(LUẬN văn THẠC sĩ) giám sát sự lưu hành và xác định một số đặc tính sinh học phân tử của virus cúm gia cầm type a h5n6 tại một số chợ buôn bán gia cầm sống trên địa bàn các tỉnh lạng sơn và quảng ninh giai đoạn 2016 2017

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM HỒNG BẠCH TUYẾT GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS CÚM GIA CẦM TYPE A/H5N6 TẠI MỘT SỐ CHỢ BUÔN BÁN GIA CẦM SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN CÁC TỈNH LẠNG SƠN VÀ QUẢNG NINH GIAI ĐOẠN 2016-2017 Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Trịnh Đình Thâu PGS.TS Tơ Long Thành NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 05 tháng năm 2017 Tác giả luận văn Hoàng Bạch Tuyết i download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Thú y quan tâm tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tơi q trình học tập thực đề tài Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc TS Trịnh Đình Thâu, người tận tình giúp đỡ hướng dẫn, tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin c Đình Thâu, người tận tình giúp đỡTơi xin c Đình Thâ, khoa Thú y, HThâu, người tận tình giúp đỡ nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Tơi xin chân thành c người tận tình giúp đỡ nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận vănn đề tài.iện thuận lợi cho chúng tơi q trình học tập thực đề tài - Cơ quan Thú y vùng II; Phòng Dn Thú y vùngngười tận tình giúp2 tPhịng Dn Thú y vùngngười tận tình giúp đỡ nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày 05 tháng năm 2017 Tác giả luận văn Hoàng Bạch Tuyết ii download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghiã khoa học: 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn: Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Khái niệm bệnh cúm gia cầm 2.2 Tình hình bệnh cúm gia cầm giới 2.2.1 Tình hình chung 2.2.2 Tình hình dịch cúm h5n6 giới 2.3 Tình hình bệnh cúm gia cầm việt nam 2.3.1 Tình hình chung 2.3.2 Tình hình bệnh cúm gia cầm h5n6 11 2.4 Căn bệnh 12 2.4.1 Đặc điểm sinh học phân tử virus cúm gia cầm 13 2.4.2 Cấu trúc, chức protein hemagglutinin neuraminidase 16 2.4.3 Tính thích ứng đa vật chủ virus cúm 21 2.4.4 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh nhân lên virus cúm a tế bào vật chủ 21 2.4.5 Độc lực khả gây bệnh virus cúm gia cầm 23 2.4.6 Triệu chứng 23 2.4.7 Bệnh tích 24 iii download by : skknchat@gmail.com 2.4.8 Chẩn đoán bệnh 24 2.5 Sơ lược hoạt động giám sát cúm gia cầm việt nam 25 2.5.1 Kết giám sát 25 2.5.2 Kết phân tích virus cúm gia cầm việt nam 26 2.6 Cơng tác phịng, chống bệnh cúm gia cầm 27 3.1 Đối tượng nghiên cứu 29 3.2 Nội dung nghiên cứu 29 3.2.1 Tình hình chăn ni dịch bệnh cúm gia cầm tỉnh từ năm 2013 đến tháng đầu năm2017 29 3.2.2 Giám sát lưu hành virus cúm a/h5n6 chợ 29 3.2.3 Thu nhận, giải trình tự gen mã hóa cho kháng nguyên số chủng dương tính cúm a/h5n6 29 3.3 Nguyên liệu 29 3.3.1 Mẫu thí nghiệm 29 3.3.2 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất lấy mẫu 29 3.4 Phương pháp nghiên cứu 31 3.4.1 Phương pháp dịch tễ học mô tả, dịch tễ học phân tích 31 3.4.2 Phương pháp lấy mẫu 31 3.4.3 Phương pháp xét nghiệm virus cúm a/h5n6 32 3.4.4 Phương pháp giải trình tự phân tích gen 34 3.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 35 Phần Kết thảo luận 36 4.1 Tình hình chăn nuôi gia cầm dịch bệnh cúm gia cầm tỉnh lạng sơn quảng ninh từ 2013– 2016 36 4.1.1 Tình hình chăn ni gia cầm tỉnh lạng sơn quảng ninh: 36 4.1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm tỉnh quảng ninh lạng sơn: 39 4.2 Kết giám sát virus cúm a/h5n6 chợ tỉnh nghiên cứu 41 4.2.1 Kết lấy mẫu tỉnh 41 4.2.2 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type a mẫu bệnh phẩm 43 4.2.3 Tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype h5 mẫu bệnh phẩm 45 4.2.4 Tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype n6 mẫu bệnh phẩm 47 4.2.5 Lưu hành virus cúm a/h5n6 qua vòng lấy mẫu 50 iv download by : skknchat@gmail.com 4.2.6 Sự lưu hành virus cúm a/h5n6 chợ lấy mẫu 52 4.3 Một số đặc điểm phân tử gen virus cúm gia cầm a/h5n6 quảng ninh lạng sơn giai đoạn 2016-2017 55 4.3.1 Kết giải trình tự gen virus cúm gia cầm a/h5n6 55 4.3.2 Kết phân tích trình tự acid amin chuỗi nối ha1 ha2 (cleavage site) chủng virus cúm gia cầm so với chủng tham chiếu 63 4.3.3 Sự tương đồng trình