Mục đích của luận án nhằm xây dựng bộ dữ liệu kiểu hình của một số tính trạng chính liên quan đến sự phát triển bộ rễ của các mẫu giống lúa được chọn, làm cơ sở cho nghiên cứu GWAS để xác định các QTLs/gen ứng viên liên quan đến sự phát triển bộ rễ của lúa Việt Nam. Sử dụng phương pháp GWAS để lập bản đồ liên kết toàn hệ gen, từ đó xác định các QTLs và gen ứng viên liên quan đến sự phát triển bộ rễ của các giống lúa Việt Nam.
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHÙNG THỊ PHƢƠNG NHUNG XÁC ĐỊNH CÁC GEN - ALEN ĐẶC THÙ LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÁC GIỐNG LÚA VIỆT NAM Chuyên ngành: Mã số: Di truyền chọn giống trồng 9.62.01.11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP - 2019 Cơng trình hồn thành tại: HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn: GS.TS ĐỖ NĂNG VỊNH GS.TS PASCAL GANTET Phản biện 1: GS TS Ngơ Xn Bình Bộ Khoa học Công nghệ Phản biện 2: TS Lê Thị Thu Hiền Viện nghiên cứu Hệ gen Phản biện 3: TS Lê Quỳnh Mai Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Việc tạo giống lúa có kiểu hình rễ phù hợp, giúp lúa tăng khả chống chịu với stress phi sinh học nhằm đáp ứng với biến đổi khí hậu trọng tâm nhiều chương trình nghiên cứu cải tiến giống lúa Hạn chế khả quan sát trực tiếp rễ khó khăn lớn khiến kết liên quan đến chọn tạo giống lúa có rễ thích nghi tốt cơng bố Phát triển công cụ hỗ trợ, phục vụ cho phương pháp chọn lọc phân tử để ứng dụng vào chương trình chọn tạo giống cải tiến rễ lúa cần thiết Đặc biệt, hiểu biết yếu tố di truyền có liên quan đến đặc điểm phát triển thích nghi rễ lúa chìa khóa quan trọng hướng nghiên cứu Nhiều phương pháp khác sử dụng để khám phá yếu tố di truyền liên quan đến rễ phương pháp xác định QTLs phương pháp có tiềm hiệu Sự xuất phương pháp GWAS (Genome–wide Association Mapping) (Nordborg and Weigel, 2008) thành công phương pháp thực vật (Atwell et al., 2010), đặc biệt lúa (Clark et al., 2013; Courtois et al., 2013) cho thấy GWAS công cụ hữu hiệu nghiên cứu xác định QTLs lúa thực vật nói chung Độ phân giải cao QTLs áp dụng phương pháp GWAS giúp rút ngắn thời gian nghiên cứu trực tiếp xác định gen ứng viên liên quan đến tính trạng quan tâm (Zhu et al., 2008) Các nghiên cứu GWAS khai thác phần nhỏ nguồn gen lúa giới tính trạng quan tâm Việt Nam nằm trung tâm phát sinh lúa vùng Đông Nam Á Cây lúa trồng từ Bắc vào Nam với nhiều điều kiện sinh thái chế độ thủy văn khác Do dó, đa dạng giống lúa Việt Nam nguồn tài nguyên quý để phát triển nghiên cứu nhằm phát yếu tố di truyền kiểm sốt tính trạng phát triển rễ khả chống chịu với stress phi sinh học lúa Sử dụng phương pháp GWAS để xác định QTLs/gen ứng viên liên quan đến phát triển rễ giống lúa Việt Nam hướng nhiều triển vọng có ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI - Lựa chọn mẫu giống phù hợp để phát triển liệu kiểu gen liệu kiểu hình phục vụ cho nghiên cứu GWAS thông qua hhảo sát đa dạng đặc điểm nông sinh học di truyền tập đoàn mẫu giống lúa Việt Nam - Xây dựng liệu kiểu gen (haplotype) tập đoàn mẫu giống chọn, làm sở liệu để phát triển nghiên cứu GWAS với tính trạng quan tâm - Xây dựng liệu kiểu hình số tính trạng