(LUẬN văn THẠC sĩ) xác định các gen alen đặc thù liên quan đến sự phát triển bộ rễ của các giống lúa việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHÙNG THỊ PHƢƠNG NHUNG XÁC ĐỊNH CÁC GEN - ALEN ĐẶC THÙ LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÁC GIỐNG LÚA VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền Chọn giống trồng Mã số: 62 01 11 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Đỗ Năng Vịnh GS.TS Pascal Gantet NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, kết nghiên cứu đƣợc trình bày luận án trung thực, khách quan chƣa đƣợc sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án đƣợc cám ơn, thơng tin trích dẫn luận án đƣợc ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Phùng Thị Phƣơng Nhung i download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Tác giả luận án xin trân trọng cảm ơn: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý Đào tạo, Khoa Nông học, Bộ môn Di truyền Chọn giống trồng; Viện Di truyền Nông nghiệp, Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Phịng Thí nghiệm Liên kết Việt - Pháp (LMI - Rice); Trung tâm Tài nguyên Thực vật; Trung tâm Hợp tác Quốc tế Nghiên cứu Nơng nghiệp Phát triển (CIRAD - Pháp), tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn: Học bổng GRiSS - Chƣơng trình Đối tác Nghiên cứu Lúa gạo Toàn cầu (GRiSP), Trung tâm Hợp tác Quốc tế Nghiên cứu Nơng nghiệp Phát triển (CIRAD - Pháp),Viện Nghiên cứu Phát triển (IRD - Pháp), “Chƣơng trình Trọng điểm Phát triển Ứng dụng Công nghệ sinh học lĩnh vực Nông nghiệp PTNT đến năm 2020” - Bộ Nông nghiệp Phát triển Nơng thơn Việt Nam, tài trợ kinh phí cho phần nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: GS.TS Đỗ Năng Vịnh, GS.TS Pascal Gantet ngƣời thầy bảo, định hƣớng khoa học cho nghiên cứu tôi, hƣớng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án Xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tơi đến TS Brigitte Courtois, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, tập huấn cho tơi kỹ phân tích hệ gen, phân tích đa dạng di truyền, sử dụng phần mềm tin sinh học tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực tập tơi CIRAD - Pháp Tôi xin chân thành cảm ơn: Các thầy cô, đồng nghiệp quan tâm, giúp đỡ, động viên đóng góp nhiều ý kiến cho việc hồn thành luận án này; Các cộng tác viên, kỹ thuật viên, Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Phịng Thí nghiệm Liên kết Việt - Pháp, Viện Di truyền Nông nghiệp; Bộ môn Quản lý Ngân hàng gen - Trung tâm Tài nguyên Thực vật; Phòng Nghiên cứu Di truyền - CIRAD - Pháp, giúp đỡ tơi q trình làm thí nghiệm hồn thành luận án Đặc biệt, tơi xin chân thành cảm ơn thành viên gia đình, ngƣời thân, bạn bè tạo điều kiện giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình tơi thực hoàn thành luận án Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Phùng Thị Phƣơng Nhung ii download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận án ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Vai trò đặc điểm rễ lúa 2.1.1 Vai trò rễ lúa 2.1.2 Đặc điểm cấu trúc rễ lúa 2.1.3 Đặc điểm phát triển rễ lúa 10 2.2 QTLs gen liên quan đến phát triển rễ lúa 12 2.2.1 Các QTLs liên quan đến phát triển rễ lúa 12 2.2.2 Các gen liên quan đến hình thành phát triển rễ lúa 16 2.3 Nguyên lý ứng dụng GBS 24 2.3.1 Phƣơng pháp giải trình tự NGS – tảng GBS 24 2.3.2 Nguyên lý phƣơng pháp GBS 28 2.3.3 Các ứng dụng GBS chọn giống trồng 33 2.4 