

Chương GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Sự đời nuôi cấy mô - tế bào thực vật mang lại nhiều thành tựu to lớn công tác nhân giống giúp tiết kiệm thời gian việc chọn tạo đối tượng thực vật Nuôi cấy mơ - tế bào thực vật áp dụng nhiều phận khác thực vật với hệ số nhân cao mà đảm bảo hệ sau đồng mặt di truyền Ngày nay, nuôi cấy mô - tế bào thực vật công cụ thiếu việc nhân giống đối tượng hoa kiểng, đối tượng có giá trị kinh tế lại khó nhân giống phương pháp truyền thống Theo chương trình phát triển sản xuất hoa Bộ Nông nghiệp Phát triển Nơng thơn, đến năm 2010, diện tích đất trồng hoa Việt Nam đạt 8.000 ha, sản lượng đạt 4,5 tỉ cành xuất tỉ cành hoa (Dương Hoa Xô, không ngày tháng) Để đạt mục tiêu việc ứng dụng ni cấy mô - tế bào thực vật vào công tác nhân giống hoa kiểng cần phải trọng Hiện nay, song song với phát triển vượt bậc xã hội nhu cầu hoa kiểng người cao Vì thế, ngành sản xuất hoa, cảnh ngày phát triển mạnh Trong đó, lan loại hoa nhiều người u thích khơng màu sắc, kiểu dáng mà mang nét đẹp sang trọng trang nhã Chính vậy, nhanh chóng trở thành sản phẩm trồng trọt mang lại hiệu kinh tế cao không Việt Nam mà nhiều nước giới Trong số loại lan, Hồ Điệp (Phalaenopsis) đối tượng quan tâm cách đặc biệt dần trở thành mặt hàng chiến lược số quốc gia Thái Lan, Đài Loan, Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ… Vì thế, Việt Nam thúc đẩy sản xuất Phalaenopsis qui mô công nghiệp để phục vụ nhu cầu nước Tuy nhiên, Phalaenopsis loại lan đơn thân nên gặp nhiều khó khăn công tác nhân giống phương pháp truyền thống Đồng thời, tự nhiên khả nảy mầm, sống sót hạt thấp Chính vậy, việc áp dụng công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật Phalaenopsis cần thiết Trên Để khắc phục khó khăn việc trồng Lan, rút ngắn thời gian nhân giống lan Hồ Điệp mục đích chuyên đề “Nhân giống lan Hồ Điệp phương pháp vi nhân giống Bioreactor” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu Chương LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan lan Hồ Điệp 2.1.1 Phân loại nguồn gốc Giới : Thực vật (Plantae) Ngành : Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp : Hành (Liliopsida) Phân lớp : Hành (Liliidae) Bộ : Lan (Orchidales) Họ : Lan (Orchidaceae) Chi : Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis) - Hồ Điệp có tên khao học Phalaenopsis lồi có hoa lớn, bền, đẹp Có tên từ chữ grec Phalaina nghĩa bướm opsis có nghĩa giống Lan Hồ Điệp lồi lan có hoa giống bươm bướm phất phơ đẹp - Hồ Điệp khám phá năm 1750, ông Rumphius đặt tên Angraecum album 1753 Linne đổi tên thành Epidendrum 1825 nhà thực vật Hà Lan định danh lại Phalaenopsis - Hồ Điệp phân bố chủ yếu ở: Malay, Indo, Philipin, phía đơng Ấn Độ Úc Ở Việt nam có số lồi có hoa nhỏ nên gọi tiểu Hồ Điệp (phalaenopsis manni, gibbosa, lobbi, fuscata, cornucervi.) Hồ Điệp mọc khí hậu nhiệt đới đồi núi cao 2000m nên vừa chịu khí nóng ẩm vừa chịu khí hậu mát 2.1.2 Hình dáng Lan Hồ Điệp Hồ Điệp loài lan đơn thân, mập, ngắn to, dày mọc sát vào Đây giống gồm lồi có hoa lớn, đẹp Phát hoa mọc từ nách lá, dài, đơn hay phân nhánh, cánh hoa phẳng, trải rộng, hoa nở cái, đài to trịn, cánh xịa rộng kín Mơi cong, dẹp có râu dài Trụ có hình bán nguyệt với phân khối u lên chứa đầy phấn hoa Ngày nên Hồ Điệp lai tạo với nhiều màu sắc kích thướt đa dạng: trắng, tím, đỏ, vàng, hồng Hình 1: Hoa Lan Hồ Điệp 2.1.3 Điều kiện sinh thái 2.1.3.1 NHiệt độ độ ẩm - Hồ Điệp loại hoa nhiệt đới, nhiệt độ tối thiểu 22 0C- 250C ban ngày 180C vào ban đêm Tuy nhiên Hồ Điệp loại lan chịu nóng nhiều đa số lồi khác Cây phát triển tốt nơi có nhiệt độ cao 35 0C vào ban ngày 250C vào ban đêm Nhiệt độ lý tưởng để phát triển tốt 25 0C -270C Hồ Điệp phát triển quanh năm mùa nghĩ thuận lợi trổ hoa lúc thời tiết lạnh.