liên quan đến phát triển rễ mẫu giống lúa chọn, làm sở cho nghiên cứu GWAS để xác định QTLs/gen ứng viên liên quan đến phát triển rễ lúa Việt Nam - Sử dụng phương pháp GWAS để lập đồ liên kết tồn hệ gen, từ xác định QTLs gen ứng viên liên quan đến phát triển rễ giống lúa Việt Nam 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thực sở tập đoàn gồm 214 mẫu giống lúa thu thập từ nhiều vùng Việt Nam, 33 mẫu giống lúa đối chứng đại diện cho đa dạng Oryza sativa giới CIRAD cung cấp 23 mẫu giống khác cung cấp Viện Di truyền Nông nghiệp Các mẫu giống đánh giá đặc điểm nông sinh học đa dạng di truyền thị DArT Kết sở để lựa chọn mẫu giống cho thiết lập liệu kiểu gen kiểu hình để phục vụ phát triển nghiên cứu GWAS Một tập đoàn gồm 200 mẫu giống lúa chọn phân tích kiểu gen 50000 thị SNPs, sử dụng phương pháp phân tích kiểu gen thơng qua giải trình tự GBS, đánh giá biểu 18 tính trạng liên quan đến phát triển rễ Phân tích GWAS tiến hành đồng thời ma trận liệu cho tất tập đoàn (185 mẫu giống x 21623 marker), nhóm giống indica (115 mẫu giống x 13842 marker), nhóm giống japonica (64 mẫu giống x 8821 marker) Kết nghiên cứu giới hạn mức xác định QTLs/gen ứng viên liên quan đến phát triển rễ mẫu giống lúa Việt Nam tập đồn nghiên cứu 1.4 NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đã khảo sát đánh giá cách có hệ thống đặc điểm nơng sinh học tập đồn 270 giống lúa, có 214 giống lúa Việt Nam Đã xác định mức độ đa dạng di truyền phân loại tập hợp nguồn gen lúa Việt Nam lượng lớn thị đại DArT SNPs marker Sử dụng phương pháp GBS xây dựng liệu kiểu gen với 25971 SNPs marker, bao phủ toàn hệ gen với mật độ cao, sở để phát triển nghiên cứu GWAS với mục tiêu khác (năng suất, cấu trúc bông, khả chống chịu với sâu bệnh điều kiện bất lợi) tập đoàn lúa nghiên cứu Luận án cung cấp liệu gồm thông số, thông tin tính trạng liên quan đến phát triển 190 mẫu giống lúa Việt Nam Kết lập đồ liên kết toàn hệ gen (GWAS) cung cấp danh sách gồm 88 QTLs liên kết với 18 tính trạng theo dõi, có 33 QTLs nằm vùng mã hóa gen chức năng, vùng QTLs liên kết chặt với tính trạng số lượng rễ (NCR) NST số 11 vùng QTLs liên kết chặt với tính trạng độ dày rễ (THK) NST số Xác định 889 gen ứng viên, có 407 gen xác định phân nhóm chức giả định, 24 gen có cơng bố chứng minh chức hóa sinh sinh học liên quan đến phát triển rễ 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Những đóng góp đặc điểm nông sinh học bản, đặc điểm phát triển rễ, đa dạng di truyền giống lúa luận án mở rộng nâng cao hiểu biết đa dạng nguồn gen lúa Việt Nam giới Là sở để lựa chọn vật liệu cho chương trình chọn tạo giống lúa Bộ liệu kiểu gen gồm 25000 SNPs marker đăng tải trang TropGenDB nguồn liệu mở, cung cấp cho nhà khoa học khác để tiếp tục phát triển nghiên cứu GWAS tập đoàn nghiên cứu với nhiều mục tiêu khác như: xác định QTLs liên quan đến khả chống chịu, suất, chất lượng, cấu trúc bông,…vv Dữ liệu thông tin đặc điểm rễ có ý nghĩa tham khảo sở lựa chọn vật liệu cho chương trình lai tạo giống cải tiến tính trạng rễ lúa Kết luận án cung cấp danh sách QTLs/ gen ứng viên có liên quan đến phát triển rễ giống lúa Việt Nam, bổ sung thêm thơng tin