(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu đánh giá thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và tác dụng chăm sóc sức khỏe của sản phẩm cao khai sản xuất từ dây khai coptosapelta flavescens korth

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Phạm Trí Nhựt NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ TÁC DỤNG CHĂM SĨC SỨC KHỎE CỦA SẢN PHẨM “CAO KHAI” SẢN XUẤT TỪ DÂY KHAI (Coptosapelta flavescens Korth.) LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỮU CƠ TP Hồ Chí Minh, 2021 download by : skknchat@gmail.com BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Phạm Trí Nhựt NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ THÀNH PHẦN HĨA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ TÁC DỤNG CHĂM SÓC SỨC KHỎE CỦA SẢN PHẨM “CAO KHAI” SẢN XUẤT TỪ DÂY KHAI (Coptosapelta flavescens Korth.) Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 8440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỮU CƠ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: PGS.TS Bạch Long Giang Hướng dẫn 2: PGS.TS Lê Tiến Dũng TP Hồ Chí Minh, 2021 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi Phạm Trí Nhựt, học viên cao học lớp Hữu 2019A, chuyên ngành Hóa hữu cơ, Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn Thầy PGS TS Bạch Long Giang PGS TS Lê Tiến Dũng khuôn khổ Chương trình Khoa học Cơng nghệ đề tài cấp Sở Khoa học Công nghệ tỉnh Ninh Thuận (Mã số: 12/2020/HĐ-SKHCN ngày 12/10/2020) Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu TP Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng năm 2021 Học viên Phạm Trí Nhựt i download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Sau năm học tập cao học Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, đến tơi hồn thành chương trình học tập Với lịng biết ơn kính trọng tơi xin chân thành cám ơn: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam người thầy, người đáng kính tận tình đào tạo, dạy tơi suốt q trình học tập Thầy PGS TS Bạch Long Giang Thầy PGS TS Lê Tiến Dũng, hai người thầy trực tiếp giúp đỡ, hướng dẫn, đóng góp nhiều ý kiến quý báu, tận tâm dìu dắt tơi bước hồn thành luận văn Tập thể cán nhân viên thuộc Viện khoa học môi trường – Trường Đại học Nguyễn Tất Thành giúp đỡ tơi tận tình để hồn thành luận văn Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn đến Tập đồn Vingroup – Cơng ty CP hỗ trợ Chương trình học bổng đào tạo Thạc sĩ, Tiến sĩ nước Quỹ Đổi sáng tạo Vingroup (VINIF), Viện Nghiên cứu Dữ liệu lớn (VINBIGDATA) đồng hành để thực luận văn thạc sĩ TP Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng năm 2021 Học viên Phạm Trí Nhựt ii download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ALT Alamin amino transferase AST Aspartat amino transferase Chemical Oxygen Demand COD ĐVTN Nhu cầu oxi hóa học Động vật thực nghiệm EC50 Effective Concentration Nồng độ ức chế 50% GC-MS Gas ChromatographyMass Spectrometry Phương pháp sắc ký khí – khối phổ HCT Hematocrit Thể tích hồng cầu HEK-293 Human Embryonic Kidney 293 cells Tế bào thận bào thai người 293 HGB Hemoglobin Lượng huyết sắc tố thể tích máu IASP International Association for the Study of Pain Hiệp hội quốc tế nghiên cứu đau LD0 Maximum Tolerable Dose Liều tối đa không làm chết động vật thử nghiệm LD50 Lethal Dose 50% Liều gây chết 50% LYM Lymphocyte Bạch cầu Lymphô MCH Mean Corpuscle hemoglobin Hàm lượng hemogiobin trung bình hồng cầu