( Ở Việt Nam thường nở hoa vào cuối tháng 12 1.) - Hồ Điệp chịu ẩm cao, tối thiểu 60% khơng chịu nước Làm gìan che phải che 70% nắng Ẩm độ phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam 2.1.3.2.Nhu cầu nước tưới - Hồ Điệp đơn thân nên khơng có giả hành để dự trữ dinh dưỡng nước Nước thường tập trung Vì Hồ điệp có lớn, diện tích tiếp xúc nhiều nên dễ nước Vào mùa nắng tưới lần/ngày: Sáng, trưa, chiều Chú ý tưới vào buổi trưa phải tưới thật đẩm để tránh nắng làm sốc lan Mùa mưa tuỳ theo điều kiện thời tiết mà tưới nước cho phù hợp tóm lại Hồ Điệp cần ẩm nhiếu nước 2.1.3.3 Ánh Sáng - Hồ Điệp cần ánh sáng yếu lồi ưa bóng mát, biên độ biến thiên rộng 5.000 – 15.000m/m2, ánh sáng cần 20%-30% đủ Tuy nhiên không trồng Hồ Điệp nơi răm mát ánh sáng cần cho sinh trưởng trổ hoa Ánh sáng khuyếch tán vừa phải tất tốt Nếu chiếu sáng 12h/ngày phát triển tốt Ở châu Âu Hồ Điệp trồng nhà kính có hệ thống làm mát, máy điều hịa nhiệt độ ánh sáng nhân tạo nên Hồ Điệp phát triển đồng đều, xanh tốt Thuận lợi cho việc điều khiển hoa đồng loạt 2.1.3.4 Độ thông thoáng - Rất cần thiết cho Hồ Điệp, Hồ Điệp hay bị bệnh thối nhũn (phõng lá), thông thống giúp mau khơ sau tưới rễ không bị úng nước nên hạn chế bệnh nhiều Ở nước ta vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh giọt mưa nặng hạt làm thối đọt Do để ngăn ngừa tình trạng nên dùng tắm tôn nhựa xanh để che Có số trường hợp trồng Hồ Điệp cao (Sân thượng) có hiệu Tuy nhiên gió nhiều mạnh dễ làm nước nhanh ta không cung cấp đủ héo rũ, nhăn 2.1.3.5 Dinh dưỡng - Hồ Điệp cần dinh dưỡng thường xun, quanh năm khơng có mùa nghỉ Khi tưới phân không nên tưới với nồng độ cao cà đừng tưới lên đọt, lúc non nhú từ đỉnh sinh trưởng Hồ Điệp cần phân bón tưới với nồng độ lỗng tưới nhiều lần tuần Có thể tưới thêm phân hữu như: bánh dầu 15ngày/lần, vitamin B1, kích thích rễ… - Cách tưới phân: + Cây 12 tháng tuổi dùng phân có cơng thức 30-10-10, sau dùng phân loại 20-20-20 18-18-18 lúc hoa Tuy nhiên vào mùa mưa tưới phân 30-10-10 thấy yếu mềm tăng cường lượng lân kali bằnng cách xen kẻ phân 20-20-20 18-18-18(dù con), để cứng cáp, tăng cường sức đề kháng sâu bệnh + Lúc trưởng thành (18-24 tháng tuổi) vào thời điểm cuối năm, thời tiết lạnh kích thích hoa cách tưới phân 10-30-30 đến bắt đầu nhú cành hoa ta trở lại tưới phân 20-20-20 lúc hoa nở tàn KHông nên để cành hoa lâu cây, nụ hoa cuối nở có 1,2 hao bắt đầu héo, ta nên cắt cành hoa bỏ để dưỡng sức cho Khi cắt cành hoa sớm mau sinh trưởng tốt để lần hoa sau mạnh 2.1.3.6 Sâu bệnh - Đối với phong lan, việc phòng bệnh quan trọng, bị bệnh khó trị làm chết Ngồi việc chăm sóc lan kỹ lưỡng đặn, tưới nưới dinh dưỡng cần phải tưới thêm thuốc trừ nấm bệnh nhằm tăng sức đề đề kháng cho Lan Hồ Điệp hay bị bọ trĩ chích tạo vết thương từ vi khuẩn xâm nhập gây bệnh thối nhũn Có thể dùng số loại thuốc để phòng trị Malathion, lannat…để phòng trị 2.1.3.7 Chậu, giá thể cách trồng - Cách trồng chung cho loại Hồ điệp chậu thật thống, có nhiều lỗ sử dụng chậu đất nung có nhiều lỗ hay chậu nhựa Chậu phải thật khơng có rêu bám thành chậu Thơng thường nhà vườn trồng lan với số lượng lớn (vài ngàn cây) thường dùng than, dớ, xơ dừa, mút… làm