hữu ích chi tiết giúp nhà khoa học quan tâm nghiên cứu di truyền rễ lúa Việt Nam giới có hiểu biết tồn diện, xác đầy đủ mạng lưới gen liên quan Đặc biệt, đặc điểm riêng biệt giống lúa Việt Nam mang đến phát mới, đặc trưng, mà nghiên cứu sử dụng nguồn vật liệu lúa khác giới khơng thể tìm thấy Nhìn chung, luận án cung cấp mơ hình áp dụng công nghệ, kỹ thuật đại phân tích genome để đưa vào khai thác đa dạng nguồn gen lúa Việt Nam, làm rõ mối quan hệ kiểu gen kiểu hình, nhằm khai thác gen/alen đặc thù ẩn nguồn gen Kết luận án mở đường triển vọng khai thác genome để ứng dụng vào chương trình chọn giống phân tử tạo giống lúa có rễ thích hợp làm tăng khả thích ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 VAI TRÕ VÀ ĐẶC ĐIỂM BỘ RỄ Ở LƯA - Vai trò rễ lúa; - Đặc điểm phát triển rễ lúa 2.2 QTLs VÀ GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ LÖA - Các QTLs liên quan đến phát triển rễ lúa; - Các gen liên quan đến hình thành phát triển rễ lúa 2.3 PHƢƠNG PHÁP GBS - Phương pháp giải trình tự NGS – tảng GBS; - Nguyên lý phương pháp GBS; - Các ứng dụng GBS chọn giống trồng 2.4 PHƢƠNG PHÁP GWAS - Nguyên lý; - Các bước xây dựng nghiên cứu GWAS; - Ý nghĩa tiềm GWAS chọn tạo giống lúa 2.5 NGUỒN GEN LÖA VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU RỄ LƯA Ở VIỆT NAM - Nguồn gen lúa Việt Nam; - Tình hình nghiên cứu đặc điểm rễ lúa Việt Nam PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Vật liệu sử dụng thí nghiệm đánh giá đặc điểm nông sinh học đa dạng di truyền với thị DArT gồm 270 mẫu giống lúa, có 214 mẫu giống lúa Việt Nam cung cấp Trung tâm Tài nguyên thực vật (Phụ lục 1a), 33 mẫu giống lúa đại diện cho đa dạng lúa giới (đối chứng) cung cấp Ngân hàng gen CIRAD – Pháp (Phụ lục 1b), 23 mẫu giống khác cung cấp Viện Di truyền Nông nghiệp (Phụ lục 1b) - Vật liệu sử dụng cho phân tích di truyền với GBS thí nghiệm đánh giá đặc điểm rễ gồm 200 mẫu giống lúa Trong có 197 mẫu giống lúa Việt Nam, mẫu giống đối chứng IR64, Niponbare Azucena (Phụ lục 3) - Vật liệu sử dụng phân tích lập đồ liên kết toàn hệ gen gồm 185 mẫu giống lúa, có 182 mẫu giống lúa Việt Nam, mẫu giống đối chứng IR64, Niponbare Azucena Ngoài ra, phân tích GWAS cho lồi phụ, lồi phụ indica gồm 115 mẫu giống (114 mẫu giống Việt Nam IR64), loài phụ japonica gồm 64 mẫu giống (62 mẫu Việt Nam với Nippobare Azucena) 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Khảo sát đa dạng số đặc điểm nông sinh học đa dạng di truyền (với DArT marker) giống lúa Việt Nam, từ lựa chọn mẫu giống phù hợp gia nhập tập đoàn nghiên cứu thí nghiệm phân tích kiểu gen GBS thí nghiệm đánh giá đặc điểm kiểu hình rễ - Xây dựng liệu đa hình kiểu gen (haplotype) tập đoàn mẫu giống nghiên cứu sử dụng phương pháp phân tích kiểu gen thơng qua giải trình tự (GBS) - Xây dựng liệu kiểu hình số tính trạng liên quan đến phát triển rễ lúa - Trên sở liệu kiểu gen (GBS) kiểu hình thu được, sử dụng phương pháp GWAS để lập đồ liên kết toàn hệ gen, từ xác định QTLs gen ứng viên liên quan đến phát triển rễ giống lúa Việt Nam 3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Phƣơng pháp chiết tách ADN tổng số Sử dụng phương pháp CTAB (Murray