MCHC Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration Nồng độ huyết sắc tố trung bình thể tích máu MCV Mean Corpuscle Volume Thể tích trung bình hồng cầu iii download by : skknchat@gmail.com MONO Monocyte Bạch cầu Mono NF-κB Nuclear factor-κB Yếu tố nhân kappa B NSAIDs Non-steroidal antiinflammatory drugs Nhóm thuốc kháng viêm không steroid NSAIDS Non Steroid Antiinflammation Drug Thuốc kháng viêm không steroid PLT Platelet Count Số lượng tiểu cầu thể tích máu RBC Red Blood Cell Số lượng hồng cầu thể tích máu SEM Standard Error of the Mean Sai số chuẩn trung bình SSRI Selective serotonin reuptake inhibitors Nhóm thuốc ức chế tái thu hồi serotonin chọn lọc TCA Tricyclic antidepressants Nhóm thuốc chống trầm cảm ba vòng TFC Total Flavonoid Content Hàm lượng flavonoid tổng TI Therapeutic Index Chỉ số điều trị TNF-a Tumor necrosis factor-a Yếu tố hoại tử u - alpha TPC Total Polyphenol Content Hàm lượng polyphenol tổng WBC White Blood Cell Số lượng bạch cầu thể tích máu iv download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Dây khai (Coptosapelta tomentosa (Blume) Valeton ex K Heyne) Hình 1.2 Các hợp chất phân lập từ rễ C flavescens Hình 1.3 Hình ảnh khảo sát điều tra dược liệu địa bàn tỉnh Ninh Thuận 11 Hình 2.1 Dây khai Cao Khai thu thập tỉnh Ninh Thuận 25 Hình 2.2 Quá trình sản xuất Cao Khai 26 Hình 2.3 Biểu chuột đau quặn thử nghiệm khảo sát tác động giảm đau ngoại biên 41 Hình 2.4 Biểu giật chuột thử nghiệm giảm đau trung ương 42 Hình 3.1 Hình ảnh vi học bột cao dây Khai 43 Hình 3.2 Cao Khai bột Cao Khai 44 Hình 3.3 Các phản ứng xác định thành phần hóa thực vật định tính: Anthraquinon (a), saponin (b), glycosid tim (c), triterpenoid (d), flavonoid (e), chất khử (f) 46 Hình 3.4 Hàm lượng polyphenol, flavonoid saponin triterpenoid có Cao Khai 48 Hình 3.5 Giá trị IC50 khả quét gốc tự DPPH ABTS Cao Khai so với Vitamin C 50 Hình 3.6 Hình ảnh quan chuột sau 14 ngày thử nghiệm độc tính cấp 54 Hình 3.7 Hình ảnh quan chuột sau 90 ngày thử nghiệm độc tính bán trường diễn 58 Hình 3.8 Độ sưng phù chân chuột lô thử nghiệm theo thời gian 63 Hình 3.9 Độ sưng phù chân chuột theo thời gian chứng bệnh diclofenac mg/kg 64 Hình 3.10 Độ sưng phù chân chuột theo thời gian lô chứng bệnh, Cao khai 400 800 mg/kg thể trọng 66 v download by : skknchat@gmail.com Hình 3.11 Độ sưng phù chân chuột theo thời gian lô Diclofenac, Cao khai 400 800 mg/kg 66 Hình 3.12 Số lần đau quặn chuột lô chứng bệnh lơ chứng dương 69 Hình 3.13 Thời gian đau quặn chuột lô chứng bệnh lô sử dụng thuốc 70 Hình 3.14 Số lần đau quặn chuột lơ Cao Khai 400 mg/kg 71 Hình 3.15 Thời gian đau quặn chuột lô Cao Khai 400 mg/kg 72 Hình 3.16 Số lần đau quặn chuột lô Cao Khai 800 mg/kg 73 Hình 3.17 Thời gian đau quặn chuột lơ Cao Khai 800 mg/kg 74 Hình 3.18 Tiềm thời giật đuôi lô chứng bệnh lơ chứng dương 76 Hình 3.19 Tiềm thời giật đuôi lô chuột thử nghiệm 78 vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các saponin phân lập từ rễ Dây khai Bảng 1.2 Độ tro toàn phần bột Cao KhaiLỗi! Thẻ đánh dấu không được xác định Bảng 1.3 Độ tro không tan acid bột Cao KhaiLỗi! Thẻ đánh dấu không được xác định Bảng 3.1 Độ ẩm bột Cao Khai 44 Bảng 3.2 Kết phân tích sơ hóa thực vật Cao Khai 45 Bảng 3.3 Hàm lượng saponin tổng Cao Khai 47 Bảng 3.4 Hàm lượng anthranoid toàn phần Cao Khai 47 Bảng 3.5 Kết phân tích hàm lượng vi sinh vật kim loại nặng Cao Khai 52 Bảng 3.6 Tỷ lệ chuột sống/chết lơ thử nghiệm độc