NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU
ĐỐİ TƯỢNG, ĐỊA ĐİỂM, NGUYÊN LİỆU NGHİÊN CỨU
Lợn mán sau khi sinh đến giai đoạn cai sữa thường mắc tiêu chảy do virus tiêu chảy dịch tễ ở lợn (PEDV) Nghiên cứu này được thực hiện tại các trang trại lợn mán ở tỉnh Hà Giang.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm, Bộ Môn Bệnh Lý, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam
- Địa điểm theo dõi và lấy mẫu tại 3 huyện: Vị Xuyên, Bắc Quang và Hoàng Su Phì tỉnh Hà Giang
Mẫu được thu nhận là cả con lợn Mán nuôi mắc bệnh điển hình trong lứa tuổi từ 1- 9 tuần tuổi, mỗi đàn lợn từ 1-3 con
Mẫu mô từ ruột, gan, lách, thận, phổi, hạch và tim được thu thập để nghiên cứu bệnh tích vi thể từ lợn con dương tính với virus PEDV, xác định qua phương pháp RT-PCR.
Bảng 3.1 Hồ sơ các mẫu lợn Mán tại các huyện nghiên cứu
Vị Xuyên Bắc Quang Hoàng Su Phì
Tên xã Số mẫu Tên xã Số mẫu Tên xã Số mẫu
1 Việt Lâm 4 Tân Quang 4 Nậm Ty 4
2 Ngọc Linh 4 Quang Minh 4 Hồ Thầu 4
3 Trung Thành 4 Tân Thành 3 Bản Máy 3
Ghi chú: Tất cả lợn lấy mẫu đều chưa tiêm vacxin PED
Formol trung tính 10%, nước cất, cồn, xylen, parafin, thuốc nhuộm heamatoxylin, eosin,
Tủ lạnh, tủ sấy, tủ ấm 37 độ C và 56 độ C, cùng với máy đúc block và khuôn đúc, là những thiết bị quan trọng trong phòng thí nghiệm Ngoài ra, máy cắt mảnh microtom, kính hiển vi quang học, máy li tâm, vòng vớt, lam kính, lamen, dao, pank, kẹp và cốc đựng hóa chất cũng đóng vai trò thiết yếu trong nghiên cứu và phân tích Các thiết bị này hỗ trợ tối đa cho quá trình thí nghiệm, đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong công việc.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
+ Xác định tỷ lệ mắc tiêu chảy ở lợn Mán
+ Chẩn đoán lợn Mán nghi mắc PEDV bằng phương pháp RT – PCR
+ Xác định triệu chứng lâm sàng chủ yếu ở lợn mắc tiêu chảy do virus (PED) + Xác định bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh
+ Xác định bệnh tích vi thể ở một số cơ quan: Ruột, hạch ruột, gan, phổi, thận của lợn bệnh
+ Xác định các chỉ tiêu huyết học của lợn bệnh.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để thực hiện nghiên cứu và các nội dung của đề tài, chúng tôi đã áp dụng kết hợp các phương pháp nghiên cứu truyền thống và hiện đại trong lĩnh vực thú y.
3.3.1 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng
Tới các cơ sở chăn nuôi lợn, quan sát triệu chứng lâm sàng, quay phim, chụp 3 ảnh, ghi chép số liệu từng cá thể và toàn đàn
Mổ khám lợn mắc PED nhằm xác định biến đổi đại thể của các cơ quan và tổ chức liên quan Cần tiến hành trên những con lợn có triệu chứng lâm sàng rõ rệt Sau khi cố định lợn, lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ, lột da và mở xoang ngực, xoang bụng để tách rời các cơ quan nội tạng Các mẫu như phổi, tim, gan, lách, thận, ruột, hạch được thu thập cho các nghiên cứu khác nhau, trong đó một số mẫu sẽ được bảo quản trong formol 10% để làm tiêu bản vi thể Phương pháp RT-PCR sẽ được áp dụng để tiến hành phản ứng tiếp theo.
