Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 18 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
18
Dung lượng
1,01 MB
Nội dung
Page 1
ĐẠI HỌC HUẾ
ĐẠI HỌC KHOA HỌC HUẾ
KHOA SINH HỌC
BÀI TIỂU LUẬN
TÌM HIỂU KHẢNĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA
HAI GIỐNG BÔNG VẢI COKER312 VÀ VN36P
BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI KHUẨN
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
Giảng viên hướng dẫn : PGS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc
Sinh viên thực hiện : Giáp Thanh Thản
Lớp : Công Nghệ Sinh Học K33
Huế,1-2013
Page 2
I.MỞ ĐẦU……………………………………………………………… …4
II.TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………… 5
2.1. Sơ lược về câybông vải………………………………………………….5
2.1.1. Vị trí phân loại…………………………………………………………5
2.1.2. Tính đa dạng………………………………………………………… 5
2.2. Chuyểngen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens……………… 6
2.2.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens………………… ….6
2.2.2. Ti-plamid…………………………………………………………… 7
III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….………………………….14
3.1.Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy………………………………………………14
3.2. Quy trình chuyển nạp gen…………………………………………… 14
3.2.1. Nguồn plasmid……………………………………………………….14
3.2.2. Chuẩn bị vi khuẩn…………………………………………………….15
3.2.3. Lây nhiễm…………………………………………………………….15
3.2.4. Thanh lọc…………………………………………………………… 16
3.3. Các chỉ tiêu theo dõi……………………………………………………17
IV.KẾT LUẬN…………………………………………………………… 17
V.TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………… 18
Page 3
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
AMP: Adenosine 5’- monophosphate
ATP: Adenosine 5’- triphosphate
AS: Acetosyringone
Bp: base pair
ctv: cộng tác viên
cs: cộng sự
DNA: Deoxyribonucleotic acid
GUS: enzyme β-glucuronidase
kb: kilobase
lacZ: gen β-galactosidase
LB: Left border
Mb: megabase
MSCo: MS co-culture medium
Ori: origin of replication
PMI: Enzyme Phosphomannose isomerase
Pmi: gen pmi
plasmid Ti: tumour inducing plasmid
RB: Right border
T-DNA: transferred DNA
Vir: gen vir
Vir: virulence
2,4-D: 2,4-dichlorophenoxy acetic acid
v/v: volume/volume
w/v: weight/volume
Page 4
I.MỞ ĐẦU
Cho đến nay hơn 150 loài thực vật khác nhau, trong đó có rất nhiều
loài cây trồng, đã được chuyểngen thành công. Để tạo ra cây biến
đổi gen trong những năm qua một loạt các phương pháp khác nhau
đã được thực hiện. Trong đó, ba phương pháp sau đây được sử
dụng phổ biến:
Chuyểngen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Chuyểngen bằng phương pháp phi sinh học
Chuyểngen bằng tế bào trần
Từ lâu người ta đã quan tâm nhiều đến việc cải thiện đặc tính di
truyền của các loài câybông vải. Mặc dù có nhiều giống bông vải
tốt được tạo ra theo các phương pháp lai tạo và chọn lọc truyền
thống, nhưng dường như các giống bông đó khó có thể khai thác
được các nguồn gen có lợi một cách hiệu quả. Việc ứng dụng công
nghệ di truyền thực vật có thể thúc đẩy việc tạo ra các giống cây
bông có nhiều đặc tính ưu việt về đặc tính nông học như tính
kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ và tính chống chịu với các đều
kiện bất lợi của môi trường (rét, khô hạn, phèn, mặn…) và các tính
trạng số lượng cũng như chất lượng của bông và sợi.
Bài tiểu luận này nhằm tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai
giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng phương pháp vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens.
Page 5
II.TỔNG QUAN TÀI LIỆU:
2.1. Sơ lược về câybông vải:
2.1.1. Vị trí phân loại:
Cây bông vải thuộc Ngành hiển hoa bí tử (Angiospermatophyta), Lớp song
tử diệp (Dicotyledoneae), Họ Malvaceae, Chi Gossypium.