tính cấp 54 Bảng 3.7 Ảnh hưởng Cao Khai đến trọng lượng chuột thử nghiệm đánh giá độc tính cấp 55 Bảng 3.8 Ảnh hưởng Cao Khai đến thơng số huyết học chuột bình thường thử nghiệm độc tính cấp 56 Bảng 3.9 Ảnh hưởng Cao Kha lên chức gan, thận chuột thử nghiệm độc tính cấp 57 Bảng 10 Tỷ lệ chuột sống/chết lơ thử nghiệm độc tính bán trường diễn 58 Bảng 3.11 Ảnh hưởng Cao Khai đến trọng lượng chuột thử nghiệm đánh giá độc tính bán trường diễn 59 Bảng 3.12 Ảnh hưởng Cao Khai đến thông số huyết học chuột bình thường thử nghiệm độc tính bán trường diễn 60 Bảng 3.13 Ảnh hưởng Cao Khai lên chức gan, thận chuột thử nghiệm độc tính bán trường diễn 61 vii download by : skknchat@gmail.com Bảng 3.14 Sự thay đổi độ phù chân chuột theo lô thử nghiệm (%) 63 Bảng 3.15 Khả giảm độ phù bàn chân chuột I (%) lô diclofenac mg/kg lô Cao khai 66 Bảng 3.16 Số lần đau quặn lô chuột thử nghiệm giảm đau ngoại biên (lần) 68 Bảng 3.17 Thời gian đau quặn lô chuột thử nghiệm giảm đau ngoại biên (giây) 69 Bảng 3.18 Tỷ lệ giảm số lần đau quặn lô Cao Khai 800 mg/kg so với lô chứng bệnh 74 Bảng 3.19 Tỷ lệ giảm thời gian đau quặn lô Cao Khai 800 mg/kg so với lô chứng bệnh 75 Bảng 3.20 Tiềm thời giật đuôi lô chuột thử nghiệm nhúng đuôi (giây) 76 viii download by : skknchat@gmail.com Ảnh hưởng Cao Khai đến chức gan, thận chuột thử nghiệm độc tính bán trường diễn ANOVA số ALT Summary Statistics for Benh Sinh ly Count Average Standard deviation Sau 108.75 22.9518 Truoc 132.625 23.1944 Total 16 120.688 25.4734 Sinh ly Sau Truoc Total Maximum 140.0 180.0 180.0 Range 70.0 80.0 110.0 Stnd skewness -0.421238 1.20792 0.362656 ANOVA Table for Benh by Sinh ly Source Sum of Squares Between groups 2280.06 Within groups 7453.38 Total (Corr.) 9733.44 Coeff of variation 21.1051% 17.4887% 21.1069% Minimum 70.0 100.0 70.0 Stnd kurtosis -0.275594 1.43123 1.00668 Df Mean Square 2280.06 14 532.384 15 F-Ratio P-Value 4.28 0.0575 Table of Means for Benh by Sinh ly with 95.0 percent LSD intervals Stnd error Sinh ly Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit Sau 108.75 8.1577 96.3781 121.122 Truoc 132.625 8.1577 120.253 144.997 Total 16 120.688 Multiple Range Tests for Benh by Sinh ly Method: 95.0 percent LSD Sinh ly Count Mean Homogeneous Groups Sau 108.75 X Truoc 132.625 X Contrast Sig Difference +/- Limits Sau - Truoc -23.875 24.7439 * denotes a statistically significant difference 140 download by : skknchat@gmail.com ANOVA số AST Summary Statistics for Benh Sinh ly Count Average Standard deviation Sau 103.75 15.9799 Truoc 281.125 88.3539 Total 16 192.438 110.236 Sinh ly Sau Truoc Total Maximum 120.0 480.0 480.0 Range 50.0 280.0 410.0 Stnd skewness -1.59173 2.255 1.96023 ANOVA Table for Benh by Sinh ly Source Sum of Squares Between groups 125848 Within groups 56432.4 Total (Corr.) 182280 Coeff of variation 15.4023% 31.4287% 57.2841% Minimum 70.0 200.0 70.0 Stnd kurtosis 1.54409 2.44903 1.2679 Df Mean Square 125848 14 4030.88 15 F-Ratio P-Value 31.22 0.0001 Table of Means for Benh by Sinh ly with 95.0 percent LSD intervals Stnd error Sinh ly Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit Sau 103.75 22.4468 69.7072 137.793 Truoc 281.125 22.4468 247.082 315.168 Total 16 192.438 Multiple Range Tests for Benh by Sinh ly Method: 95.0 percent LSD Sinh ly Count Mean Homogeneous Groups Sau 103.75 X Truoc 281.125 X Contrast Sig Difference +/- Limits Sau - Truoc * -177.375 68.0856 * denotes a