Nguyên lý ứng dụng GWAS 35 2.4.1 Nguyên lý 35 2.4.2 GWAS công cụ hữu hiệu 36 2.4.3 Các bƣớc xây dựng nghiên cứu GWAS 38 2.4.4 Ý nghĩa tiềm GWAS chọn tạo giống lúa 42 2.5 Nguồn gen lúa tình hình nghiên cứu rễ lúa Việt Nam 44 2.5.1 Nguồn gen lúa Việt Nam 44 2.5.2 Tình hình nghiên cứu đặc điểm rễ lúa Việt Nam 45 Phần Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 48 3.1 Địa điểm nghiên cứu 48 iii download by : skknchat@gmail.com 3.2 Thời gian nghiên cứu 48 3.3 Vật liệu nghiên cứu 49 3.4 Nội dung nghiên cứu 49 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 51 3.5.1 Đánh giá đặc điểm nông sinh học 51 3.5.2 Chiết tách ADN tổng số 52 3.5.3 Phân tích đa dạng di truyền thị DArT 52 3.5.4 Phân tích kiểu gen thơng qua giải trình tự (GBS) 55 3.5.5 Phân tích cấu trúc di truyền tập đồn mẫu giống nghiên cứu 56 3.5.6 Xác định mức độ phân rã Linkage Disequilibrium 57 3.5.7 Phƣơng pháp đánh giá kiểu hình rễ 57 3.5.8 Lập đồ liên kết (GWAS) 60 3.5.9 Phƣơng pháp xác định gen ứng viên 61 Phần Kết thảo luận 62 4.1 Đặc điểm sƣu tập giống lúa 62 4.1.1 Đặc điểm thu đƣợc qua thông tin hồ sơ mẫu giống 62 4.1.2 Đặc điểm nông sinh học 63 4.2 Kết phân tích đa dạng di truyền với thị DART 68 4.2.1 Kết phân tích đa hình cấu trúc di truyền 68 4.2.2 Xây dựng phân loại cho mẫu giống lúa nghiên cứu 69 4.3 Kết phân tích kiểu gen thơng qua giải trình tự (GBS – Genotyping By Sequencing) 72 4.3.1 Kết phân tích đa hình cấu trúc di truyền với SNPs marker 72 4.3.2 Đặc điểm mẫu giống lúa phân nhóm khác 75 4.3.3 Kết phân tích Linkage Disequilibrium (LD) 82 4.4 Kết đánh giá kiểu hình tính trạng liên quan đến phát triển rễ mẫu giống nghiên cứu 86 4.4.1 Kết phân tích phƣơng sai thống kê 86 4.4.2 Kết phân tích thành phần cho tính trạng nghiên cứu 97 4.5 Kết phân tích liên kết tồn hệ gen (GWAS) 100 4.5.1 Các QTLs liên kết với tính trạng liên quan đến phát triển rễ 100 4.5.2 Các gen ứng viên liên quan đến đặc điểm phát triển rễ 113 4.5.3 Điểm đặc biệt vùng QTLs liên kết với NCR NST số 11 119 Phần Kết luận kiến nghị 129 5.1 Kết luận 129 5.2 Kiến nghị 130 Danh mục cơng trình cơng bố liên quan đến luận án 131 Tài liệu tham khảo 132 iv download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ADN AFLP ANOVA bp Tiếng Anh Deoxyribonucleic acid Amplified Fragment Length Polymorphism Analysis of Variance Base pair Chr cM Chromosome Centimorgan DAPC DArT Discriminant Analysis of Principal Components Diversity Array Technology GBS Genotyping By Sequencing GLM General Linear Model GWAS Genome-wide Association Studies kb LD MAF Mb MLM Kilo base pair Linkage Disequilibrium Minor Allele Frequency Megabase pair Mix Linear Model NGS Next Generation Sequencing NILs PCA PCR PIC Near Isogenic Lines Principal Component Analysis Polymerase Chain Reaction Polymorphism Information Content Quantitative Trait Loci Radnom Amplified Polymophism DNA Restriction Fragment Length Polymorphism Recombinant Inbred Lines Single Nucleotide Polymorphism Simple Sequence Repeats QTLs RAPD RFLP RILs SNP SSR Tiếng Việt Axit deoxyribonucleic Đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc Phân tích phƣơng sai Đơn vị đo độ dài ADN/ARN theo số cặp nucleotide (1bp = cặp nucleotide) Nhiễm sắc thể Đơn vị đo khoảng cách locus NST, 1cM = 1% tần số trao đổi chéo locus Phân tích phân biệt thành phần Cơng nghệ phân tích đa dạng mảng Phân tích kiểu gen thơng qua giải trình tự Mơ hình hồi quy tuyến tính tổng quát Nghiên cứu lập đồ liên