2.1.2. Tính đa dạng;
Chi Gossypium rất đa dạng, có 39 loài, trong đó có 5 loài được trồng phổ
biến trên thế giới,và có 3 loài được trồng ở Việt Nam: G. arboreum, G. hirsutum,
G.barbadense
2.1.2.1. Gossypium arboretum:
Loài G. arboretum (loài bông Cỏ) có dạng hình thoáng, thân mảnh, lá nhỏ,
lông ít, rễ cộc nhỏ với bộ rễ ăn nông, chịu được mưa, cuống quả dài rủ xuống, đầu
quả quay xuống đất, vỏ quả mỏng, chín sớm, hạn chế được hiện tượng thối quả khi
gặp mưa lúc bông nở. Về phẩm chất xơ bông Cỏ : thô, tỉ lệ xơ thấp, độ mịn kém
Cỏ hiện có ở Việt Nam thuộc 2 loài phụ: G. arboreum ssp neglectum và
G.arboreum ssp nanking.
2.1.2.2. Gossypium hirsutum:
Loài Gossypium hirsutum (loài bông Luồi) thường là cây hàng năm, cây
cao, lá to, mặt lá phẳng. Cành lá khỏe, số lượng lá nhiều, quả tròn, mặt quả nhẵn,
trọng lượng hạt bông trung bình trong một quả đạt 5 - 6g. Bông Luồi có nhiều
loài phụ như : G.hirsutum ssp. Mexicanum, G.hirsutum ssp. punctatum,
G.hirsutum ssp. panicultum…
2.1.2.3. Gossypium barbadense:
Loài Gossypium barbadense còn gọi là bông Hải Đảo, cây tương đối to,
chín muộn, lá to, khía sâu, màu xanh đậm. Thân cành lá gần như không có lông,
đài không có răng cưa rõ rệt và thường chỉ gợn hình làn sóng. Hạt thường nhẵn,
không có xơ ngắn, xơ dài màu trắng hoặc cà phê sữa. Bông Hải Đảo có nhiều loài
phụ như: G. barbadense ssp. darwinii, G. barbadense ssp. ruderale, G.
barbadense ssp. ventiforlum.
2.1.2.4. Gossypium herbaceum:
Loài này phân bố chủ yếu ở các sa mạc, khí hậu khô nóng như vùng Trung
Á, TâyBắc Trung Quốc, Châu Phi, chưa thấy trồng ở Việt Nam.
Page 6
2.1.2.5. Gossypium tricuspidatum:
Loài này khá giống loài G. hirsutum, cây và lá to, chín hơi muộn, xơ dài và
mịn. Loài này đòi hỏi đất tốt, nhiều nước, nhiệt độ cao, chống chịu sâu bệnh khá
và được trồng nhiều ở Nam Mỹ. Loài bông này không có ở Việt Nam
2.2. Chuyểngen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:
Chuyển nạp gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở
dạng DNAtái tổ hợp vào bộ gen của sinh vật đang nghiên cứu. Những thành tựu
của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng đối với
chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền mới như
kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ… Sự chuyển nạp gen thành công trên cây trồng
đã được ghi nhận bằng cách sử dụng plasmid Ti, thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens để đưa gen mong muốn vào trong bộ gencây trồng.
Phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển nạp gen còn
được gọi là phương pháp chuyển nạp gen gián tiếp.
2.2.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:
Giống Agrobacterium được chia làm một số loài dựa trên triệu chứng gây
bệnh và kí chủ. Một số loài thuộc chi Agrobacterium như: A. radiobacter ( loài
nay không gây bệnh cho cây), A. tumefaciens và A. rhizogens gây bệnh khối u và
bệnh cổ rễ…
Hình 2.1. Khối u do Agrobacterium tumefaciens gây ra trên thực vật. A:
một khối u lớn trên thân cây hoa Hồng; B: các khối u trên cành Nho (Deacon và
ctv, 2005).