and Thompson, 1980) Vật liệu sử dụng lúa tuần tuổi sau cấy 3.3.2 Phƣơng pháp phân tích di truyền thị DArT Để phân tích đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa nghiên cứu sử dụng thị phân tử DArT (Diversity Array Technology) phát triển theo công bố Killian et al (2012) Sử dụng hệ thống máy móc chuyên dụng phòng nghiên cứu DArT, thuộc Trung tâm Hợp tác quốc tế Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp bền vững (CIRAD) – Pháp Mảng liệu gồm 6144 DArT marker xây dựng dựa 25 giống thị, gồm 10 giống indica, 10 giống japonica ôn đới giống japonica nhiệt đới Phương pháp xây dựng mảng thư viện DArT mô tả Jaccoud et al (2001) Risterucci et al (2009) 3.3.3 Phƣơng pháp phân tích kiểu gen thơng qua giải trình tự (GBS) Chúng sử dụng phương pháp GBS xây dựng công ty Diversity Arrays Technology Pty Ltd (Australia) kết hợp DArT cộng nghệ giải trình tự NGS gọi tắt DArTseqTM, cách sử dụng enzyme giới hạn PstI/TaqI để làm giảm phức tạp genome, kết hợp với công nghệ đọc trình tự ngắn Illumina, phương pháp miêu tả công bố Courtois et al (2013) 3.3.4 Phƣơng pháp phân tích cấu trúc quần thể Phần mềm sử dụng STRUCTURE phát triển Pritchard et al (2000) 3.3.5 Phƣơng pháp tính LD (Linkage Disequilibrium) Để đánh giá mật độ marker sử dụng có đáp ứng yêu cầu nghiên cứu di truyền liên kết hay không, cân liên kết (Linkage Disequilibrium LD) toàn tập đồn nghiên cứu tính tốn số r2 cặp SNP marker khác nhau, dụng phần mền Tassel 5.0 liệu nhiễm sắc thể (Bradbury et al., 2007) 3.3.6 Phƣơng pháp đánh giá đặc điểm nông sinh học Đánh giá theo phương pháp chuẩn IRRI (2002) 3.3.7 Phƣơng pháp đánh giá kiểu hình rễ 3.3.7.1 Bố trí thí nghiệm Sử dụng phương pháp ống rễ cải tiến, thí nghiệm bố trí kiểu Alpha- lattice với lần nhắc lại 3.3.7.2 Các tiêu theo dõi 11 tính trạng đo trực tiếp từ mẫu tính trạng thứ cấp tính tốn dựa tiêu đo Các tiêu theo dõi cụ thể là: 1) LLGTH: Chiều dài thân; 2) MRL: Chiều dài rễ tối đa; 3) TIL: Số nhánh; 4) SDW: Khối lượng khô phần thân; 5) DEPTH: Độ ăn sâu rễ; 6) NCR: Số lượng rễ bất định; 7) THK: Độ dày rễ; 8) DW0020: Khối lượng khô phần rễ từ đến 20 cm tính từ gốc; 9) DW2040: Khối lượng khô phần rễ từ 20 đến 40 cm tính từ gốc; 10) DW4060: Khối lượng khơ phần rễ từ 40 đến 60 cm tính từ gốc; 11) DWB60: Khối lượng khô phần rễ dài 60 cm tính từ gốc; 12) RDW: Khối lượng khơ tồn rễ lúa; 13) DRW: Khối lượng khơ phần rễ ăn sâu 40 cm tính từ gốc; 14) PDW: Khối lượng khô lúa (cả thân rễ); 15) SRP: Phần trăm khối lượng khô phần rễ ăn nông; 16) DRP: Phần trăm khối lượng khô phần rễ ăn sâu; 17) R_S: Tỷ lệ khối lượng khô phần rễ phần thân ; 18) NR_T: Số rễ bất định trung bình nhánh 3.3.7.3 Phương pháp phân tích số liệu kiểu hình Các số liệu phân tích phương sai (ANOVA) để xem xét ảnh hưởng đa dạng di truyền, số lần lặp block đến kết thí nghiệm, sử dụng phần mềm SAS 9.2 (SAS Institute, Cary NC, USA) Các số liệu liên quan đến đặc điểm thân rễ giống lúa khái quát hình ảnh sử dụng phần mềm RASTA (được phát triển Jeremy Lavarence – Sinh viên trường Đại học Montpellier II – Pháp) 3.3.8 Phƣơng pháp lập đồ liên kết Phân tích liên kết thực cho tập đoàn mẫu giống nghiên cứu, với tổng 