statistically significant difference 141 download by : skknchat@gmail.com ANOVA số Ure Summary Statistics for Benh Sinh ly Count Average Standard deviation Sau 6.96 0.346369 Truoc 5.28125 1.62396 Total 16 6.12063 1.42766 Sinh ly Sau Truoc Total Maximum 7.34 8.0 8.0 Range 1.02 5.5 5.5 Stnd skewness -1.18515 -0.244156 -2.11005 ANOVA Table for Benh by Sinh ly Source Sum of Squares Between groups 11.2728 Within groups 19.3005 Total (Corr.) 30.5733 Coeff of variation 4.97656% 30.7495% 23.3254% Minimum 6.32 2.5 2.5 Stnd kurtosis 0.207139 0.612652 1.39513 Df Mean Square 11.2728 14 1.37861 15 F-Ratio P-Value 8.18 0.0126 Table of Means for Benh by Sinh ly with 95.0 percent LSD intervals Stnd error Sinh ly Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit Sau 6.96 0.415121 6.33043 7.58957 Truoc 5.28125 0.415121 4.65168 5.91082 Total 16 6.12063 Multiple Range Tests for Benh by Sinh ly Method: 95.0 percent LSD Sinh ly Count Mean Homogeneous Groups Truoc 5.28125 X Sau 6.96 X Contrast Sig Difference +/- Limits Sau - Truoc * 1.67875 1.25914 * denotes a statistically significant difference 142 download by : skknchat@gmail.com ANOVA số creatinine Summary Statistics for Benh Sinh ly Count Average Standard deviation Sau 66.75 7.26538 Truoc 94.625 5.06916 Total 16 80.6875 15.615 Sinh ly Sau Truoc Total Maximum 78.0 100.0 100.0 Range 25.0 12.0 47.0 Stnd skewness -0.650782 -0.0881713 -0.297882 ANOVA Table for Benh by Sinh ly Source Sum of Squares Between groups 3108.06 Within groups 549.375 Total (Corr.) 3657.44 Coeff of variation 10.8845% 5.35711% 19.3525% Minimum 53.0 88.0 53.0 Stnd kurtosis 0.938854 -1.14581 -1.1631 Df Mean Square 3108.06 14 39.2411 15 F-Ratio P-Value 79.20 0.0000 Table of Means for Benh by Sinh ly with 95.0 percent LSD intervals Stnd error Sinh ly Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit Sau 66.75 2.21475 63.3911 70.1089 Truoc 94.625 2.21475 91.2661 97.9839 Total 16 80.6875 Multiple Range Tests for Benh by Sinh ly Method: 95.0 percent LSD Sinh ly Count Mean Homogeneous Groups Sau 66.75 X Truoc 94.625 X Contrast Sig Difference +/- Limits Sau - Truoc * -27.875 6.71778 * denotes a statistically significant difference 143 download by : skknchat@gmail.com PHỤ LỤC TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM IN VITRO TRÊN ĐỘNG VẬT ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP Các mơ hình đánh giá độc tính cấp Mơ hình liều cố định Ngun tắc: Thử nghiệm thực với mức liều xác định 5, 50, 300, 2000, 5000 mg/kg hay 10 g/kg Lựa chọn liều thử liều thử động vật thử nghiệm Thử nghiệm tiếp tục đến xác định mức độ độc dựa đáp ứng ĐVTN chết không triệu chứng ngộ độc, khả hồi phục quan sát Xác định giá trị LD50 (nếu có) Phép thử phù hợp với tất trường hợp cần xác định độc tính cấp [30] Thử nghiệm thức Mức liều khởi đầu thử nghiệm thức xác định từ thử nghiệm sơ bộ, thường mức liều bắt đầu quan sát triệu chứng ngộ độc Không dùng liều gây chết giai đoạn thử sơ để khởi đầu thử nghiệm thức Số lượng ĐVTN: con/liều (mỗi nhóm), gồm dùng thử thử nghiệm sơ Thử nghiệm dừng lại có đủ thông tin mức liều theo quy định chung Trung bình cần khoảng 3-4 nhóm động vật, số nhóm mà mức liều thử mẫu thử biểu độc tính rõ ràng khơng độc Khoảng thời gian nghỉ đợt thử mức liều khác phải đủ để kết luận ĐVTN dùng nhóm liều trước sống sót, thường từ 3-4 ngày Khoảng thời gian điều chỉnh cho phù hợp với trường hợp thí nghiệm *Trường hợp mẫu có độc tính cao: có