tự nucleotide amino acid so với chủng tham chiếu 64 4.3.4 Xây dựng phả hệ gen xác định nhánh (clade) virus cúm a/h5n6 65 Phần Kết luận kiến nghị 67 5.1 Kết luận 67 5.1.1 Tình hình chăn ni dịch bệnh cúm gia cầm tỉnh Quảng Ninh Lạng Sơn 67 5.1.3 Virus cúm a/h5n6 tỉnh quảng ninh lạng sơn có đặc tính sinh học phân tử: 67 5.2 Kiến nghị 68 Tài liệu tham khảo 69 v download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt AI Avian Influenza BNNPTNT Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn CDC Trung tâm phòng chống dịch bệnh Hoa Kỳ cs Cộng Ct Cycle of threshold DNA Deoxyribo Nucleic Acid GP Glycoprotein FAO Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên hợp quốc HA Hemagglutination HI Hemagglutination Inhibition HPAI Highly pathogenic avian influenza LPAI Low pathogenic avian influenza NA Neuraminidase OIE Office International des Epizooties PB1 Polymerase basic protein PB2 Polymerase basic protein PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid RNP Ribonucleoprotein Tp Thành phố VAHIP Dự án phòng chống dịch cúm gia cầm , cúm người USAID Cơ quan phát triển Hoa Kỳ WHO World Health Organization vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tình hình dịch cúm gia cầm giới giai đoạn 2004 - 2016 Bảng 2.2 Tình hình bệnh cúm H5N1 người giai đoạn 2003 - 2017 Bảng 2.3 Tóm tắt chủng virus cúm gia cầm Việt Nam, 2003 - 2016 26 Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi đoạn dò để phát virus H5N6 giải trình tự gen HA .31 Bảng 4.1 Tổng đàn gia cầm Lạng Sơn Quảng Ninh gia đoạn 2013-2016 36 Bảng 4.2 Tình hình dịch cúm gia cầm tỉnh giai đoạn 2013 – tháng đầu năm 2017 39 Bảng 4.3 Kết lấy mẫu Quảng Ninh Lạng Sơn 42 Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A mẫu bệnh phẩm 43 Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype H5 mẫu bệnh phẩm 45 Bảng 4.6 Tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype N6 mẫu bệnh phẩm 47 Bảng 4.7 Lưu hành virus cúm A/H5N6 qua tháng lấy mẫu 50 Bàng 4.8 Lưu hành virus cúm A/H5N6 chợ lấy mẫu 53 Bảng 4.9 Bảng ký hiệu chủng virus cúm A/H5N6 Lạng Sơn Quảng Ninh giải trình tự gen HA 55 Bảng 4.10 Sự biến đổi nucleotide amino acid chủng nghiên cứu so với chủng tham chiếu A/Chicken/VN/LangSon/2014 62 Bảng 4.11 So sánh tỷ lệ đồng nucleotide tương đồng amino acid HA chủng nghiên cứu với chủng tham chiếu.Phía dường chéo tỷ lệ tương đồng nucleotide, phía đường chéo tỷ lệ tương đồng amino acid 65 vii download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ lịch sử đại dịch cúm người Hình 2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm giới giai đoạn 2004 – 2016 Hình 2.3 Tình hình bệnh cúm H5N1 người giai đoan 2003 – 2016 Hình 2.4 Cấu trúc bên virus cúm gia cầm 13 Hình 2.5 Cấu trúc hệ gen virus cúm type A 16 Hình 2.6 Mơ hình chế xâm nhiễm nhân lên virus cúm A tế bào chủ 22 Hình 3.1 Quy trình xét nghiệm phát virus cúm A/H5N6 33 Hình 4.1 Tổng đàn gia cầm tỉnh giai đoạn 2013 – 2016 37 Hình 4.2 Bản đồ dịch cúm Quảng Ninh 2013 - 2017 40 Hình 4.3 Bản đồ dịch cúm Lạng Sơn 2013 - 2017 40 Hình 4.4 Biểu đổ tỷ lệ nhiễm virus cúm type A mẫu bệnh phẩm 44 Hình 4.7 Biểu đồ Lưu hành virus cúm A/H5N6 qua tháng lấy mẫu 51 Hình 4.8 Biểu đồ Lưu hành virus cúm A/H5N6 chợ lấy mẫu 54 Hình 4.9 Trình tự chuỗi nucleotide gen HA chủng nghiên cứu 59 Hình 4.10 Trình tự amino acid gen HA chủng nghiên cứu 61 Hình 4.11 Chuỗi nối (Cleavage sites) HA1 HA2 chủng nghiên cứu chủng tham chiếu 64 Hình 4.12 Cây phả hệ gen HA chủng virus Cúm gia cầm H5N6 .66 viii download by : skknchat@gmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hồng Bạch Tuyết Tên luận văn: “Giám sát lưu hành xác định số đặc tính sinh học phân tử virus cúm gia cầm type A/H5N6 số chợ buôn bán gia cầm sống địa bàn tỉnh Lạng Sơn Quảng Ninh giai đoạn 2016-2017” Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Xác định lưu hành số đặc tính sinh học phân tử chủng virus cúm gia cầm A/H5N6 địa bàn tỉnh nghiên cứu nhằm cảnh báo sớm dịch cúm gia cầm điều chỉnh biện pháp phòng, chống dịch cho phù hợp Phương pháp nghiên cứu: - Dùng phương pháp dịch tễ học mơ tả, dịch tễ học phân tích để điều tra tình hình chăn ni gia cầm tình hình dịch bệnh tỉnh giai đoạn từ năm 2013 đến hết năm 2016 - Sử dụng quy trình TCCS 16:2016/TYV2-CĐ Cơ quan Thú y vùng II để xét nghiệm virus cúm A/H5N6 mẫu bệnh phẩm - Xác định biến đổi di