giá thể để trồng lan Hồ Điệp Có nhiều cách trồng lan HĐ tuỳ theo vùng Nhưng có điểm chung than, mút nằm đáy chậu, xơ dừa hay dớn nằm miệng chậu cách trồng giúp thóat nước tốt vào mùa mưa, khơng bị thối rễ phát triển tốt Trong thời gian khoảng năm ta thay chậu lần, lớn mau thay chậu sớm 2.2 Lịch sử phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật - Năm 1902, nhà thông thái Haberlant lần đưa ý tưởng cấy mơ sinh vật ngồi thể ơng dùng tế bào chuyên biệt nên không thành công -Năm 1934 White thành công việc phát sống vô hạn việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua -Năm 1964 Ball người tìm mầm rễ từ việc ni cấy chồi Ơng thành cơng việc chuyển non sen cạn tử môi trường nuôi cấy tối thiểu nhiên việc nhân giống chưc hịan chỉnh Sau nhiều nhà dinh dưỡng tìm thàng phần dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho phát triển tế bào nuôi cấy -Năm 1951 Skoog Miller phát hợp chất điều khiển nhân chồi -Năm 1962 Murashige va Skoog cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu tiến kỹ thuật nuôi cấy mô Môi trường họ dùng làm sở cho việc nuôi cấy nhiều loại sử dụng rộng rãi ngày -Năm 1960-1964 Morel cho nhân giống vơ tính lan nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Từ kết đó, lan xem ni cấy mơ thương mại hóa từ đến nay, cơng nghệ nuôi cấy mô tê bào thực vật phát triển với tôc độ nhanh nhiều khác ứng dụng thương mại hóa 2.2.1 Một số phương pháp nhân giống + Phương pháp học sử lý hóa chất: Phương pháp khơng tốn chi phí nhiều, thời gian dài, có khuyết điểm như: tạo số lượng ít, ko thể áp dụng trồng với qui mô lớn Phương pháp thường áp dụng trồng lan để chơi kinh doanh + Phương pháp gieo hạt lan môi trường dinh dưỡng: Phương pháp không phổ biến nhiều gieo hạt tạo số lượng lớn không đồng nhất, ko thể xác định màu sắc hình dáng hoa Phương pháp thường nhà nghiên cứu, lai tạo áp dụng muốn lai tạo giống + Phương pháp cấy mô môi trường thạch: Hiện phương pháp áp nhiều nước giới Ở Việt Nam nuôi cấy mô hoa lan chủ yếu phương pháp Phương pháp giúp cho ta tạo lượng lớn con, đồng nhất… cung ứng nguồn giống cho nhà vườn Tuy nhiên kỹ thuật nuôi cấy nước ta chưa đạt hiệu tốt nên chất lượng khơng cao Thường nhập từ nước Thái Lan, Đài Loan… + Phương pháp ni cấy lỏng: Có sục khí (Bioreactor) - Hiện nay, hầu hết hệ thống vi nhân giống thực hệ thống bình ni cấy khác có điểm mẫu cấy phát triển mơi trừơng đặc, thiết bị ni cấy có kích thướt nhỏ mơi trường ni cấy khơng đủ đáp ứng cho nhu cầu phát triển lâu dài củ mẫu cấy đồng thời lãng phí mơi trường không hấp thu hết chất dinh dưỡng phần đáy bình ni cấy - Khi ni cấy mơi trường lỏng mẫu cấy có khả tăng trưởng nhanh so với mơi trường Có thể mẫu cấy tiếp xúc hồn tồn mơi trường nên hấp thu tốt chất dinh dưỡng từ môi trường - Ngày nay, hệ thống nuôi cấy Bioreactor với cấu trúc bình lên men cách khấy kim loại thay ống silicon sục khí điều khiển tốc độ dịng khí vào để hạn chế tương tác bất lợi mẫu cấy, hạn chế tổn thương mẫu Do hệ thống Bioreactor sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau: Ni cấy chồi phôi thực vật, chồi thu hải đường, củ khoai tây bi invitro, hoa lily, số thân gỗ đặc biệt nuôi cấy thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học như: ni cấy rễ nhân sâm + Nuôi cấy quang tự dưỡng: Phương pháp gíao sư Kozai cộng đẩy mạnh nghiên cứu thập niên 90 Vi nhân giống cách có nhiều ưu điểm phương pháp truyền thống: Thúc đẩy tăng trưởng invitro, rút ngắn thời gian ni cấy làm hạ gía