kết toàn hệ gen 1kb =1000 bp Sự cân liên kết Alen có tần số nhỏ 1Mb = 1000 kb Mơ hình hồi quy tuyến tính hỗn hợp Cơng nghệ giải trình tự hệ Dịng đẳng gen Phân tích thành phần Kỹ thuật nhân ADN Hàm lƣợng thơng tin đa hình Locus tính trạng số lƣợng Đa hình đoạn ADN đƣợc nhân ngẫu nhiên Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn Dịng tái tổ hợp Đa hình nucleotide đơn Đa hình đoạn lặp đơn giản v download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG TT 3.1 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16 Tên bảng Trang Các giống lúa đƣợc dùng để xây dựng thƣ viện DArT markers 54 Phân nhóm mẫu giống theo thời gian sinh trƣởng 64 Phân nhóm mẫu giống theo số nhánh hữu hiệu 65 Đặc điểm hình dạng hạt mẫu giống lúa Việt Nam sƣu tập giống nghiên cứu 67 Chỉ số FST phân nhóm mức ý nghĩa P-value 75 Đặc điểm phân nhóm hai nhóm giống thuộc lồi phụ indica japonica 81 Sự phân rã LD 12 nhiễm sắc thể nhóm giống indica japonica 83 Kết phân tích ANOVA hệ số di truyền theo nghĩa rộng tính trạng nghiên cứu 87 Các giá trị thống kê tính trạng liên quan đến đặc điểm phát triển rễ mẫu giống nghiên cứu 88 Giá trị thống kê tính trạng nghiên cứu theo nhóm giống indica (ind) japonica (jap) 91 So sánh giá trị trung bình tính trạng phân nhóm thuộc nhóm giống indica japonica 94 Hệ số tƣơng quan tính trạng theo dõi tập đồn riêng cho nhóm giống indica japonica 95 Danh sách QTLs xác định đƣợc với P-value < 1E-04 tập đồn hai nhóm giống indica japonica 102 Các QTLs liên kết với nhiều tính trạng nghiên cứu tập đồn hai nhóm mẫu giống thuộc lồi phụ indica japonica 111 Danh sách gen ứng viên đƣợc khẳng định vai trò chức phát triển rễ 115 Các giống lúa có kiểu hình tƣơng phản haplotype khác biệt vùng QTLs liên kết chặt với tính trạng NCR NST số 11 122 Danh sách gen nằm vùng QTLs liên kết chặt với tính trạng NCR NST số 11 125 vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang 2.5 2.6 Thành phần rễ cấu trúc nên rễ lúa Cấu trúc xuyên tâm rễ lúa Tổ chức mơ theo chiều dọc mơ hình phân chia tế bào rễ lúa 10 Số lƣợng QTLs liên kết với đặc điểm rễ lúa vùng nhiễm sắc thể 14 Các bƣớc giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger (a) NGS (b) 27 Các bƣớc q trình thực GBS 29 2.7 3.1 3.2 3.3 So sánh phƣơng pháp xác định QTLs truyền thống GWAS 37 Sơ đồ tổng quát trình thực nội dung nghiên cứu 50 Sơ đồ bƣớc thực phân tích đa dạng di truyền với DArT 53 Các tiêu vị trí thu thập số liệu tính trạng liên quan đến 2.1 2.2 2.3 2.4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 phát triển rễ giống nghiên cứu 59 Đặc điểm phân bố 214 mẫu giống lúa Việt Nam sử dụng làm vật liệu nghiên cứu 63 Biểu đồ tần số phân bố mẫu giống lúa theo chiều cao 66 Tỷ lệ số lƣợng mẫu giống chia theo tính chất nội nhũ 67 Thành phần kiểu gen mẫu giống nghiên cứu 69 Cây phân loại di truyền 270 mẫu giống với 241 DArT marker 70 Phân bố GBS marker 12 nhiễm sắc thể hàm lƣợng thơng tin đa hình (PIC) chúng ma trận haplotype chuẩn bị cho nghiên cứu GWAS 73 Các phân nhóm nhóm mẫu giống thuộc loài phụ indica 77 Các phân nhóm nhóm mẫu giống thuộc lồi phụ japonica 80 Sự phân rã LD theo khoảng cách vật lý cặp marker 12 NST nhóm giống indica 84 Sự phân rã LD theo khoảng cách vật lý cặp marker 12 NST nhóm giống japonica 85 Hình ảnh biểu diễn mối tƣơng quan thân rễ 194 mẫu giống tập đoàn sử dụng phần mềm RASTA 89 Tần số phân bố số tính trạng nghiên cứu hai nhóm loài phụ indica japonica 93 Vòng tròn tƣơng quan