ĐVTN dùng liều g/kg bị chết, thử lại vật thứ với mức liều [30] Nếu thứ chết, dừng thử nghiệm, phân loại chất vào nhóm GHS Nếu thứ sống, thử thêm nhiều liều g/kg 144 download by : skknchat@gmail.com Nếu có thêm chết, dừng thí nghiệm (khơng kể số lượng ĐVTN dùng bao nhiêu), phân loại chất vào loại GHS, khơng có thêm chết, phân loại chất vào loại GHS Trường hợp mẫu có độc tính thấp khơng độc: tiến hành thử với mức liều tăng dần để xác định thông tin tăng với mức liều giới hạn Ghi chép báo cáo biểu quan sát Tùy kết thử nghiệm bảng phân loại GHS để xếp loại mức độ độc mẫu thử Thử giới hạn: Khi thông tin từ tài liệu, báo cáo có kết thử sơ cho phép dự đốn mẫu thử khơng độc, có nghĩa gây độc liều cao liều giới hạn thử thông thường, thực phép thử giới hạn Tiến hành thử vật mức liều giới hạn g/kg 10 g/kg (gồm thử sơ bộ) Dừng thí nghiệm khơng quan sát thấy biểu ngộ độc Bảng Bảng phân loại hóa chất theo mức độ độc dựa vào LD50 theo OECD Cấp độ Mức độ độc Cực kỳ độc Từ đền ≤ Rất độc > đến ≤ 50 Độc > 50 đên ≤ 300 Độc vừa > 300 đến ≤ 2000 Độc thấp > 2000 đến ≤ 5000 Gần không độc > 5000 Liều (mg/kg) độc LD50 145 download by : skknchat@gmail.com gần Mơ hình Tăng – Giảm Nguyên tắc: Thử nghiệm với liều tính theo hệ số bước nhảy liều, theo tiến trình tăng giảm liều đạt điều kiện dừng lại Quan sát biểu triệu chứng ngộ độc tính giá trị LD50 (nếu có) Phương pháp phù hợp cho chất gây chết nhanh 1-2 ngày, không phù hợp cho chất gây chết từ từ ngày Ngoài ra, áp dụng phương pháp trường hợp cần thử lồi động vật khơng gặm nhấm [30] Thử nghiệm thức Xác định liều thử: liều thử chọn với hệ số bước nhảy liều giá trị antilog 1/độ dốc ước tính (của đường cong liều-đáp ứng) Liều khởi đầu liều thấp gần với LD50 ước tính Tùy theo mức độ độc dự đoán, chọn mức liều khởi đầu cấp số liều với giá trị độ dốc nhỏ; ngược lại, với chất có độc cao, chọn giá trị độ dốc lớn Khi khơng có thơng tin liều gây chết mẫu thử, mức liều khởi đầu thường chọn 175 mg/kg bước nhảy liều chọn ứng với giá trị độ dốc (tức hệ số bước nhảy liều 3,2) Khoảng thời gian nghỉ mức liều phải đủ để kết luận ĐVTN dùng nhóm liều trước sống sót, thường 48 giờ, thay đổi tùy trường hợp Tiến hành thử nghiệm vật theo liều xác định khoảng thời gian đủ để quan sát xác định tình trạng sống/chết vật Dừng thử nghiệm thỏa mãn điều kiện sau: ĐVTN liên tiếp sống sót mức liều giới hạn (2 g/kg; g/kg 10 g/kg) Có cặp đảo ngược ĐVTN thử liên tiếp Có ĐTVN thử sau xuất cặp đảo ngược giá trị tỷ lệ li tính vượt qua giới hạn cho phép Quan sát ghi chép tất biểu ngộ độc quan sát Tính giá trị LD50 theo kết quan sát tình trạng vật thời điểm dừng 146 download by : skknchat@gmail.com Thử nghiệm giới hạn Khi có thơng tin cho thấy mẫu thử khơng độc, tức gây độc mức liều cao giới hạn thử thơng thường áp dụng thử nghiệm giới hạn Thử giới hạn mức liều g/kg g/kg 10 g/kg (với thuốc có nguồn gốc thực vật) Tiến hành theo bước sau: Cho thứ uống mẫu thử mức liều giới hạn chọn Nếu chết tiến hành thử nghiệm thức để xác định LD50 Nếu sống sót, cho dùng mẫu thử Nếu có chết dừng thử nghiệm giới hạn, tiến hành thử nghiệm thức theo nguyên tắc giảm liều Trong trường hợp này, LD50 nhỏ mức liều giới hạn Nếu có sống LD50 lớn mức liều giới hạn thử, dừng thử nghiệm theo dõi tiếp cho đủ thời gian quy định tiến hành thử nghiệm thức mức liều cao để tính giá trị LD50 thấy cần thiết giảm để xác định mức liều không gây triệu chứng ngộ độc Mơ hình thử theo Berhen Nguyên tắc: Những vật sống mức liều thử sống với tất mức liều thấp vật chết mức liều chết tất mức liều cao [30] Tiến hành: Thí nghiệm bố trí với nhóm động vật, nhóm dùng mức liều, khoảng cách liều thử nghiệm phải số động vật thí nghiệm nhóm Số nhóm thử bố trí cho thu số liệu đủ để tính kết quả, có nhóm khơng có ĐVTN bị chết nhóm có tối thiểu 80% số ĐVTN bị chết có nhóm thử với mức liều cho kết tương ứng mức liều Từ đó, tính LD50 Mơ hình theo Wilcoxon 147 download by : skknchat@gmail.com Nguyên tắc: Kết ghi đồ thị giấy log-probit tính theo phương pháp tốn đồ có hiệu chỉnh, cho kết xác Phương pháp thường áp dụng tính giá trị LD50 cho chất có độc tính cao [30] Tiến hành: Động vật: chuột nhắt trắng, giống, trọng lượng 20 ± 2g, chia thành lô, lô 10 Cho lô chuột uống thuốc thử với liều khác từ liều cao không gây chết tới liều thấp gây chết 100% chuột Chuột nhịn ăn 12 trước uống thuốc, uống nước đầy đủ Theo dõi số chuột chết 72 đầu tình trạng chung chuột ngày sau uống thuốc ăn uống, hoạt động thần kinh, lại, tiết, Nếu chuột chết, mổ chuột để đánh giá đại thể tổn thương quan, cần thiết làm xét nghiệm vi thể số phủ tạng ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM Các giai đoạn trình viêm Khi viêm cấp xảy ra, tiểu động mạch co lại thời gian ngắn dãn Các tế bào nội mô co thắt tạo khoảng hở gian bào làm tăng tính thấm thành mạch, thuận lợi cho thoát mạch tế bào protein huyết tương Các tế bào bao gồm: Bạch cầu (BC) trung tính, BC đơn nhân có vai trị thực bào BC toan kiềm chế phản ứng viêm Các tế bào khác bao gồm BC kiềm có vai trị tế bào mast, tiểu cầu có vai trị cầm máu Các tế bào tiểu cầu thực chức với hỗ trợ hệ thống protein huyết tương: hệ thống bổ thể, hệ thống đông máu hệ thống kinin Các hệ thống kích hoạt dưỡng bào phóng thích chất trung gian histamin, chất hóa ứng động bạch cầu chất tổng hợp kích thích q trình viêm (leukotrien, prostaglandin) Ngồi cịn 148 download by : skknchat@gmail.com có tham gia globulin miễn dịch Sự hoạt hóa loại tế bào với hỗ trợ hệ thống protein huyết tương gây biến đổi chủ yếu viêm cấp: rối loạn tuần hoàn, rối loạn chuyển hóa, tổn thương tổ chức tăng sinh tế bào Viêm mạn tình trạng viêm kéo dài tuần Viêm mạn theo sau viêm cấp đáp ứng viêm không thành công, tồn vi khuẩn hay dị vật vết thương làm cho trình viêm kéo dài Tuy nhiên, viêm mạn xảy từ đầu trường hợp nguyên nhân gây viêm vi khuẩn có vỏ lipid dày (vi khuẩn lao, phong, giang mai) gây khó khăn cho q trình thực bào, chứng tiếp tục tồn kích thích phản ứng viêm Đặc điểm viêm mạn thấm nhập đại thực bào lympho bào Khi đại thực bào khơng cịn khả bảo vệ chống lại tổn thương mơ, thể tạo vịng vây lập nơi bị nhiễm, thành lập u hạt U hạt bắt đầu đại thực bào biệt hóa thành tế bào dạng biểu mô (epitheloid cell), tế bào khả thực bào bắt giữ mảnh nhỏ Các đại thực bào khác hợp lại thành tế bào khổng lồ (giant cell) có khả thực bào mảnh to Bản thân u hạt bao bọc mô sợi collagen, u hạt hóa hyalin tích tụ chất vơi (calci carbonat, calci phosphat) [32, 35] Các thuốc điều trị kháng viêm Hiện nay, có nhóm thuốc kháng viêm chủ yếu thuốc kháng viêm steroid thuốc kháng viêm khơng steroid (NSAID) tác dụng lên q trình chuyển hóa acid arachidonic giai đoạn khác Acid arachidonic tổng hợp từ phospholipid màng tế bào enzym phospholipase A2 có kích thích gây viêm; sau chuyển hóa enzym cyclooxygenase (COX) lipooxygenase (LOX) tạo endoperoxyd thromboxan A2, prostaglandin E2 (PGE) leucotrien trung gian khởi phát