thành Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, đường không sử dụng mơi trường ni cấy, khơng có chất điều hòa tăng trưởng thực vật, vitamin, amino acid, ngoại trừ chất không đưa vào môi trường Sở dĩ chúng sử dụng CO2 làm nguồn carbon q trình quang hợp mà khơng cần đường Nồng độ CO2 ánh sáng hai yếu tố quan trọng nuôi cấy quang tự dưỡng với quan diệp lục tố + Nuôi cấy hệ thống ngập chìm tạm thời - Nguyên lý hoạt động hệ thống đơn giản Trong bình kín, chồi ngập dung dịch dinh dưỡng khoảng vài phút, dung dịch sau dó rút cạn cách tự động chu kỳ ngập khô lập lập lại đặn 6h nhờ máy bơm khơng khí lập trình từ trước tồn hệ thống hoạt động khép kín khử trùng, tránh ngoại nhiễm trình thao tác Mặc khác bơm khơng khí vào hệ thống nên ta điều tiết thành phần khơng khí, tạo nên môi trường tối ưu cho mâm Trong bình 1lít tạo hàng trăm chồi lan Hồ Điệp khoẻ mạnh sau 3-6 tháng Phương pháp có nhiều ưu điểm như: tạo nguôn mẫu in-vitro dồi nhờ hệ số nhân mẫu cấy cao, tạo mơi trường thống khí, khỏe mạnh, tỉ lệ sống cao, gỉam tỉ lệ nhiễm, giảm chi phí nhân cơng, rút ngắn thời gian… 2.2.2 Quy trình ni cấy: Gồm giai đoạn (g/đ) - G/đ 1: Chọn lựa khử trùng mẫu cấy - G/đ 2: Tạo thể nhân giống invitro - G/đ 3: Nhân giống invitro - G/đ 4: Tái sinh invitro hoàn chỉnh - G/đ 5: Chuyển invitro vườn ươm 54 Hình 2: Quy trình nhân giống 2.2.2.1 Chọn lựa khử trùng mẫu cấy - Mẫu cấy chồi bên mang đỉnh sinh trưởng, đặt vào môi trường nuôi cấy Mẫu khử trùng cồn 70%, sau đem rửa nước cất vô trùng, ngâm vào dd Ca(Cl)2 2% 25’ mẫu rửa lại nước cất vô trùng 4-5 lần mẫu đĩa petri cô trùng & cẩn thận tách chồi non Sau lần tách cần nhúng mẫu vào cồn 70% 1s & rửa nước cất vơ trùng Sau cắt đỉnh sinh trưởng khỏi mẫu cấy & cấy vào mơi trường dinh dưỡng (Mơi trường MS có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng) 2.2.2 Tạo thể nhân giống nhân giống inviro - Từ 4-8 tuần đỉnh sinh trường nuôi môi trường dinh dưỡng thích hợp phát triển có màu xanh lục & tạo khối tròn gọi thể chồi Tiến hành cắt thể chồi thành 4-6 miếng chuyển sang môi trường phát triển chồi Ở thể chối tiếp tục phát triển thành chồi nhờ chất kích thích tạo chồi 2.2.2.3 Tái sinh invitro hoàn chỉnh - Đây giai đoạn tạo hồn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để chuẩn bị đem vườn ươm Các thể chồi đưa sang môi trường tạo rễ ( chứa nhiều auxin) Điều kiện nuôi cấy gần giống với môi trường bên ngồi, giúp thích nghi tốt sau chuyển vườn ươm.Giai đoạn khoảng 4-5 tháng để từ thể chồi → 2.2.2.4 Chuyển invitro vườn ươm - Cây cao khoảng 4-5cm, rễ phát triển đầy đủ chuyển vườn ươm Cây lấy khỏi ống nghiệm, rửa agar đặc chậu có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp để thích nghi từ từ Sau khoảng tuần quen với điều kiện bên ngồi lúc tăng cường độ chiếu sáng hạ độ ẩm Giai đoạn thường bị chết nhiều khác biệt môi trường nhân tạo tự nhiên Để hạn chế cần phải giữ ẩm tốt cho phun sương nhiều lần tưới thuốc rễ giúp mau thích nghi (4) cung cấp khơng khí đến vịi phun (5) Chuyển dịch tế bào qua sử lý Khi tất cửa hoạt động bioreactor dạng hoạt động liên tục Nhưng cửa (2) (4) (khơng khí vào, tách biệt) mở [ nhữnng cửa lại, nghĩa cửa (1),(3),(5) bị đóng], bioreaction đến dạng hoạt động theo gián đoạn 2.3.3.2 Bioreactors dạng liên tục: Trong Bioreactor dạng này, dòng dung dịch liên tục vào suốt nguyên trình Một bioreactor lọc ly tâm ví dụ tốt bioreactor liên tục, có đặc điểm sau: Trục trung tâm bioreactor lọc ly tâm cho phép loại bỏ môi trường