xây dựng phân tích thành phần (PCA) cho tính trạng nghiên cứu 98 Phân bố giống lúa tập đoàn nghiên cứu mặt phẳng PCA dựa liệu kiểu hình tính trạng nghiên cứu 99 vii download by : skknchat@gmail.com 4.15 Hình biểu diễn QQ-Plot cho tập đồn hai nhóm giống thuộc lồi phụ indica japonica 101 4.16 Manhattan Plot tính trạng số lƣợng rễ (NCR) tập đồn hai nhóm mẫu giống thuộc loài phụ indica japonica 107 4.17 Manhattan Plot tính trạng độ dày rễ (THK) tập đồn hai nhóm mẫu giống thuộc loài phụ indica japonica 108 4.18 Tỷ lệ dạng alen vị trí đánh dấu xung quanh q45 121 viii download by : skknchat@gmail.com TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên Tác giả: Phùng Thị Phƣơng Nhung Tên Luận án: Xác định gen-alen đặc thù liên quan đến phát triển rễ giống lúa Việt Nam Chuyên ngành: Di truyền Chọn giống trồng Mã số: 62 01 11 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu luận án Sự phát triển nghiên cứu Lập đồ liên kết toàn hệ gen (GWASGenome-wide Association Study) trồng mở khả khai thác gen/alen có vai trị quan trọng sinh trƣởng, phát triển ẩn giấu nguồn tài nguyên di truyền thực vật ngân hàng gen Lúa (Oryza sativa L.) trồng quan trọng với nguồn gen phong phú, nhƣng phần nhỏ đa dạng nguồn gen lúa quốc gia đƣợc khai thác nghiên cứu GWAS Luận án đƣợc thực nhằm phát triển tập đoàn giống lúa Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu GWAS, từ xác định QTLs/gen ứng viên liên quan đến phát triển rễ giống lúa Việt Nam Vật liệu Phƣơng pháp nghiên cứu Một sƣu tập gồm 270 giống lúa có 214 giống lúa Việt Nam đƣợc gieo trồng đánh giá đặc điểm nơng sinh học Sau đó, giống đƣợc chiết tách ADN đƣợc phân tích đa dạng di truyền với thị DArT (sử dụng 6144 marker) Kết phân tích đa dạng di truyền với DArT, tập đoàn nghiên cứu đƣợc chia làm nhóm giống thuộc lồi phụ indica japonica Kết hợp đặc điểm nông sinh học phân loại lựa chọn đƣợc 200 giống lúa khơng có trùng lặp kiểu gen để làm vật liệu cho nghiên cứu phân tích kiểu gen thơng qua giải trình tự (GBS) Kết phân tích GBS xây dựng đƣợc ma trận haplotype đáp ứng yêu cầu nghiên cứu GWAS cách loại bỏ marker có tỷ lệ “Minor Allele” nhỏ 5% khơi phục liệu bị thiếu Tập đoàn 200 giống lúa đƣợc đánh giá kiểu hình rễ điều kiện nhà lƣới có mái che, sử dụng phƣơng pháp ống rễ với lần nhắc lại Nghiên cứu GWAS đƣợc thiết lập sở liệu kiểu gen GBS liệu đánh giá kiểu hình rễ, sử dụng mơ hình phân tích hỗn hợp có điều chỉnh tỷ lệ dƣơng tính giả dựa cấu trúc quần thể (Q) quan hệ họ hàng (K), để xác định liên kết quan trọng Các phân tích GWAS đƣợc tiến hành ma trận liệu đƣợc thành lập cho: 1) tập đoàn gồm 185 mẫu giống, 2) nhóm giống indica gồm 115 mẫu giống, 3) nhóm giống japonica gồm 64 mẫu giống Kết kết luận Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Bộ liệu đa hình kiểu gen với 25971 SNPs phân bố toàn hệ gen ix download by : skknchat@gmail.com ... triển rễ lúa đƣợc công bố 2.2 QTLs VÀ GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ LÚA 2.2.1 Các QTLs liên quan đến phát triển rễ lúa 2.2.1.1 Các nghiên cứu xác định QTLs Ban đầu, để xác định đƣợc gen. .. truyền định đến khả tăng cƣờng số lƣợng nhánh bên rễ 2.2.2.5 Các gen liên quan đến phát triển rễ lúa Các đột biến khác liên quan đến phát triển rễ cho phép xác định đƣợc gen liên quan đến chức... 10 2.2 QTLs gen liên quan đến phát triển rễ lúa 12 2.2.1 Các QTLs liên quan đến phát triển rễ lúa 12 2.2.2 Các gen liên quan đến hình thành phát triển rễ lúa 16 2.3 Nguyên