truyền nhánh virus cúm gia cầm type A/ H5N6 lưu hành kỹ thuật giải trình tự phân tích trình tự gene HA thông qua phần mềm MEGA6.0 BioEdit Kết nghiên cứu chính: - Tình hình dịch cúm gia cầm tỉnh từ 2013 - tháng đầu năm 2017 - Giám sát lưu hành virus cúm A/H5N6 chợ + Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm type A mẫu bệnh phẩm + Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype H5 mẫu bệnh phẩm + Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype N6 mẫu bệnh phẩm + Xác định lưu hành virus cúm A/H5N6 qua vòng lấy mẫu + Xác định lưu hành virus cúm A/H5N6 chợ lấy mẫu - Thu nhận, giải trình tự gen mã hóa cho kháng nguyên HA số chủng dương tính cúm A/H5N6 - Phân tích, so sánh tương đồng nucleotide aminoacid gen HA với chủng tham chiếu, xác định chuỗi nối HA1 HA2, xác định mối quan hệ phả hệ ix download by : skknchat@gmail.com A/Duck/VN/QuangNinh/7577-6 201 G C T C A/chicken/VN/LangSon/NCVD(14A3 A/Chicken/QuangNinh/6782-3 201 A/Chicken/QuangNinh/6782-4 201 A/Chicken/VN/LangSon/4084-45 A/Duck/VN/LangSon 4084-54 2016 A/Duck/VN/QuangNinh/7577-5 201 A/Duck/VN/QuangNinh/7577-6 201 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AGCTTAGGGACAATGCAAAGGAGCTGGGTAATGGTTGTTTTGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAATGGGACATATGA T C T C T G T G T G T G A/chicken/VN/LangSon/NCVD(14A3 A/Chicken/QuangNinh/6782-3 201 A/Chicken/QuangNinh/6782-4 201 A/Chicken/VN/LangSon/4084-45 A/Duck/VN/LangSon 4084-54 2016 A/Duck/VN/QuangNinh/7577-5 201 A/Duck/VN/QuangNinh/7577-6 201 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CTACCCGCAATATTCAGAAGAAGCAAGATTAAAAAGAGAAGAAATAAGCGGAGTGAAATTAGAGTCAATAGGAACTTACCAAATACTGTCAATTTATTCA T G G G A .G T G G G A .G T G G G G G A G G T G G G G G A G G T G G G G A .G T G G G G A .G A/chicken/VN/LangSon/NCVD(14A3 A/Chicken/QuangNinh/6782-3 201 A/Chicken/QuangNinh/6782-4 201 A/Chicken/VN/LangSon/4084-45 A/Duck/VN/LangSon 4084-54 2016 A/Duck/VN/QuangNinh/7577-5 201 A/Duck/VN/QuangNinh/7577-6 201 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATAGTGGCTGGTTTATCTTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTGCAGTGCAGAATTTGCATTTAA .T T .C A A A G T T .C A A A G T .C A A A G T .C A A A G T .C A A A -~~~ T .C A A A G Hình 4.9 Trình tự chuỗi nucleotide gen HA chủng nghiên cứu 59 download by : skknchat@gmail.com A/chicken/VN/LangSon/NCVD(14A3 A/Chicken/QuangNinh/6782-3 201 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ~~~~~MEKIVLLLAIISLVKGDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLNGVKPLILKDCSVAGWLLGNPMCDEFIRVPEWSYI ~~~~~~~X VV S .R A/Chicken/QuangNinh/6782-4 201 ~~~~~~~X VV S .R A/Chicken/VN/LangSon/4084-45 ~~~~~~~X VV S .R A/Duck/VN/LangSon 4084-54 2016 ~~~~~~~X VV S .R A/Duck/VN/QuangNinh/7577-5 201 PGLSVNGE VV S .R A/Duck/VN/QuangNinh/7577-6 201 ~~~~~~~X VV S .R 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | A/chicken/VN/LangSon/NCVD(14A3 VERANPANDLCYPGNLNDYEELKHLLSRINHFEKILIIPKSSWTNHETSLGVSAACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNDAYPTIKISYNNTNQEDLLILWGIH A/Chicken/QuangNinh/6782-3 201 P K T P Q I M N A/Chicken/QuangNinh/6782-4 201 P T P Q I M N A/Chicken/VN/LangSon/4084-45 P T P V M S A/Duck/VN/LangSon 4084-54 2016 P T P V M S A/Duck/VN/QuangNinh/7577-5 201 PH T P V M S A/Duck/VN/QuangNinh/7577-6 201 PH .W T P V M S 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | A/chicken/VN/LangSon/NCVD(14A3 HSNNAAEQTNLYKNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSQVNGQRGRMDFFWTILKPNDAIHFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSEVEYGHCNTKCQ A/Chicken/QuangNinh/6782-3 201 D V M A/Chicken/QuangNinh/6782-4 201 D V M A/Chicken/VN/LangSon/4084-45 D V M A/Duck/VN/LangSon 4084-54 2016 D V M A/Duck/VN/QuangNinh/7577-5 201 D V M A/Duck/VN/QuangNinh/7577-6 201 D V M 60 download by : skknchat@gmail.com 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | A/chicken/VN/LangSon/NCVD(14A3 TPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLREKRRKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTN A/Chicken/QuangNinh/6782-3 201 .R A/Chicken/QuangNinh/6782-4 201 .R A/Chicken/VN/LangSon/4084-45 .R A/Duck/VN/LangSon 4084-54 2016 .R A/Duck/VN/QuangNinh/7577-5 201 .R A/Duck/VN/QuangNinh/7577-6 201 .R 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | A/chicken/VN/LangSon/NCVD(14A3 A/Chicken/QuangNinh/6782-3 201 A/Chicken/QuangNinh/6782-4 201 A/Chicken/VN/LangSon/4084-45 A/Duck/VN/LangSon 4084-54 2016 A/Duck/VN/QuangNinh/7577-5 201 A/Duck/VN/QuangNinh/7577-6 201 KVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECME A/chicken/VN/LangSon/NCVD(14A3 A/Chicken/QuangNinh/6782-3 201 A/Chicken/QuangNinh/6782-4 201 A/Chicken/VN/LangSon/4084-45 A/Duck/VN/LangSon 4084-54 2016 A/Duck/VN/QuangNinh/7577-5 201 A/Duck/VN/QuangNinh/7577-6 201 510 520 530 540 550 560 570 | | | | | | | | | | | | | | SVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIIVAGLSLWMCSNGSLQCRICI* * * M .