182 mẫu giống Việt Nam mẫu đối chứng 21623 marker; cho nhóm giống loài phụ indica với 115 mẫu giống 13814 marker; nhóm giống thuộc lồi phụ japonica với 64 mẫu giống 8821 marker Sử dụng phần mềm TASSEL v3 (Bradbury et al., 2007) Sử dụng mơ hình hỗn hợp (MLM2), sử dụng cấu trúc quần thể (PCA– Q) quan hệ họ hàng (Kinship – K) để hạn chế tỷ lệ dương tính giả xảy Trong q trình phân tích sử dụng tùy chọn khơng nén (no compression) đánh giá lại thành phần phương sai cho điểm đánh dấu (re-evaluation) Các QQ-plots vẽ TASSEL để đánh giá số lượng dương tính giả có so với mơ hình chuẩn Ngưỡng P-value chọn để xác định kiện liên kết xảy đáng tin cậy P-value ≤ 1e-04 Sau đó, giá trị q tương ứng với giá trị P-value tính tốn để kiểm tra mức độ tin cậy P-value, sử dụng gói phần mềm R Q V1.0 (Gao, 2011) Đồ thị Mannhantan Plots biểu diễn giá trị P-value tất điểm đánh dấu nhiễm sắc thể khác vẽ cơng cụ hỗ trợ có sẵn TASSEL 3.3.9 Phƣơng pháp xác định gen ứng cử viên Các gen ứng cử viên quan tâm gen nằm vùng tin cậy QTLs xác định Căn vào kết phân tích LD, gen nằm khoảng tin cậy tính từ vị trí đánh dấu (hoặc đoạn QTLs) xác định dựa liệu giải trình tự genome lúa công bố Orygenes DB ((http://orygenesdb.cirad.fr/tools.html) Các gen tìm đối chiếu với danh sách gồm khoảng 200 gen liệu gen liên quan đến phát triển rễ dự án EURoot, công bố trang web (http://gohelle.cirad.fr:8080/euroot/JSP/authentication.jsp) để so sánh với chức gen chứng minh, minh chứng cho triển vọng hiệu đề tài PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA BỘ SƢU TẬP GIỐNG LÖA 4.1.1 Đặc điểm thu đƣợc qua thông tin hồ sơ mẫu giống Theo thông tin nguồn gen lập thu thập mẫu giống Trung tâm tài nguyên thực vật, 214 giống lúa lựa chọn có nguồn gốc từ 36 tỉnh thành nước, trải dài từ Bắc vào Nam, từ Hà Giang đến Cà Mau Các giống gieo trồng nhiều vùng có điều kiện tự nhiên, đất đai, khí hậu khác Việt Nam, tạm chia thành vùng là: 1) vùng đồng Sông Hồng, 2) Vùng đồng sông Cửu Long, 3) vùng Duyên Hải Bắc Trung Bộ, 4) vùng duyên hải Nam Trung Bộ, 5) vùng Đông Nam Bộ, 6) vùng Đông Bắc Bộ, 7) vùng Tây Bắc Bộ, 8) Vùng Tây Nguyên Các điều kiện canh tác chủ yếu giống tập đoàn theo thứ tự tăng dần là: 1) điều kiện ngập mặn ven biển (5 mẫu giống), 2) canh tác chủ động tưới tiêu (44 mẫu giống), 3) canh tác nước trời đất thấp (51 mẫu giống), 4) canh tác nương rẫy chiếm nhiều (70 mẫu giống) chiếm khoảng 33%, giống lại khơng có liệu thơng tin (u) (Phụ lục 1) Trong 214 giống có tới 203 giống cho giống địa Việt Nam (traditional – T), có 10 giống thuộc nhóm giống cải tiến (improvement –I), giống khơng có thông tin ghi điều (Phụ lục 1) 4.1.2 Đặc điểm nông sinh học 4.1.2.1 Thời gian sinh trưởng Kết đánh giá thời gian sinh trưởng 270 mẫu giống lúa cho thấy: thời gian sinh trưởng giống lúa biến động khoảng từ 94 đến 186 ngày vụ thí nghiệm Theo thang đánh giá chuẩn IRRI, 270 mẫu giống lúa chia làm nhóm TGST khác Kết trình bày Bảng 4.1 Bảng 4.1 Phân nhóm mẫu giống theo thời gian sinh trƣởng Phân nhóm Tiêu chuẩn Nhóm cực ngắn ngày Nhóm ngắn ngày Nhóm trung ngày Nhóm dài ngày Nhóm cực dài ngày ≤ 105 105 - 115 116 - 135 136-165 >165 Tổng Số mẫu giống Tỷ lệ (%) 