Nguyên lý của phản ứng RT – PCR:
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được phát minh bởi Kary Mullis và cộng sự vào năm 1985, đã trải qua quá trình hoàn thiện và phát triển nhờ vào việc phân lập enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus Sự thiết kế thành công các máy chu kỳ nhiệt cũng đã giúp thay đổi nhanh chóng và chính xác nhiệt độ trong từng giai đoạn phản ứng Thông qua 20 – 30 vòng PCR, hàng triệu phân tử DNA có thể được sao chép từ một phân tử ban đầu.
Phương pháp RT-PCR bao gồm các bước tách chiết RNA virus và thực hiện kỹ thuật RT-PCR RNA virus được tách chiết bằng kit QIAamp theo hướng dẫn của nhà sản xuất Quá trình này sử dụng mẫu bệnh phẩm từ lợn nghi mắc PEDV, sau đó trộn với hỗn hợp RT-PCR từ bộ kit One step RT-PCR (Invitrogen) Cặp mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR bao gồm mồi xuôi 5’-TTCTGAGTCACGAACAGCCA-3’ và mồi ngược 5’.
Để khuyếch đại đoạn gen ORF5 dài 651 bp, sử dụng mồi CATATGCAGCCTGCTCTGAA-3’ Quá trình khuếch đại được thực hiện trong máy PCR với 35 chu kỳ Kết quả RT-PCR được kiểm tra bằng điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút Cuối cùng, sản phẩm RT-PCR được quan sát và ghi lại hình ảnh trên máy chụp ảnh gel.
Các bước tiến hành phản ứng RT – PCR: Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng RT – PCR Thành phần phản ứng Thể tớch cần lấy (àl)
Chúng tôi sử dụng cặp mồi một phần gen S với độ dài 651bp, hèm theo Kit tách chiết RNA (QIAamp) do Nhật bản sản xuất
Tiến hành khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Bảng 3.3 Nhiệt độ và thời gian trong từng giai đoạn của chu kỳ nhiệt Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ ( 0C ) Thời gian Chu kỳ
Tổng hợp sợi mới 72 1 phút
Chúng tôi tiến hành để xác đinh sự có mặt của virus PED ở lợn có biểu hiện tiêu chảy, chưa được tiêm vacxin phòng PED bằng RT- PCR
RNA được chiết tách bằng kit QIAamp Viral RNA Minikit của hãng Qiagen, sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại một phần gen S với sản phẩm khuếch đại có kích thước 651bp (Park et al., 2007).
Sau khi thực hiện xét nghiệm RT-PCR và nhận được kết quả, chúng tôi đã tiến hành hồi cứu và tổng hợp các triệu chứng lâm sàng chính đã được ghi nhận trước đó.
Xác lợn chết được mổ khám theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ khoa học và Công nghệ, 2010)
3.3.4 Phương pháp nhuộm tiêu bản vi thể
Lợn Mán từ 1 đến 9 tuần tuổi có kết quả dương tính với virus PED đã được mổ khám và ghi chép lại Quá trình này bao gồm việc chụp ảnh để thu thập thông tin về bệnh tích đại thể, cũng như lấy mẫu các mô từ gan, lách, thận, phổi, dạ dày, ruột và hạch ruột Những mẫu này sau đó được ngâm trong dung dịch formol trung tính 10% để làm tiêu bản xác định bệnh tích vi thể.
Tiêu bản mô học bệnh lý được làm theo phương pháp của Prophet, E.B,
1992 bao gồm các bước: (1) Lấy mẫu; (2) khử nước, làm trong; (3) tẩm parafin;
(4) đổ block; (5) cắt dán mảnh; (6)nhuộm tiêu bản; (7) gắn lamen, dán nhãn và đọc kết quả bằng kính hiển vi (Prophet and Pathology, 1992)
Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể đã chi tiết như sau:
Để tiến hành thí nghiệm, cần chuẩn bị đầy đủ dụng cụ và hóa chất như: lọ formol 10%, dao kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 37 độ C, máy cắt mảnh microtom, nước ấm 48 – 52 độ C, xylen, paraffin, cùng với thuốc nhuộm hematoxylin và eosin.
Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là dạ dày, ruột, tim, gan, thận, lách…
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (Chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol)
Tiến hành lần lượt các bước sau:
Rửa formol: lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành từng miếng có chiều dài, rộng khoảng 4-5mm Sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h
Khử nước: cho qua hệ thống gồm 3 lọ cồn
Cồn I: 3h Cồn II: 3h Cồn III: 12h Mục đích: khử nước ra khỏi tổ chức
Khử cồn: cho qua hệ thống gồm 3 lọ xylen
Xylen I: 3h Xylen II: 3h Xylen III: 12h Mục đích: khử hết cồn ra khỏi tổ chức Yêu cầu: khi nào miếng tổ chức trong như cục thạch là được Nếu để quá lâu tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt
Khử Xylen: Cho qua hệ thống paraffin đã ổn định, đặc chắc, đồng nhất, không lẫn tạp chất, không bọt, có từ 3 – 5 % sáp ong đã nấu, gồm 3 lọ
Paraffin I: 6h trong tủ ấm 56 o C Paraffin II: 6h trong tủ ấm 56 o C Paraffin III: 12h trong tủ ấm 56 o C Mục đích: khử hết xylen trong tổ chức Trong tổ chức chỉ còn paraffin thấm đều trong các kẽ mô bào
Nếu nhiệt độ trên 56 o C tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt Đúc block
Mục đích: đưa mẫu bệnh phẩm vào trong khối paraffin tạo thành một thể thống nhất
Chuẩn bị: Máy đúc block, paraffin
Để tiến hành, đặt miếng bệnh phẩm nằm ngang vào giữa khuôn block, sau đó đổ nhanh paraffin lỏng vào khuôn Tiếp theo, chuyển khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy đúc khuôn block và để nguội cho đến khi block đông cứng hoàn toàn.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Chuẩn bị các dụng cụ cần thiết như máy cắt, dao cắt, nước ấm từ 48 đến 52 độ C, phiến kính và pank kẹp Sử dụng mỏy cắt microtom để cắt mảnh với độ dài từ 3 đến 5 mm, đảm bảo rằng mảnh cắt không bị rách hoặc nát trong quá trình cắt tổ chức.
Để xử lý mảnh cắt, hãy sử dụng pank kẹp và đặt mảnh vào nước lạnh Dàn đều để mặt dưới của mảnh cắt được ướt hoàn toàn, sau đó dùng phiến kính để hớt mảnh và chuyển sang nước ấm.
48 – 52 o C rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính Sau đó để ở tủ ấm 37 o C trong vòng 24h
Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ:
Xylen I: 30 phút Xylen II: 30 phút Xylen III: 30 phút Lưu ý: có thể để tiêu bản cần nhuộm vào xylen từ sáng, đến chiều nhuộm để tiêu bản sạch hết parafin
Khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 3 lọ:
Cồn I : 7 phút Cồn II : 7 phút Cồn III : 7 phút
Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 10 phút
Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân) Nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước lau sạch quanh tiêu bản kiểm tra màu sắc thấy tiêu bản xanh tím là được
Sau đó cho tiêu bản rửa nước 5 phút loai bỏ hết haematoxylin thừa :
Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ eosin ngập tiêu bản 5 – 10 phút, rửa nước chảy cho hết eosin thừa Tẩy nước:
Cho tiêu bản qua 3 lọ cồn 100 0 mỗi lọ 1 phút
Tẩy cồn làm trong tiêu bản:
Cho tiêu bản đi qua 3 lọ xylen, mỗi lọ 3-5 phút
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản
Kiểm tra tiêu bản bằng kính hiển vi quang học với vật kính 10 Nếu quan sát thấy màu xanh tím, bào tương có màu đỏ tươi và tiêu bản trong sáng, đồng thời không có nước hay bọt khí, thì tiêu bản đạt yêu cầu.
3.3.5 Phương pháp nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học