* M .* .X~ * Hình 4.10 Trình tự amino acid gen HA chủng nghiên cứu 61 download by : skknchat@gmail.com Sau có trình tự chuỗi gen HA, tiến hành so sánh biến đổi thành phần nucleotide acid amin chủng virus phân lập với chủng virus cúm tham chiếu A/Chicken/VN/LangSon/2014 Chủng virus tham chiếu phân lập ổ dịch cúm gia cầm A/H5N6 nước ta xảy vào tháng năm 2014 Tràng Định, Lạng Sơn Kết trình bày bảng 4.10 Bảng 4.10 Sự biến đổi nucleotide amino acid chủng nghiên cứu so với chủng tham chiếu A/Chicken/VN/LangSon/2014 Ký hiệu A/Chicken/VN/ LangSon/4084- Nucleotide sai khác G-A (47), T-C (31), A-C(6), G- 45/2016 H5N6 T(4,), A-T (4) GC (1) A/Duck/VN/La ngSon/4084- G-A (46), T-C (31), A-C(6), G- 54/2016 H5N6 T(4,), A-T (4) A/Chicken/VN/Qu angNinh/6782-3 2016 H5H6 A/Chicken/VN/ QuangNinh/67 82-4 H5N6 A/Duck/VN/Qu ảng Ninh/75776/2016 H5N6 Số sai khác HA1 Số sai khác HA2 Tổng số sai khác HA Nu AA Nu AA Nu AA 72 10 21 93 12 73 10 18 91 12 69 12 23 92 14 72 10 20 92 12 74 11 21 95 13 95 13 G-A (41), T-C (33), A-C(9), GT(4,), A-T (4), G-C (1) G-A (41), T-C (33), A-C(9), GT(4,), A-T (4), G-C (1) G-A (48), T-C (31), A-C(8), GT(5,), A-T (3) A/Duck/VN/Quảng G-A (48), T-C Ninh /7577-5/2016(31), A-C(8), GH5N6 T(5,), A-T (3) 11 74 21 Từ bảng 4.10 cho thấy có biến đổi nucleotide rõ ràng chủng nghiên cứu so với chủng tham chiếu A/Chicken/VN/LangSon/2014 Tổng vị trí biến đổi dao động từ 91 đến 95 vị trí tồn gen HA, sai khác nucleotide chủ yếu biến đổi đồng hoán, xảy base 62 download by : skknchat@gmail.com nhóm purines (A G) pyrimidines (T C) Sự sai khác dị hoán tức hoán đổi base purines thành pyrimidines ngược lại xảy Sự biến đổi thành phần nucleotide tập trung chủ yếu phần HA1 với 69 đến 74 vị trí, phần HA2 có biến đổi nhẹ, dao động từ 18 đến 23 vị trí Từ thành phần nucleotide đoạn gene thu được, chúng tơi tiến hành xác định trình tự acid amin tương ứng gen HA qui định so sánh trình tự axit amin với chủng tham chiếu Những sai khác nucleotide ba mã hóa dẫn đến sai khác thành phần amino acid (vị trí nucleotide thứ ba mã hóa), có thay đổi nucleotie mà dẫn đến thay đổi amino acid, amino acid nhiều ba mã hóa Từ hình 4.7 4.8 bảng 4.10 cho thấy có khoảng 91 đến 95 vị trí sai khác nucleotide làm thay đổi 12-14 amino acid chủng nghiên cứu so với chủng tham chiếu Tương tự nucleotide, biến đổi amino acid chủ yếu diễn đoạn HA1 với 10 đến 12 trí, đoạn HA2 tương đối ổn định, biến đổi nhẹ vị trí tất chủng nghiên cứu 4.3.2 Kết phân tích trình tự acid amin chuỗi nối HA1 HA2 (cleavage site) chủng virus cúm gia cầm so với chủng tham chiếu Gen HA bao gồm đoạn HA1 HA2 nồi với chuỗi oligopeptide, mã hóa dãy amino acid, tạo nên điểm cắt protease Đây vùng định độc lực hay tính gây bệnh virus cúm gia cầm, vào đặc điểm đoạn nối để phân loại virus cúm gia cầm độc lực thấp hay độc lực cao (Offlu, 2016) Theo đó, virus cúm gia cầm độc lực thấp , vùng nối HA0 chứa amino acid Arginine (K) vị trí -1, bị phân cắt enzyme tripsine, enzyme có chủ yếu tế bào biểu mơ ruột non hầu họng, bệnh mang tính cục Trong đó, chuỗi nối HA0 virus cúm gia cầm độc lực cao có chứa nhiều amino acid mang tình kiềm Lysine (K) Arginine (R) dễ dang bị phân cắt enzyme furrine, enzyme phổ biến mô bào thể, nhiễm virus cúm gia cầm thể độc lực cao, bệnh thể mang tính tồn thân, nặng Do vậy, trình tự mã hóa chuỗi nối HA1 HA2 coi thị phân tử phân tích gen kháng nguyên HA Sau có trình tự acid amin chủng nghiên cứu, tiến hành xác định chuỗi nối so sánh với chủng tham chiếu, kết thể qua khung màu đỏ hình 4.11 63 download by : skknchat@gmail.com Hình 4.11 Chuỗi nối (Cleavage sites) HA1 HA2 chủng nghiên cứu chủng tham chiếu Từ hình 4.11 cho thấy, đoạn nối HA1 HA2 (cleavage site) chủng tham chiếu có motif PLREKRRKR/GLF, chủng nghiên cứu có trình tự PLRERRRKR/GLF Có khác