22 87 86 40 35 8,15 32,22 31,85 14,82 12,96 270 100,00 4.1.2.2 Khả đẻ nhánh số nhánh hữu hiệu Khả đẻ nhánh giống lúa đánh giá ghi nhận Bảng 4.2 theo thang đánh giá chuẩn IRRI, 70% giống nghiên cứu có khả đẻ nhánh mức Trung bình (10-19 nhánh) Cao (20-25 nhánh) Bảng 4.2 Phân nhóm mẫu giống theo số nhánh hữu hiệu Số nhánh hữu hiệu/khóm 3,0 2,5 < L/W ≤ 3,0 L/W ≤ 2,5 Thiếu liệu 60 85 64 214 28,04 39,72 29,90 2,33 100 Trong đó: L/W tỷ lệ chiều dài hạt/ Chiều rộng hạt Theo kết trình bày Bảng 4.3, sưu tập 214 giống lúa Việt Nam cung cấp Trung tâm tài nguyên thực vật, số mẫu giống có dạng hạt bầu chiếm 39,72%, nhiều nhóm, tiếp đến giống thuộc nhóm C có dạng hạt tròn, chiếm 29,90% Nhóm hạt dài (A) chiếm tỷ lệ (28,04%) 4.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN VỚI CHỈ THỊ DART 4.2.1 Kết phân tích đa hình cấu trúc di truyền Phân tích kết lai ADN giống nghiên cứu với 6144 DArT marker, kết thu có 619 marker cho đa hình tập đồn lúa nghiên cứu, chiếm khoảng 9.6% tổng số marker sử dụng Sau phân tích lựa chọn, chúng tơi thu 241 marker có chất lượng tốt khơng bị trùng lặp, hàm lượng thơng tin đa hình (PIC) marker dao động từ 5% đến 50%, trung bình 40% Các DArT marker phân bố toàn genome, số lượng marker nhiễm sắc thể tỷ lệ thuận với kích thước tương đối chúng tính bp (hệ số tương quan r = 0,78) Một ma trận liệu tạo thành từ 241 DArT marker 270 mẫu giống lúa đưa vào phân tích cấu trúc di truyền sử dụng phần mềm STRUCTURE v2.3.1 (Prichard et al., 2000) Kết cho thấy có 168 giống lúa có di truyền giống với giống đối chứng indica từ 80 đến 100%, nghĩa giống thuộc lồi phụ indica; 88 giống có di truyền giống với đối chứng japonica từ 80 đến 100%, xếp vào nhóm lồi phụ japonica; lại giống có di truyền trung gian Một biểu đồ thiết lập dựa vào tỷ lệ phần trăm tương đồng di truyền với đối chứng loài phụ indica japonica giống nghiên cứu, kết trình bày Hình 4.1 Chú thích: Trục tung biểu diễn tỷ lệ di truyền hai loài phụ indica japonica, trục hoành biểu diễn số thứ tự mẫu giống lúa Màu xanh đại diện cho di truyền thuộc nhóm lồi phụ indica; màu đỏ đại diện cho di truyền thuộc nhóm lồi phụ japonica; mẫu giống có chữ “m” dạng trung gian hai lồi phụ Vị trí 159 đối chứng IR64 (135), vị trí đối chứng APO (132), vị trí đối chứng Azucena (153), vị trí 148 đối chứng Nipponbare (168), vị trí 155 đối chứng DOM SOFID (150), đối chứng sử dụng ADN chiết tách từ mẫu giống lúa tương ứng trồng bảo quản Ngân hàng gen CIRAD Vị trí số 170 giống GC14 thuộc Oryza glaberrima Hình 4.1 Thành phần genome mẫu giống nghiên cứu Một phân tích cấu trúc di truyền quần thể thực 1275 SNP marker, kết cho thấy tập đoàn 182 giống lúa Việt Nam chia thành hai nhóm rõ rệt gồm 114 mẫu giống thuộc loài phụ indica, 62 mẫu giống thuộc lồi phụ japonica, lại mẫu giống thuộc dạng trung gian hai lồi phụ Phân nhóm giống tập đoàn nghiên cứu gần trùng khớp với kết lần phân tích với thị DArT ban đầu Tiến hành phân tích mối quan hệ 114 mẫu giống thuộc loài phụ indica, sử dụng 840 SNP marker xác định có nhóm phụ, ký hiệu từ I1 đến I6, kết lần xác định phương pháp phân tích thành phần (DACP) (Jombary et al., 2010); nhóm phụ biểu diễn Hình 4.3 