phản ứng viêm Các NSAID ức chế COX cịn corticoid có tác dụng sau để kháng viêm: làm ổn định màng lysosom màng tế bào nói chung tác động lên phospholipase A2; làm giảm tính thấm mao mạch; làm giảm di chuyển 149 download by : skknchat@gmail.com bạch cầu, giảm thực bào; làm giảm hệ miễn dịch, giảm sinh sản tế bào lympho; làm giảm sốt giảm giải phóng interleukin-I từ bạch cầu [34] Hình Cơ chế tác động thuốc kháng viêm NSAIDS Glucocorticoid ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG GIẢM ĐAU Phân loại Đau thường phân loại theo: vị trí, thời gian, tần suất, nguyên nhân cường độ đau Phân loại đau phức tạp gây nhầm lẫn Tùy vào trường hợp cụ thể mà ta sử dụng cách phân loại khác [40] Phân loại theo thời gian tính chất đau Đau cấp tính đau kéo dài 30 ngày Loại đau xem dấu hiệu hữu ích giúp bảo vệ thể Nó cho biết phận thể bị thương bị bệnh nhằm hạn chế sử dụng giúp báo hiệu bệnh tật khỏi Đau cấp tính gồm: đau sau phẫu thuật, đau sau chấn thương, đau sau bỏng, đau sản khoa…Ngoài cịn có đau cấp tính tái phát tình trạng đau cấp tính ngắt quãng, lặp lặp lại khoảng thời gian dài Đau mạn tính đau kéo dài tháng Loại đau có ý nghĩa bảo vệ, tồn sau chấn thương bệnh tật gây cản trở sinh hoạt Nếu sử dụng mơ hình đau cấp tính điều trị đau mạn tính, khiến đau trở nên dội gia tăng khả tàn tật Đau mạn tính bao gồm: 150 download by : skknchat@gmail.com Đau mạn tính liên quan đến ung thư (đau ác tính): tế bào ung thư xâm lấn chèn ép mơ lành gây tổn thương mơ Đau mạn tính khơng liên quan đến ung thư (đau lành tính): loạn dưỡng giao cảm phản xạ, đau sau herpes, đau thần kinh đái tháo đường… Đau bán cấp đau tiếp diễn xảy từ cuối tháng thứ đến đầu tháng thứ bảy [41] Phân loại theo nguyên nhân gây đau Đau thực thể: kích hoạt chế cảm nhận đau bình thường, đau thường khu trú rõ Đau thực thể thường điều trị có hiệu liệu trình ngắn dùng thuốc giảm đau kháng viêm giảm đau gây ngủ thích hợp Đau nội tạng: thường khu trú đau thực thể, bao gồm loại đau tắc ruột, táo bón, đau màng tử cung… Đau thần kinh: có nguồn gốc đau tổn thương khu trú hệ thần kinh trung ương [40] Sinh lý cảm giác đau Có ba nơi phối hợp để tiếp nhận cảm giác đau tủy sống, đồi thị vỏ não Đường dẫn truyền cảm giác đau mơ tả sau: có kích thích đau từ ngoại biên, neuron (neuron hình T) truyền kích thích vào sừng sau tủy sống Từ đây, neuron thứ II có sợi trục bắt chéo sang bên lên theo bó Dejerine (bó tủy – đồi thị) Từ đồi thị, neuron thứ III dẫn truyền luồng thần kinh lên vùng đỉnh vỏ não trung khu cảm giác đau Sau xung đau lên đến não, có nhiều cấu trúc não tham gia vào để hình thành phản ứng đau như: cấu tạo lưới, đồi thị, vùng đồi hệ viền [41] Có thể xem đồi thị nơi phối hợp thần kinh quan trọng để nhận định cảm giác đau, vỏ não nơi nhận định vị trí đau ước lượng cường độ đau [42] Tiến trình gây đau điều chỉnh chất truyền thần kinh ức chế chất truyền thần kinh kích thích đáp ứng tâm lý sinh lý Từ 151 download by : skknchat@gmail.com chịu kích thích đến nhận biết cảm giác đau phải trải qua trình bản: tải nạp (transduction), dẫn truyền (transmission), điều chỉnh (modulation) nhận biết cảm giác đau (perception) [42] - Sự tải nạp: tiến trình mà kích thích có hại chuyển thành tín hiệu điện receptor đau - Sự dẫn truyền (đường truyền lên): trình phát tán tín hiệu dọc theo màng tế bào thần kinh, nhờ chất kích thích prostaglandin chất trung gian gây viêm khác làm thay đổi tính thấm màng tế bào thần kinh tạo dòng