sử dụng khơng có tế bào, xun qua trục Hai nam châm trục trung tâm giúp cho khuấy liên tục; lọc ly tâm tham gia khuấy cho dịch nuôi cấy Sự nuôi cấy làm thơng khí vịi phun cho phép tốc độ thơng thống phạm vi rộng Một cửa cung cấp để thêm môi trường vào Trong khi, cửa khác dùng để chuyển dịch nuôi cấy (thường dịch tế bào) cần thiết Bioreactor dạng cung cấp hệ thống có tính đa cao để điều khiển mức độ biến đổi dung dịch khối lượng riêng tế bào; biến đổi đường để dung dịch có chúng cho tế bào qua Một bioreactor dòng liên tục dùng cho phát triển tế bào khối lượng riêng đặc biệt tế bào hoạt động phát triển phase 2.3.3.3 Bioreactor nhiều giai đoạn: Hệ thống nuôi cấy dạng sử dụng nhiều bioreactor quy trình đặc biệt loại mang bước tồn quy trình (Fig 6) Hình 5: Bioreactor dạng truyền dung dịch cho phép dung dịch tuần hoàn biến đổi đặn; điều đạt dịch chuyển đặn dung dịch qua lọc ly tâm( cửa 3; Fig.5) thêm dung dịch vào cửa dẫn dung dịch (1) Dạng Bioreactor truyền dung dịch biến đổi dung dịch thành dạng khác cần thiết cho hệ thống nuôi cấy Dạng đơn giản gồm bioreactors Dùng để sản xuất chế phẩm sinh học shikonin, hoạt động gián đoạn: bioreactors cung cấp điều kiện cho sinh sôi nhanh tế bào sản sinh sinh khối thuận lợi, bioreactor thứ tạo điều kiện cho shikonin sinh tổng hợp tích lũy Sinh khối tế bào thu từ bioreactor bậc sử dụng inoculum cho bioreactor thứ hai Tương tự, cho mơ hình sản xuất phơi soma lớn, phản ứng dạng liên tục dạng gián tiếp Phản ứng liên tục bậc cung cấp điều kiện cần thiết cho sản sinh nhanh phôi tế bào (nhưng ko cho phát triển phôi soma) Sinh khối tế bào bioreactor xử lí nguồn liên tục inoculum cho bậc thứ hai dạng gián tiếp tạo điều kiện cần thiết cho phôi phát triển trưởng thành ( tế bào ko sinh sôi) Bioreactor liên tục bậc tránh thời gian, lao động giá cần cho việc vệ sinh vv… với bioreactor gián đoạn lần chạy; loại trừ phase lag ni cấy, cung cấp tính đồng phát triển tế bào tổng thể Tuy nhiên, nuôi cấy liên tục, giai đoạn chạy dài, nguy nhiễm cao nuôi gián đoạn 2.3.3.4 Bioreactor cố định tế bào: Những bioreactor dựa tế bào không bị giữ lại gel agarose, agar, chitosan, gelatine, gellan, polyacrylamide and calcium alginate to produce beads, màng tế bào phận trục kim loại ( thép không ghỉ) Một phiên đơn giản dựa kim loại hình (Fig.7) - Màng chắn hình trụ chứa tế bào giữ buồng mà dung dịch tuần hồn - Dịng mơi trường chạy song song với trụ khuyếch tán qua qua thành khối tế bào - Tương tự, sản phẩm khuyếch tán từ tế bào vào môi trường trụ Tấm chắn/ vỏ buồng tế bào hình trụ tấm, di chuyển mơi trường có thể điều chỉnh thành dòng băng qua màng chắn buồng song song với - Quy trình tinh thành phẩm - Môi trường thường xuyên thêm vào đương lượng thể tích mơi trường rút khỏi buồng tuần hoàn để giữ chất dinh dưỡng Sự cố định tế bào thay đổi chức sinh lý chúng tế bào dịch huyền phù Kỹ thuật có ích nơi mà chất sinh hóa có lợi tiết Hình 6: tế bào để vào mơi trường Sản phẩm tiết tạo cố định nó, xử lý thay đổi pH, sử dụng DMSO (dimethyl sulfoxide) thành tác nhân permealizing, thay đổi nồng độ ion môi trường v.v Những phản ứng cố định tế bào có lợi sau: Khơng có nguy tế bào thất thoát Nguy nhiễm xảy chậm Bảo vệ tế bào từ di chuyển chất lỏng Kiểm sốt tốt kích thước tổng thể tế bào Sự phân tách phase phát triển (trong bioreactor gián đoạn liên tục) từ trình sản xuất (trong bioreactor cố định tế bào) Tế bào thừa loại bỏ từ hệ thống cách đặn Và, nuôi cấy tế bào mật độ cao IV Một vài