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di
động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm
Rhizobium. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có 5- 11
lông roi, vi khuẩn này phát triển tối ưu ở nhiệt 29
0
C trong môi trường có bổ sung
mangan và succinate như là nguồn cacbon duy nhất. Agrobacterium tumefaciens là
Page 7
vi khuẩn gây bệnh khối u trên cây (chủ yếu là cây hai lá mầm) khi xâm nhiễm vào
cây. Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vòng có kích
thước là 2,6Mb. Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid lớn có kích thước 200 -
800 kb, chính plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này
xâm nhập. Plasmid này có tên gọi là Plasmid Ti, hầu hết các gen gây khối u đều
nằm trên plasmid này. Khi rễ cây xuất hiện vết thương thì tế bào vi khuẩn sẽ di
chuyển về phía vết thương và xâm nhập vàocây qua vết thương đó. Vi khuẩn độc
mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số đó là Plasmid Ti. Plasmid Ti mang
các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây. Những vi khuẩn
không mang Plasmid Ti thì được xem như là vi khuẩn không độc và không có khả
năng gây bệnh khối u cho cây. Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ màu trắng, ban đầu
được tìm thấy ở gốc cây. Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen
do các tế bào ngoại biên chết đi. Các khối u có thể mền và xốp và có thể bị vỡ vụn
khi chạm vào, nhưng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ. Các khối u có
đường kính đến 30 cmnhưng phổ biến là 5 – 10 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở
nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trường. Khi xâm
nhiễm vàocây một phần gen trên Plasmid Ti sẽ gắn vào bộ gen của cây làm cho
các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine. Vi khuẩn
sẽ sử dụng chất này như một nguồn cacbon
2.2.2. Ti-plamid
Plasmid Ti là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể của vi khuẩn và có
khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn. Việc xác định Plasmid
Ti như một nguyên lý tạo bướu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bước
khởi động của một giai đoạn mới trong nghiên cứu về Agrobacterium
tumefaciens. Điều này đã mở ra khả năng nghiên cứu cấu trúc và chức năng của
plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử.
Plasmid Ti có cấu trúc bao gồm: đoạn T- DNA mang các gen tổng hợp các
hormone thực vật và vùng gen vir, ngoài ra còn có một số gen mã hoá cho việc tái
sinh plasmid, cho việc tiêu hoá opine. Trong cấu trúc của Plasmid Ti , hai yếu tố
quan trọng cần cho sự chuyển genvàocây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25
bp ở hai cánh của đoạn T- DNA và gen vir.
Page 8
Hình 2.2.Ti-plasmid của
Agrobacterium dạng
nopalin. T-DNA: Transfer-
DNA, LB: Bờ trái. RB: Bờ
phải, ori: khởi đầu sao
chép của A.tumefaciens.
noc: Phân giải nopalin,
nos: Tổng hợp nopalin.
tmr: Tổng hợp cytokinin,
tms: Tổng hợp auxin, tra:
Vận chuyển tiếp hợp, vir:
Vùng virulence (vùng độc
tính) (Trần Thị Lê và cs,
2006) .
2.2.2.1 Chức năng của T-DNA:
T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 10-30 kb, trong đó có chứa gen mã
hoá cho việc tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong
Plasmid Ti, vị trí của T-DNA được giới hạn bởi bờ phải và bờ trái. Trình tự
nucleotide của bờ phải và bờ trái tương tự nhau và đều có kích thước 25bp. Tuy
nhiên, bờ trái của T-DNA có thể được bỏ qua trong chuyển nạp T-DNA, trong khi
đó bờ phải lại cần thiết và tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trước và tiến
dần về phía trái. Việc đảo ngược bờ phải sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u ( Zhu
và ctv, 2000).