biệt trình tự vị trí nối so với chủng tham chiếu, Argrnine (R ) vị trí 306 thay Lysine (K) chủng nghiên cứu Theo báo cáo Offlu, ngày tháng 12 năm 2016 motif dạng với cleavage sites virus cúm gia cầm độc lực cao 4.3.3 Sự tương đồng trình tự nucleotide amino acid so với chủng tham chiếu Để xác định tương đồng trình tự nucleotide amino acid gen HA thuộc chủng virus cúm A/H5N6 nghiên cứu so với chủng tham chiếu A/Chicken/VN/LangSon/2014, tiến hành so sánh phân tích tương đồng dựa phần mềm BioEdit 7.2.6 Kết trình bày bảng 4.11 Từ bảng cho thấy, hầu hết trình tự amino acid nucleotide chủng phân lập Quảng Ninh Lạng Sơn có độ tương đồng cao Cụ thể, tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotide chủng nghiên cứu dao động từ 97,5 đến 100% tỷ lệ tương đồng amino acid 98,8 đến 100% Có khác biệt rõ ràng chủng phân lập năm 2016 so với chủng tham chiếu A/Chicken/VN/LangSon/2014 , thể qua tỷ lệ tương đồng nucleotide từ 93,9 đến 94,2% tương đồng amino acid từ 97,5 đến 97,7% 64 download by : skknchat@gmail.com Bảng 4.11 So sánh tỷ lệ đồng nucleotide tương đồng amino acid HA chủng nghiên cứu với chủng tham chiếu Phía dường chéo tỷ lệ tương đồng nucleotide, phía đường chéo tỷ lệ tương đồng amino acid A/chicken/VN/LangSon/2014_H5N6_2344A 94,2 A/Chicken/VN/LangSon/4084-45 2016 H5N6 97,7 A/Chicken/VN/LangSon 4084-54 2016 H5N6 97,7 94,2 94,1 94,1 94,1 93,9 97,5 97,6 99,1 99,0 97,5 97,6 99,1 99,0 99,9 97,6 97,4 97,6 97,5 A/Chicken/QuangNinh/6782-3 2016 H5N6 97,5 99,0 99,0 A/Chicken/QuangNinh/6782-4 2016 H5N6 97,7 99,2 99,2 99,8 A/Duck/VN/QuangNinh/7577-6 2016 H5N6 97,5 99,4 99,4 98,8 99,0 A/Duck/VN/QuangNinh/7577-5 2016 H5N6 97,5 99,4 99,4 98,8 99,0 99,6 99,6 4.3.4 Xây dựng phả hệ gen HA xác định nhánh (clade) virus cúm A/H5N6 Để xác định clade virus cúm A/H5N6 lưu hành tỉnh Lạng Sơn Quảng Ninh hiểu rõ nguồn gốc, liên quan di truyền chủng H5N6 lưu hành tỉnh nghiên cứu với địa phương nước nước quanh khu vực, tiến hành xây dựng phả hệ virus cúm A/H5N6 dựa trình tự gen HA chủng virus phát nghiên cứu với trình tự gen HA chủng virus cúm gia cầm (A/H5N6) dòng Tứ Xuyên, Giang Tây thuộc Trung Quốc virus cúm A/H5N1) công bố Genbank ( Bi et al., 2015) Kết thể hình 4.12 Cây phả hệ gen HA xây dựng phần mềm MEGA7 (Tamura et al., 2013) với phương pháp kết nối liền kề (Neighbor Joining), sử dụng boostrap với 1000 lần lặp lại Kết phân tích phả hệ cho thấy virus cúm A/H5N6 năm 2014 2016 thuộc clade 2.3.4.4 chia làm nhánh nhỏ 2.3.4.4A 2.3.4.4B chủng virus cúm A/H5N6 lưu hành Quảng Ninh Lạng Sơn có quan hệ gần nằm phân nhánh 2.3.4.4B thuộc dòng Giang Tây , chủng tham chiếu chủng virus cúm A/H5N6 Việt Nam phân lập năm 2014 thuộc phân nhánh 2.3.4.4A thuộc dòng Tứ Xuyên 65 download by : skknchat@gmail.com Trung Quốc Kết phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Đăng Thọ cs (2016), theo virus cúm gia cầm H5N6 việt nam có phân hóa rõ ràng theo thời gian Các chủng virus cúm gia cầm H5N6 phân lập ổ dịch năm 2014 thuộc nhánh 2.3.4.4.A- dòng Tứ Xuyên, chủng H5N6 phân lập năm 2015 thuộc nhánh 2.3.4.4B, dòng Giang Tây A/Chicken/VN/LangSon/4084-45 2016 H5N6 100 A/Duck/VN/LangSon 4084-54 2016 H5N6 100 A/Duck/VN/QuangNinh/7577-5 2016 H5N6 99 100 A/Duck/VN/QuangNinh/7577-6 2016 H5N6 A/Chicken/QuangNinh/6782-3 2016 H5N6 96 100 100 A/Chicken/QuangNinh/6782-4 2016 H5N6 A/duck/Vietnam/LBM638/2014(H5N1) 2344B 2014-03-12 | A/duck/Laos/LPQ002/2014 | A / H5N6 | HA KX094400.1(A/duck/Guangzhou/018/2014(H5N6HA 100 98 Clade 2.3.4.4B KJ754145.1(A/duck/Guangdong/GD01/2014(H5N6 HA 51 Clade 2.3.4.4 KP090447.1A/chicken/Jiangxi/NCDZT1126/2014(H5N6 HA 45 100 A/duck/Jiangxi/NCDZT1126/2014(H5N6) A/breeder chicken/Korea/H122/2014(H5N8) 100 100 A/broiler duck/Korea/H65/2014(H5N8) A/chicken/VN/LangSon/NCVD(14A324)/2014 H5N6 2344A KM251463.1(A/chicken/Sichuan/NCJPL1/2014(H5N6 HA 99 100 95 A/chicken/Sichuan/NCJPL1/2014(H5N6) A/duck/VN/QuangNgai(14A421)/2014 H5N6 2344A 33 80 99 A/pheasant/VN/LaoCai/NCVD(14A367)/2014 H5N6 2344A 58 A/duck/VN/QuangTri(14A392)/2014 H5N6 2344A Clade 2.3.4.4A Clade 2341 A/duck/Hue/V6/2010 H5N1 HPAI Clade 2342 A/duck/Yunnan/6490/2006 H5N1 66 89 91 Clade 2343 A/chicken/Vietnam/NCVD-A015/2008 H5N1 clade2321 A/duck/Hunan/3/2007 clade213 A/chicken/Central Java/UT3091/2005 H5N1 HPAI clade1 A/goose/Hong Kong/739.2/2002 H5N1 HPAI AF144305.1 (A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1(HA) 0.01 Hình 4.12 Cây phả hệ gen HA chủng virus Cúm gia cầm H5N6 Các chủng virus H5N6 nghiên cứu Các chủng virus H5N6 Việt Nam năm 2014 Các chủng virus tham chiếu dòng Tứ Xuyên Giang Tây 66 download by : skknchat@gmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 5.1.1 Tình hình chăn ni dịch bệnh cúm gia cầm tỉnh Quảng Ninh Lạng Sơn - Lạng Sơn Quảng Ninh tỉnh có đàn gia cầm cao, chủ yếu chăn nuôi phân tán nhỏ lẻ - Từ năm 2013 – tháng đầu năm 2017, tỉnh xảy 30 ổ dịch cúm gia cầm H5N6 Quảng Ninh có 21 ổ làm ốm chết, phải tiêu hủy 32.041 gia cầm ; Lạng Sơn có ổ dịch với 2.080 gia cầm phải tiêu hủy 5.1.2 Giám sát lưu hành virus cúm A/H5N6 cho thấy - Tỷ lệ dương tính với virus cúm A tỉnh nghiên cứu 39,0% (95% CI:35,74-42,35) Trong Quảng Ninh tỷ lệ dương tính 48,15% (95% CI: 43,35-52,97), Lạng Sơn 29,86% (95% CI: 25,58-34,42) - Tỷ lệ dương tính với virus cúm subtype H5 5.90% (95% CI: 4,43-7,69) Trong Lạng Sơn 6,71% (95% CI: 4,54-9,50) Tại Quảng Ninh 5,09% (95% CI: 3,22-7,61) - Tỷ lệ dương tính với virus cúm subtype N6 3.70% (95% CI: 2.55-5.19) Tỷ lệ ở tỉnh sau: Lạng Sơn 4,40% (95% CI: 2,63-6,78) Quảng Ninh 3,01% (95% CI: 1,61-5,09) - Lưu hành virus cúm A/H5N6 tập trung vào tháng 1,2,3 hàng năm - Phát 07/08 chợ có lưu hành virus cúm A/H5N6 5.1.3 Virus cúm A/H5N6 tỉnh Quảng Ninh Lạng Sơn có đặc tính sinh học phân tử -Tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotide gen HA chủng nghiên cứu chủng tham chiếu 97,5-97,7% tương đồng trình tự amino acid dao động từ 93,9-94,2% - Trình tự acid amin vị trí nối HA1 HA2 RERRRKR/GLF - Các chủng virus cúm gia cầm A/H5N6 lưu hành Lạng Sơn Quảng Ninh thuộc clade 2.3.4.4B 67 download by : skknchat@gmail.com 5.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu xác định subtype H N khác virus cúm gia cầm nước ta nói chung tỉnh giám sát nói riêng - Tiếp tục thực giải trình tự toàn hệ gen virus cúm A/H5N6 để xác định đặc tính sinh học phân tử gen, xác định biến đổi, đột biến Trên sở có biện pháp phịng chống dịch có hiệu cao - Tiếp tục giám sát lưu hành virus cúm gia cầm type A/H5N6 đàn gia cầm chợ địa bàn tỉnh Lạng Sơn Quảng Ninh tỉnh có đường biên giới với Trung Quốc, tỉnh nằm tuyến đường vận chuyển gia cầm nhập lậu với số lượng mẫu lớn thời gian liên tục năm Bên cạnh cần có hướng chuyển đổi, xây dựng chợ bn bán, lị giết mổ tập trung có quản lý, giám sát chặt chẽ quan thú y với đầy đủ trang thiết bị kỹ thuật nhằm nhanh chóng phát xử lý gia cầm có nguy mắc cúm 68 download by : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước: Bùi Quang Anh (2005) Báo cáo dịch cúm gia cầm, Hội nghị kiểm soát dịch cúm gia cầm khu vực châu Á FAO, OIE tổ chức, từ 23 – 25 tháng năm 2005, thành phố Hồ Chí Minh Bộ Nơng nghiệp & Phát triển nông thôn, Bộ Y tế (2013) Hướng dẫn phối hợp phòng, chống bệnh lây truyền từ động vật sang người, Thông tư liên tịch 16/2013/TTLT-BYT-BNNPTNT, Hà Nôi Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn (2014) Ban hành Kế hoạch hành động ứng phó khẩn cấp với chủng virus cúm nguy hiểm có khả lây lan sang người, Quyết định số 210/QĐ-BNN-TY, Hà Nội Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn (2016) Quy định vể phịng, chống dịch bệnh động vật cạn, Thơng tư số 07/2016/TT-BNN, Hà Nội Cơ quan Thú y vùng II (2016) Hội nghị giao ban công tác thú y vùng tả ngạn Sông Hồng tháng đầu năm 2016, Thái Bình Cục Thú y (2014) Báo cáo cơng tác thú y năm 2014, Hà Nội Cục Thú y (2016) Hướng dẫn giám sát cúm gia cầm chợ năm 2016, Hà Nội Cục Thú y (2017) Hướng dẫn giám sát cúm gia cầm chợ năm 2017, Hà Nội Cục Thú y (2016) Báo cáo công tác thú y năm 2015, Hả Nội 10 Cục Thú y (2016) Thông báo lưu hành virus LMLM, cúm gia cầm, tai xanh hướng dẫn sử dụng vaccine năm 2016, Hà Nội 11 Cục Thú y (2016) Báo cáo tổng kết tháng đầu năm 2016, Hà Nội 12 Lê Thanh Hịa (2004) Họ Orthomyxoviridae nhóm virus cúm A gây bệnh người gà, Viện khoa học cơng nghệ 13 Lê Thanh Hồ, Đinh Duy Kháng Lê Trần Bình (2006) Sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 quan hệ lây nhiễm tự nhiên Y – Sinh học phân tử, I (chủ biên: Lê Thanh Hòa) NXB Y học, Hà Nội, tr 29-48 14 Lê Văn Năm (2004) Bệnh cúm gia cầm Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y.11 (01) tr 81–86 15 Nguyễn Bá Hiên, Phạm Sĩ Lăng, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Tùng, Đỗ Ngọc Thúy, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Trịnh Đình Thâu, Trần Quang Vui, Lê Văn Phan, 69 download by : skknchat@gmail.com Phạm Đức Phúc, Phạm Thị Mỹ Dung (2014) Bệnh cúm người động vật Nhà xuất Nông nghiệp 16 Nguyễn Huy Đăng (2014) Giám sát lưu hành virus cúm A/H5N1 gia cầm chợ đầu mối địa bàn thành phố Hà Nội Khoa học kỹ thuật Thú y 21 (1) tr 20-24 17 Nguyễn Ngọc Tiến (2013) Tình hình dịch cúm gia cầm giai đoạn 2008-2012 biện pháp phịng chống Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y 20 (01).tr 82-90 18 Nguyễn Tiến Dũng (2004) Bệnh cúm gia cầm, hội thảo số biện pháp khôi phục đàn gia cầm sau dập dịch Hà Nội, tr 5-9 19 Nguyễn Tiến Dũng (2005) Giám sát bệnh cúm gia cầm Thái Bình Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y.12 (2) tr 6-12 20 Nguyễn Tiến Dũng (2005) Giám sát tình trạng nhiễm virus cúm gia cầm đồng sơng Cửu Long cuối năm 2004 Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y.12 (3).tr 13-18 21 Phạm Sỹ Lăng (2004) Diễn biến bệnh cúm gà giới Hội thảo số biện pháp khôi phục đàn gia cầm sau dập dịch, Hà Nội.tr 33-38” 22 Phạm Thành Long (2016) Kết giám sát lưu hành virus cúm gia cầm chợ giai đoạn 2015 – 2016 Tập huấn giám sát lấy mẫu cúm gia cầm, cúm lợn, Thành phố Hải Phòng 23 Phạm Thành Long (2016) Tình hình dịch cúm gia cầm Việt Nam Tập huấn giám sát lấy mẫu cúm gia cầm, cúm lợn, Thành phố Hải Phịng 24 Tơ Long Thành (2004) Thông tin cập nhật tái xuất bệnh cúm gia cầm nước Châu Á Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y 11 (04).tr 87-93 Tài liệu nước ngoài: Alexander D.J (1993) Orthomyxovirus Infections In Viral Inffections of Vertebrates, Volume 3: Viral Infections of Birds McFerran J.B & McNulty M.S., eds Horzinek M.C., Series editor Elserviers, Amsterdam, the Netherlands pp 287 – 316 Aoki F Y., G Boivin and N Roberts (2007) Influenza virus susceptibility and resistance to oseltamivir Antivir Ther Vol 12(4B) pp 603-16 Baigent S J and J W Mc Cauley (2001) Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture Virus Res Vol 79(1-2) pp 177-185 70 download by : skknchat@gmail.com Basler CF (2007) Influenza viruses: basic biology and potential drug targets Infect Disord Drug Targets Vol 7(4) pp 282-293 Review Beard C W (1998) Avian Influenza In Foreign Animal Disease, United States Animal Health Association pp 71-80 Bender C., H Hall, J Huang, A Klimov, N Cox, A Hay, V Gregory, K Cameron, W Lim and K Subbarao (1999) Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in1997– 1998 Vol 254 pp 115-123 Bi et al, Two novel reassortants of avian influenza A (H5N6) virus in China, Journal of General Virology (2015), 96, 975–9812 Bosch F.X., W Garten, H.D Klenk and R Rott (1981) Proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutininss; primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolytic cleavability and pathogenicity of avian influenza viruses Vol 113 pp 725-735 David A Steinhauer1, Role of Hemagglutinin Cleavage for the Pathogenicity of Influenza Virus, Virology 258, 1–20 (1999) 10 Chen H., G J D Smith, K S Li, J Wang, X H Fan, J M Rayner, D Vijaykrishna, J X Zhang, L J Zhang, C T Guo, C L Cheung, K M Xu, L Duan, K Huang, K Qin, Y H C Leung, W L Wu, H R Lu, Y Chen, S Xia, T S P Naipospos, K Y Yuen, S S Hassan, S Bahri, T D Nguyen, R G Webster, J S M.Peiris and Y Guan (2006) Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: Implications for pandemic control Proc Natl Acad Sci USA Vol 103(8) pp 2845-2850 11 Conenello G.M., D Zamazin, L.A Perrone, T Tumpey and P Palese (2007) A single mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence PloS Pathog Vol 3(10): 1414-1421 12 De Wit E and R.A Foichier (2008) Emerging influenza J Clin Virol Vol 41 (1) pp 1-6 13 Frank Y.K Wong, Christopher Morrisry, Bounlom Douangngeun (2015) Reassortant hight pathogenic influenza A (H5N6) virrus in Laos.Vol.21, No.3 14 Gambotto A., S.M Barratt-Boyes, M.D Jong, G Neumann and Y Kawaoka (2008) Human infection with highly pathogenic H5N1 influenza virus Lancet Vol 731 (9622) pp 1464-1475 Review 71 download by : skknchat@gmail.com 15 Ito T., J.N Couceiro, S Kelm, L.G Baum, S Krauss, M.R Castrucci, I Donatelli, H Kida, J.C Paulson, R.G Wobster and Y Kawaoka (1998) Molecular basis for the generation in pigs of influaenza A viruses with pandemic potential Vol 72 pp 