dạng bioreactor khác: Hình 8: Cấu tạo Bioreactor Cấu tạo máy bioreactor: - Các thùng có cánh khuấy motor biết nhiều dễ điều chỉnh - Thùng cánh khuấy có tác dụng dẫn khí vào nồi lên men thường để sản xuất sinh khối - Hệ thống cánh khuấy tự hút khí nhờ tốc độ khuấy lớn - Hệ thống phá bọt : bọt vấn đề nồi lên men hiếu khí Các chất hóa học dung để phá bọt khơng phải lúc dung ức chế trình lên men Bọt phá hủy bẳng phương pháp học Môi trường dinh dưỡng chứa bọt chảy ngược phía nồi lên men Hình 9: Kiểu hình chemotast Trong q trình ni cấy theo kiểu gián đoạn gặp nhược điểm mơi trường thay đổi tới giai đoạn phát triển khác vi sinh vật nên chất giảm dần, sản phẩm hình thành đồng thời sinh nhiều sản phẩm độc tố Để khắc phục nhược điểm người ta đưa liên tục mơi trường dinh dưỡng vào bình ni cấy đồng thời loại bỏ chất cặn bã Đây phương pháp sở nuôi liên tục Chemostat Turbidostat Chemostat bình ni cấy, dung dịch dinh dưỡng từ bình dự trữ chảy vào với tốc độ khơng đổi Nhờ thong khí cánh khuấy học bình ni cấy cung cấp đầy đủ oxi đảm bảo cho việc cung cấp nhanh đồng chất dinh dưỡng dịng mơi trường vào Dịch cặn bã rút khỏi bình cách thích hợp Đặc biệt sinh trưởng vi sinh vật điểu chỉnh nồng độ chất Hình 10: Cấu tạo Bioreactor Turbiodostat Turbidostat: 1.Bình mơi trường dự trữ(200l) 2.Bơm 3.Rơle 4.Điện trở phụ thuộc ánh sáng 5.Bộ lọc 6.Bình lên men( 80l) Bóng đèn huỳnh quang 80W Bình chứa để thu nhận dịch sau lên men Hoạt động vào việc trì mật độ vi sinh vật không đổi Tế bào quang điện đo độ đục điều chỉnh mơi trường vào bình qua hệ thống rơle Trong bình ni cấy tất chất dinh dưỡng nồng độ dư thừa vi sinh vật sinh trưởng với tốc độ gần cực đại Nếu mật độ tế bào tăng giá trị cần thiết hệ số pha lỗng tăng phần tế bào dư thừa bị loại 2.4 Các yếu tố ảnh hường đến môi trường nuôi cấy 2.4.1 Ảnh hưởng mẫu cấy -Mẫu cấy có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh truởng phát triển in-vitro + Kiểu di truyền: Nếu loài dễ tái sinh tự nhiên dễ tái sinh invitro.Những hai mầm tái sinh mạnh mầm + Tuổi + Tuổi mô quan: Những mô non mềm thường dễ nuôi cấy mô cứng Các mẫu lấy từ cuống non tái sinh tốt mẫu cấy từ cuống già quan chúng già nên khả tái sinh phân chia tế bào giảm + Tình trạng sinh lý: Thông thường phận giai đoạn sinh trưởng dễ tái sinh giai đoạn sinh sản Các chồi giai đoạn ngủ đơng khó ni cấy in-vitro chồi vượt qua giai đoạn +Vị trí mẫu cấy cây:Những chồi tách từ vị trí thấp phát triển môi trường in-vitro tốt chồi gốc tăng trưởng nhanh Tuy nhiên mơ sẹo phát sinh từ mẫu cấy có nguồn gốc từ phần khác rễ, chồi, cuống có phản ứng in-vitro giống + Kích thướt mẫu cấy: Mẫu cấy có kích thướt lớn dễ tái sinh phát triển Đối với phần mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt tổn thương ảnh hưởng đến khả tái sinh + Vết thương: Sự tổn thương mặt mẫu cấy đóng vai trị quyan trọng tái sinh mẫu cấy Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng thấp thu chất dinh dưỡng chất điều hòa đồng ethylene tạo nhiều 2.4.