Chú thích: Các giống có màu giống thuộc phân nhóm; giống khơng khơng xác định phân nhóm biểu diễn màu đen; IR64 (giống đối chứng đại diện cho nhóm indica) nằm phân nhóm biểu diễn màu hồng (I2); Các đặc điểm đặc trưng phân nhóm ghi màu với phân nhóm đó, đó: 1) Đặc điểm vùng khí hậu nơi giống thu thập: MRD = Vùng đồng sông Cửu Long; SE = Vùng Đông Nam Bộ; CH = Vùng Tây Nguyên; SCC = Vùng Duyên Hải Nam Trung Bộ; NCC = Vùng Duyên Hải Bắc Trung Bộ; RRD = Vùng Đồng Bằng Sông Hồng; NW = vùng Tây Bắc Bộ; NE = Vùng Đông Bắc Bộ 2) Sinh thái: IR = Chủ động tưới tiêu; RL = Canh tác nước trời vùng đất thấp; UP = canh tác nương rẫy; MX = canh tác nhiều hệ sinh thái khác 3) Thời gian sinh trưởng: E = Ngắn; M = Trung ngày; L = Dài ngày; VL = Rất dài ngày 4) Tỷ lệ chiều dài chiều rộng hạt thóc (L/W): A = L/W > 3,0; B = 2,5 ≤ L/W ≤ 3,0; C = L/W ≤ 2,5 5) Đặc điểm nội nhũ: G = gạo nếp; NG = gạo tẻ Hình 4.3 Các phân nhóm nhóm giống thuộc lồi phụ indica Tương tự, phân tích cấu trúc quần thể thực với 62 giống lúa japonica Việt Nam, sử dụng 780 SNPs marker Kết xác định nhóm phụ nhóm trung gian Sơ đồ phân lại vẽ phần mềm DARwin trình bày Hình 4.4 11 Chú thích: Các giống có màu giống thuộc phân nhóm; giống khơng khơng xác định phân nhóm biểu diễn màu đen; Niponbare Azucena (giống đối chứng đại diện cho nhóm japonica) biểu diễn màu hồng; Các đặc điểm đặc trưng phân nhóm ghi màu với phân nhóm đó, đó: 1) Đặc điểm vùng khí hậu nơi giống thu thập: MRD = Vùng đồng sông Cửu Long; SE = Vùng Đông Nam Bộ; CH = Vùng Tây Nguyên; SCC = Vùng Duyên Hải Nam Trung Bộ; NCC = Vùng Duyên Hải Bắc Trung Bộ; RRD = Vùng Đồng Bằng Sông Hồng; NW = vùng Tây Bắc Bộ; NE = Vùng Đông Bắc Bộ 2) Sinh thái: IR = Chủ động tưới tiêu; RL = Canh tác nước trời vùng đất thấp; UP = canh tác nương rẫy; MX = canh tác nhiều hệ sinh thái khác 3) Thời gian sinh trưởng: E = Ngắn; M = Trung ngày; L = Dài ngày; VL = Rất dài ngày 4) Tỷ lệ chiều dài chiều rộng hạt thóc (L/W): A = L/W > 3,0; B = 2,5 ≤ L/W ≤ 3,0; C = L/W ≤ 2,5 5) Đặc điểm nội nhũ: G = gạo nếp; NG = gạo tẻ Hình 4.4 Các phân nhóm nhóm giống thuộc lồi phụ japonica Sự khác biệt nhóm phụ đo số FST cặp nhóm phụ hai nhóm indica japonica, trình bày Bảng 4.4 Bảng 4.4 Chỉ số FST nhóm phụ mức ý nghĩa P-value indica I1 I1 I2 I3 I4 I5 I6 0,001 0,003 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 I2 0,303 I3 0,406 0,453 I4 0,327 0,301 0,498 I5 0,374 0,405 0,555 0,381 I6 0,264 0,270 0,375 0,269 japonica J1 J1 J2 0,001 J2 0,528 J3 0,428 0,692 J4 0,461 0,542 J3 0,001 0,347 J4 0,003 0,001 0,001 0,001 0,001 0,676 Trong đó: Giá trị FST ghi đường chéo, giá trị P-value ghi phía đường chéo tương ứng 12 Qua Bảng 4.4 cho thấy giá trị FST điều có mức ý nghĩa cao, dao động từ 0,001 đến 0,003 Giá trị FST nhóm japonica từ 0,428 đến 0,692, cao số nhóm phụ nhóm indica (0,264 đến 0,555) Số liệu minh chứng qua hình ảnh phân loại hai nhóm, nhóm indica phân loại có cấu trúc gần giống cấu trúc tỏa tròn, cho thấy mối quan hệ gần gũi khoảng cách di truyền khác đồng nhóm phụ, nhóm japonica thấy rõ nhóm phụ J3 nhóm phụ J2 gần tạo thành hai cực đối xứng cách xa 4.3.2 Kết phân tích Linkage Disequilibrium (LD) Sự phân dã