7367-7373 16 Keawcharoen J., A Amonsin, K Oraveerakul, S Wattanodorn, T Papravasit, S Karnda, K Lekakul, R Pattanarangsan, S Noppornpanth, R.A Fouchier, A.D Osterhaus, S Payungporn, A Theamboonlers and Y Poovorawan (2005) Characterization of the hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virusisolates from different avian species in Thailand Vol 49(4) 17 Luong G and P Palese (1992) Genetic analysis of influenza virus Curr Opinion Gen Develop Vol pp 77-81 18 Miriam Cohen , Xing-Quan Zhang2 , Hooman P Senaati1 , Hui-Wen Chen, Influenza A penetrates host mucus by cleaving sialic acids with neuraminidase, Virology Journal 2013, 10:321 19 Murphy B.R and Webster (1996) Orthomyxoviruses, In Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M, (eds.) Fields Virology, 3rd ed, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia pp 1397-1445 20 Offlu, Influenza A Cleavage Sites, Version 6, December 2016 21 Suarez D.L and S Schultz-Cherry (2000) Immunology of avianinfluenza virus: a review Dev Comp Immunol Vol 24(2-3) pp 269-283 22 Subbarao K., A Klimov, J Katz, H Regnery, W Lim and H Hall (1998) Charavterization of an avian influenza A (H5N1) viruses isolatedfrom a child with a fatal respiratory illness Vol 279 pp 393-396 23 Suxiang Tong1*, Xueyong Zhu2, Yan Li1, Mang Shi New world bats harbor diverse influenza A viruses, 2013 Plos pathogen, vol9, issue 10 24 Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, and Kumar S (2013) MEGA6:Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 Molecular Biology and Evolution:30 2725-2729 25 Taubenberger J.K (1997) Initial genetic characterization of the 1918 "Spanish" influenza virus Science Vol 275 pp 1793-6 26 Uiprasertkul M., R Kitphati, P Puthavathana, R Kriwong, A Kongchanagul, K Ungchusak, S Angkasekwinai, K Chokephaibulkit, K Srisook, N 72 download by : skknchat@gmail.com Vanprapar and P Auewarakul (2007) Apoptosis and pathogensis of avian influenza A (H5N1) viruses in humans Emerg Infect Dis Vol 13(5): 708-712 27 Wangner R., M Matrosovich and H Klenk (2002) Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in fluenza virus infections Vol 12(3) pp 159166 28 Wasilenko J.L., C.W Lee, L Sarmento, E Spackman, D.R Kapczynski, D.L Suarez and M.J Pantin-Jackwood (2008) NP, PB1 and PB2 viral genes contribute to altered replication of H5N1 avian influenza viruses in chickens Vol 82(9) pp 4544-4553 29 Webster R G., Y Guan, M Peiris, D Walker, S Krauss, N N Zhou, E A Govorkova, T M Ellis, K C Dyrting, T Sit, D R Perez and K F Shortridge (2002) Characterization of H5N1 influenza viruses that continue to circulate in geese in southeastern China Vol 76(1) pp 118-126 30 Wolfgang Garten Hans-Dieter Klenk, Cleavage Activation of the Influenza Virus Hemagglutinin and Its Role in Pathogenesis, Avian Influenza 2008, vol 27, pp 156–167 31 Wu W L., Y Chen, P Wang, W Song, S Y Lau, J M Rayner, G J Smith, R G Webster,J S Peiris, T Lin, N Xia, Y Guan and H Chen (2008).Antigenic profile of avian H5N1 viruses in Asia from 2002 to 2007 Vol82(4) pp 1798-17807 32 Zhao Z.M., K.F Shortridge, M Garci, Y Guan and X.F Wan (2008) Genotypic diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses Vol 89(9) pp 2182-2193 Tài liệu Internet: http://www.cucthuy.gov.vn http://www.vncdc.gov.vn http://www.wpro.who.int/emerging_diseases http://www.oie.int/en/animal-health-in-the-world/update-on-avianinfluenza/2016/ http://www.micro.magnet.fsu.edu/cells/viruses/influenzavirus.html 73 download by : skknchat@gmail.com ... TGTAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCAGGGGTYTAAT S18_H5R CAGGAAACAGCTATGACCCATACCAACCATCTAYCATTC S19_H5F751 TGTAAAACGACGGCCAGTAYGCMTAYAARATTGTCAAG S19_H5R1773 CAGGAAACAGCTATGACAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAACTACAAT... FAM-TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-BHQ1 Mồi ngược AGACCAGCTAYCATGATTGC Mồi ngược AAACCAGCCACTATGATTGC Mồi xuôi CCCCACCAATGGGAACTG Probe FAM-CCAATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC-BHQ1 Mồi ngược TCTAGGAATGCAAACCCTTTTACC S17H5F1 TGTAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCAGGGGTYTAAT... từ gia cầm xâm nhập lây nhiễm cho người cao Trước thực tế trên, tiến hành thực đề tài: ? ?Giám sát lưu hành xác định số đặc tính sinh học phân tử virus cúm gia cầm type A/ H5N6 số chợ buôn bán gia