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy - Thành phần mơi trường có vai trị quan trọng tăng trưởng phát sinh hình thái tế bào mô thựuc vật Môi trường nuôi cấy thay đổi tuỳ theo giai đoạn phát triển mẫu cấy Tuy nhiên mơi trường cần phải có đủ thành phần: Khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường chất điều hịa tăng trưởng 2.4.2.1 Khống đa lượng: Nhu cầu khống mơ, tế bào thực vật không khác nhiều so với trồng tự nhiên Trong nhóm gồm ngun tố chính:N P L + Đạm (N) giữ vai trò tạo lập Protein cho cây, giúp hình thành quan, thân rễ phát triển, quang tổng hợp mạnh Thiếu đạm màu nhợt nhạt, ốm yếu, sinh trưởng kém, cần cổi… Để cung cấp N ta dùng chất sau: CO(NH2)2 : Hay urê (46% N) (NH4)2S04: Sulfat Ammonium tức SA (22% N) KNO3 : Kali Nitrat (14% N) NH4NO3 : Nitrat Ammonium (30% N) Na NO3: Natri Nitrat Ca(NO3)2 : Calci nitrat +Lân (P) : Giúp hô hấp qunag hợp, tạo hấp thu đạm dễ dàng Lân giúp hoa , rễ, kích thích hoa, làm hoa bền rụng… Các chất cung cấp Lân: Super Lân (20% P2O5):) (NH4)2HP04: Diamonium Phosphat DAP (54% P2O5) (NH4)3 HPO4.3H20: Trianium Phosphat KH2 PO4: Phosphat kali + Kali (K) : Tạo bó mạch cây, giúp cứng cáp, , đứng thẳng, giúp hoa… Các chất cung cấp K như: KCl: Clorua kali (60% K2O) K2SO4: Sulfat kali (48% K2O) KNO3: Kali natri (44% K2O) KH2PO4: Phosphat (40% K2O) 2.4.2.2 Nhóm bán đa lượng Gồm nguyên tố: Ca, Mg, S + Calcium (Ca): tạo vách tế bào, giúp cứng chắc, dầy…Các chất cung cấp Ca như: CaCl2 (Calci Clorua), Ca(NO3)2 (Calci nitrat) Đối với chất chứa Ca khơng nên hịa tan với chất khác dễ gây kết tủa, khơng hấp thu hiệu + Magnesium (Mg) Thành phần tạo nên diệp lục tố cho cây, làl phát triển, xanh Có thể dùng MgSO4 hay MgHPO4 để cung cấp Mg cho + Sulfur (S) Là thành phần tế bào chấtm giúp tăng trưởng Thiếu S cằn cổi nhỏ Thưùơng S có chứa sẵn chất có gốc SO4 như: K2SO4, MgSO4, MgHP04… 2.4.2.3 Nhóm vi lượng Nhóm cần thiết cho lan lan cần (khơng qú 5mg/lít) Một số nguyên tốp vi lượng như: Bo, Zn, Cu, Mo,Mn, Fe… + Sắt (Fe): Dóng vai trị tạo dịp tố, gíup quang tổng hợp tốt, thiếu sắt làm có màu xanh lợt, đầu rễ phát triển dùng FeADTA để cung cấp Fe cho + Đồng (Cu) Thiếu đồng dễ làm khô, không phát triển, chồi nhiều.Dùng CuSO4 để cung cấp cho + Kẽm(Zn): Thiếu Zn làm thân ngắn lại, mọc chụm đầu Có thể dùng ZnSO4 để cung cấp Zn cho + Mangan(Mn) : Thiếu mangan vàng nhạt, già thường có vhấm vàng Dùng MnSO4 để cung cấp Mn cho + Molyden: (Mo) Điều hịa tăng trưởng Có thể dùng Na2Mo04 (Molypdat Natri) để cungcấp Mo cho 2.4.2.4 Carbon nguồn lượng Trong nhân giống invitro nguồn carbon thường dùng glucose sucrose Sucrose nguồn carbon quan trọng mô tế bào ni cấy Nồng độ sucrose ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng sản lượng hợp chất tế bào nuôi cấy 2.4.3 Vitamin: Các vitamin cần thiết cho phát triển tăng trưởng thực vật vitamin súc tác q trình biến dữỡng khác Các vitamin thuờng dùng nuôi cấy mô là: Thiamine(B1) acid nicotinic, Pyridoxine (B6) Myo- inositol B5, B12 Trong B1 dùng phổ biến việc tạo chồi, rễ, trồng tưới bổ sunug B1 tốt 2.4.4 Các chất điều hịa sinh trưởng: Chủ yếu có chất quan trọng nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin(GA3) Cytokinin, Abscisic acid ethylen + Auxin tự nhiên hợp chất đơn giản: indol-3- acetic acid (IAA) Auxin kết hợp cới cytokinin giúp tăng trưởng chồi non khởi phát tạo mô phân chồi từ nhu mơ + Cytokinin loại hormone thực vật kích thích tế bào phân chia Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, tỉ lệ Auxin/Cytokinin (A/C) cao giúp tạo tạo rễ, A/C thấp tạo chồi Ngoài hợp chất bổ sung chất hưu như:( amino acid, EDTA.) + Các chất hữu không xác định: Protein hydrolysate, nước dừa, dịch nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối nước cam… + Than hoạt tính: Có tác dụng khử độc + Yếu tố làm đặc môi trường: Thường sử dụng agar Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu: Phát hoa lan Hồ Ðiệp thu hoa nở hết cành Chọn phát hoa to