T-DNA mã hóa một vài protein và các protein này biểu hiện trong tế bào
cây được chuyểngen làm kiểu hình cây thay đổi lớn. Các gen trên T-DNA có thể
biểu hiện trong tế bào cây bằng cách mô phỏng các gen của cơ thể đa bào. T-DNA
mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các gen được chuyển
mang nhiều đặc điểm của các gen trong cây, yếu tố tăng cường sao mã, các vị trí
gắn đuôi poly A của cơ thể đa bào. Một nhóm các gen của T-DNA điều khiển tổng
hợp các hormone sinh trưởng của cây, những hormon này làm các tế bào tăng sinh
và làm thay đổi hình dạng bên ngoài. Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều
khiển sự chuyển hoá tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit
(auxin). Sản phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP và
Page 9
các enzyme trong cây được cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin
zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử hydro của một
nhóm methyl của isopentenyl. Hai gentrên T-DNA khác được cho là có chức năng
trong tạo khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b). Sản phẩm của gen 5 điều khiển
sinh tổng hợp indole-3-lactate, đó là một chất đồng đẳng với auxin. Trong khi đó
gen tml làm tăng mức độ nhạy cảm của các tế bào cây với phytohormon bằng một
cơ chế chưa được giải thích. Gen tml có thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi
vắng mặt các gen gây khối u khác.
Một nhóm gen được chuyển thứ hai đều khiển sản xuất nguồn dinh dưỡng
cho vi khuẩn, đó là các opine. Đây là một dạng kết hợp giữa một aminoacid với
một keto acid hoặc một đường . Các tế bào chuyểngen tổng hợp và tiết ra một số
lượng lớn các opine. Các opine này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên
ngoài vùng T-DNA và thường trên plasmid độc) cần cho việc phân giải các opine
được tổng hợp từ khối u. Dựa trên các kiểu opine đựơc tạo ra từ các khối u mà
phân chia nhóm vi khuẩn Agrobacterium thành các chủng như là: octopine,
nopaline, succinamopine và leucinopine.
Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải
một nhóm opine chuyên biệt. Gen ocs mã hóa cho octopine synthase, enzyme này
gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine để tạo ra octopine,
lysopine, histopine hoặc octopinic acid và tất cả những opine này đều được phát
hiện trong các khối u. Sản phẩm của gen mas2’ được cho là làm kết nối glutamine
hoặc glutamic acid với glucose (mặc dù đều này chưa đựơc chứng minh bằng thực
nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung gian
mannopine và mannopinic acid. Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa
mannopine thành agropine. Mannopine và agropine cũng có thể lactate hóa thành
agropinic acid . Bởi vậy, các khối u được tạo ra bởi Plasmid Ti kiểu octopine có
thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhóm mannityl opine.
Page 10
Hình 2.3. Sơ đồ biểu diễn quá trình di chuyển T-DNA của Ti-plasmid. 1: T-
DNA với bờ phải và bờ trái được chèn vào Ti-plasmid. 2: Sợi đơn được cắt ra
nhờ protein được mã hóa bởi gen virD2. 3: Sợi đơn của T-DNA được giải phóng
và kết hợp với protein do virD2 và virE2 mã hóa, chỗ đứt ở sợi đơn thứ hai được
tổng hợp bổ sung. 4: Lấp đầy chỗ trống trong Ti-plasmid (đường gạch nối đậm).
Sợi T-DNA tự do được vận chuyểnvào tế bào thực vật ở dạng phức hệ DNA-
protein.( Trần Thị Lệ và cs, 2006).
2.2.2.2 Chức năng của các gen vir:
Vùng vir trên Plasmid Ti có khoảng 25 gen được nhận biết trong 7 đơn vị
phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF và vùng này có kích thước
. muốn vào trong bộ gen cây trồng.
Phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển nạp gen còn
được gọi là phương pháp chuyển nạp gen gián. trong tế bào
cây được chuyển gen làm kiểu hình cây thay đổi lớn. Các gen trên T-DNA có thể
biểu hiện trong tế bào cây bằng cách mô phỏng các gen của cơ thể