LD theo khoảng cách vật lý cặp marker, nhiễm sắc thể tính cho hai nhóm lồi phụ indica (114 giống) japonica (62 giống), kết trình bày Bảng 4.5 Bảng 4.5 Sự phân rã LD 12 nhiễm sắc thể nhóm giống indica japonica Chr indica japonica r2=0,1 r2=0,2 r2=0,1 r2=0,2 321 83 2125 180 198 60 1614 358 370 81 1890 747 324 94 1961 261 788 306 1065 464 378 114 1955 677 349 101 1949 452 315 70 3314 614 264 88 1931 362 10 285 68 1297 390 11 145 35 953 217 12 381 107 1340 375 Trung bình 343 101 1783 425 Theo đó, nhóm lồi phụ indica có r2 mức tối đa (0,52) khoảng cách điểm đánh dấu từ đến 25 kb Tại giá trị r2 = 0,2 r2 = 0,1 khoảng cách vật lý trung bình tương ứng 101 kb 343 kb Sự phân rã LD diễn gần tương tự nhiễm sắc thể, trừ nhiễm sắc thể số 11 có tốc độ phân rã nhanh Ở nhóm lồi phụ japonica, với khoảng cách từ đến 25 kb, r2 mức tối đa cao 13 nhóm indica (0,71) Sự phân rã LD theo khoảng cách vật lý chậm nhiều, r2 = 0,2 r2 = 0,1, khoảng cách trung bình điểm đánh dấu trung bình 425 kb 1783 kb Với khoảng cách trung bình điểm đánh dấu toàn hệ gen 17,1 kb, cao phân rã r2, kết phù hợp để phát triển nghiên cứu GWAS bước 4.4 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KIỂU HÌNH CÁC TÍNH TRẠNG LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ Ở CÁC MẪU GIỐNG NGHIÊN CỨU 4.4.1 Kết phân tích phƣơng sai thống kê Kết phân tích phương sai (ANOVA) thể Bảng 4.6 cho thấy yếu tố giống có ảnh hưởng mạnh mẽ đến kết thu tiêu nghiên cứu Hệ số di truyền theo nghĩa rộng tính trạng dao động từ 0,65 đến 0,90 (ở mức trung bình đến cao), trừ hai tính trạng độ ăn sâu rễ (DEPTH) chiều dài rễ tối đa (MRL) có hệ số di truyền tương ứng 0,35 0,46 Các giá trị thống kê như: giá trị trung bình (mean), độ lệch chuẩn (SD), giá trị lớn (max), giá trị nhỏ (min) độ biến động (CV%), tính trạng tập đồn 194 giống thống kê Bảng 4.7 Sử dụng phần mền RASTA, số liệu liên quan đến phần thân rễ giống lúa tập đoàn khái quát thành hình ảnh, trình bày Hình 4.5 Kết Bảng 4.7 cho thấy có 13 tiêu theo dõi có biến động lớn (từ 20% đến 62,6%) trừ tính trạng chiều dài thân (13,3%), độ ăn sâu rễ (5,8%), chiều dài rễ tối đa (6,8%), độ dày rễ (13,7%), tỷ lệ phần trăm khối lượng rễ ăn nơng (12,1%) Tính trạng có CV% biến động mạnh mẽ DWB60, khối lượng khô phần rễ dài 60 cm, CV% lên tới 62,6% Nguyên nhân biến động chủ yếu xuất phát từ đa dạng giống lúa tập đoàn nghiên cứu Độ ăn sâu rễ (DEPTH) có giá trị CV% nhỏ nhất, 5,8% giống gieo giống ống cát có độ dài 80 cm, nguyên nhân hạn chế khiến biểu mức độ đa dạng độ ăn sâu rễ giống lúa khác Bảng 4.7 cho thấy có khác biệt lớn số lượng rễ bất định giống lúa khác tập đồn nghiên cứu, giống có số lượng rễ trung bình nhỏ 32,5 rễ/cây, 176,8 rễ/cây, hệ số biến động CV% 32,8% Chiều hướng biến động CV% tập đoàn nghiên cứu tương tự tách số liệu xử lý cho nhóm giống thuộc lồi phụ indica japonica 14 Bảng 4.6 Kết phân tích ANOVA hệ số di truyền theo nghĩa rộng tính trạng nghiên cứu Tính trạng Nhắc lại Block Giống H2 LLGHT < 0,001 < 0,001 < 0,001 0,90 TIL < 0,001 0,0009 < 0,001 0,80 SDW 0,0043 < 0,0001 < 0,0001 0,73 DEPTH 0,0254 0,0003 0,0002 0,35 MRL 0,1428 0,0277 0,0001 0,46 NCR 0,2270 < 0,0001 < 0,0001 0,84 NR_T