khoẻ, cắt đốt chứa mắt ngủ dài cm, tách bỏ vỏ bao quanh mắt ngủ Tình trạng mắt ngủ phải trắng xanh hay đỏ màu phát hoa, loại bỏ mắt ngủ bị hoá đen bị trày sướt 3.1.1 Tiến hành khử trùng: - Lau nhẹ mắt ngủ cồn 70o - Tiến hành lắc với xà phịng lỗng phút rửa lại nước để loại bỏ hết xà phòng - Trong tủ cấy, mẫu ngâm cồn 70o phút, sau khử trùng với dung dịch javel có nồng độ 1: 25 phút - Tiến hành rửa lại mẫu nước cất vô trùng (3 lần) - Loại bỏ hoại tử, cấy mẫu lên mơi trường MS có bổ sung BA mg/l Điều kiện nuôi cấy: mẫu nuôi cấy đặt điều kiện: 25 oC, 12 chiếu sáng ẩm độ 80% Sau 10 tuần nuôi cấy, chồi sinh dưỡng hình thành từ mắt ngủ phát hoa mang non đủ rộng để làm nguyên liệu khởi tạo PLB từ mơ Hình 11: Thể chồi lan cấy mơ Sự hình thành chồi sinh dưỡng từ phát hoa 3.1.2Khởi tạo PLB từ mô Các mẫu thu từ chồi sinh dưỡng cắt theo kích thước x mm Các mẫu đặt nuôi môi trường MS 1/2 bổ sung chất điều hoà sinh trưởng thực vật NAA 1mg/l, BA 10 mg/l, Adenin 10 mg/l Sau 10 tuần nuôi cấy: - Các PLB hình thành chủ yếu từ mảnh phần gốc mảnh phần đỉnh Lá thân có nét giống hình thái giải phẫu khác cách sinh trưởng cách xếp mơ Lá có sinh trưởng tận hữu hạn Do đó, để có phát sinh hình thái mới, đỉnh cần phải có phân hố tế bào nhu mô để trở trạng thái mô phân sinh - Sau thời gian, chồi xuất xung quanh mép (nơi có vết thương) tiếp tục phát triển phần mô ban đầu bị hoại Phiến ban đầu sử dụng nguồn dinh dưỡng khởi đầu cho PLB cho chồi sau hệ thống mạch chồi hình thành hồn tồn độc lập với hệ thống mạch mơ mẹ Hình 12: Cụm chồi Sự tạo PLB từ mô 3.1.3 Sự tái sinh chồi từ PLB Theo nhiều tác giả tái sinh thành từ PLB cần sử dụng môi trường khống có bổ sung nước dừa, peptone, khoai tây…mà khơng sử dụng chất điều hòa tăng trưởng Tanaka Sakanishi (1985) Tanaka (1987) sử dụng môi trường Knudson C cải tiến, môi trường Hyponex cải tiến, cịn Haas- von Schmude (1983,1985) sử dụng mơi trường MS việc tái sinh từ PLB Griesbach (1983) sử dụng môi trường Murashige Skoog cho việc tái sinh từ PLB, Lin (1986) sử dụng mơi trường Knudson C cải tiến có bổ sung BA (1 mg/l) để chuyển PLB thành 3.1.4 Sự rễ Thông thường chồi tái sinh từ PLB rễ phát triển mạnh mơi trường có bổ sung nước dừa, chuối, khoai tây… mà khơng cần chất điều hịa tăng trưởng hết Tuy nhiên, việc tùy thuộc vào giống Có giống dễ đẻ chồi nách làm chồi phân nhánh khơng phát triển rễ được, nhỏ, thân chồi kéo dài, vậy, chồi thường tồn dạng cụm chồi Để khắc phục điều này, cấy chồi riêng lẻ lên mơi trường có hormone tăng trưởng IBA với nồng độ 0.5-1 mg/l, chồi rễ dài, to Sau 3-4 tháng nuôi cấy đem trồng ngồi ườn ươm Hình 13: Lan ni máy Bioreactor Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Như từ mô hoa lan nuôi cấy để tạo từ 3-4 chuyển vườn trồng khoảng 8-11 tháng Với việc nhân giống vơ tính đảm bảo tạo có đặc tính hồn tồn giống cha mẹ, khơng bị nhiễm bệnh, ... sau dùng phân loại 20-20-20 18- 18- 18 lúc hoa Tuy nhiên vào mùa mưa tưới phân 30-10-10 thấy yếu mềm tăng cường lượng lân kali bằnng cách xen kẻ phân 20-20-20 18- 18- 18( dù con), để cứng cáp, tăng... Sakanishi (1 985 ) Tanaka (1 987 ) sử dụng môi trường Knudson C cải tiến, mơi trường Hyponex cải tiến, cịn Haas- von Schmude (1 983 ,1 985 ) sử dụng môi trường MS việc tái sinh từ PLB Griesbach (1 983 ) sử dụng... cấp K như: KCl: Clorua kali (60% K2O) K2SO4: Sulfat kali ( 48% K2O) KNO3: Kali natri (44% K2O) KH2PO4: Phosphat (40% K2O) 2.4.2.2 Nhóm bán đa lượng Gồm nguyên tố: Ca, Mg, S + Calcium (Ca): tạo