Na+ vào K+ gây khử cực màng Xung lực điện truyền từ receptor đau đến sừng lưng tủy sống đến đồi thị, cuối đến vỏ não phần khác não để xử lý - Sự điều chỉnh (đường truyền xuống): neuron từ đồi thị cuống não phóng thích chất truyền ức chế norepinephrin, serotonin, GABA, glycin, endorphin enkephalin để ức chế chất P chất truyền thần kinh kích thích khác sợi truyền lên - Nhận biết cảm giác đau: Sự nhận biết cảm giác đau chịu ảnh hưởng sản sinh xử lý tín hiệu đau bất thường mà cịn đáp ứng xúc cảm tâm lý kinh nghiệm đau có trước Vì vậy, điều trị đau ngồi việc dùng thuốc để thay đổi đáp ứng đau cần kết hợp với thay đổi đáp ứng tâm lý, thư giãn để đạt hiệu cao dùng thuốc Sự nhạy cảm hóa ngoại biên trung ương: điều kiện dẫn truyền bình thường có cân chất dẫn truyền kích thích chất truyền ức chế Tuy nhiên, cân thay đổi ngoại biên trung ương dẫn đến nhạy cảm đáp ứng độ Có loại kích thích đau học (chấn thương, va đập), vật lý (nhiệt, điện) hóa học [41] Ngưỡng đau Mỗi thể, quan có ngưỡng đau định Nếu có kích thích, ngưỡng đó, khơng cảm nhận đau Khi kích 152 download by : skknchat@gmail.com thích tăng lên đến ngưỡng thấy đau Kích thích lớn ngưỡng đau đau [41] Cơ chế tác dụng thuốc giảm đau Có nhiều chế như: làm tăng ngưỡng đau, làm thay đổi giá trị cảm giác đau làm giảm khả tiếp nhận kích thích đau [41] Làm tăng ngưỡng đau: thuốc tác dụng theo chế thuốc giảm đau ngưỡng đau tăng lên, kích thích trước gây đau trở thành kích thích ngưỡng, dẫn đến khơng cảm nhận đau Ví dụ: thuốc giải lo âu gồm dẫn chất benzodiazepin (diazepam, oxazepam,), dẫn chất diphenylmethan (hydroxyzin), dẫn chất carbamat (meprobamat), … Làm thay đổi giá trị cảm giác đau, tức làm cảm giác đau khó chịu Ví dụ việc sợ đau làm giảm ngưỡng đau, tức gây tăng đau nên việc làm giảm sợ cách dùng thuốc giải lo âu thuốc giảm đau opioid giúp làm tăng ngưỡng đau Làm giảm khả tiếp nhận kích thích đau: qua chế thần kinh thể dịch, có yếu tố vật lý, hóa học, sinh học tác động lên thụ thể đau làm cho bệnh nhân giảm khả tiếp nhận kích thích đau, kể chất nội sinh gây đau bradykinin, histamin, prostaglandin, serotonin Các nhóm thuốc giảm đau Thuốc giảm đau chia làm hai loại chính: giảm đau gây ngủ giảm đau khơng gây ngủ Ngồi cịn có thêm thuốc phối hợp giảm đau [42] Thuốc giảm đau gây ngủ Opioid để chung chất thiên nhiên tổng hợp có tác dụng giống morphin Opioid Có ba loại receptor opioid mu (µ), kappa (κ) delta (δ) Chúng tìm thấy nhiều vị trí não mô khác Khi opioid gắn vào receptor não, tủy sống ngoại biên gây tác động giảm đau mạnh [41,42], … Thuốc giảm đau gây ngủ định trường hợp đau nặng cấp mạn tính đau đau hậu phẫu, ung thư… 153 download by : skknchat@gmail.com Opioids chia thành phân nhóm: Chất chủ vận opioid mạnh: morphin, oxymorphon, hydromorphon, methadon, meperidin, fentanyl, sufetanyl alfetanil Các chất chủ vận opioid yếu như: codein, tramadol Chất chủ vận phần: buprenorphin, pentazocin Thuốc giảm đau không opioid Bao gồm paracetamol NSAIDs Cơ chế tác động: ức chế cyclooxygenase nên ức chế thành lập prostaglandin (PG), đặc biệt PGE2 Chúng định trường hợp giảm đau nhẹ trung bình, cấp mạn tính nhiều nguyên nhân khác chấn thương sau phẫu thuật, viêm khớp…[42] Thuốc phối hợp giảm đau Để tăng hiệu giảm đau hay trị triệu chứng kèm theo làm trầm trọng thêm đau, người ta dùng thuốc phối hợp: Thuốc chống trầm cảm: TCA, IMAO, SSRI Thuốc trị động kinh: phenytoin, carbamazepin, valproat, gabapentin Glucocorticoid: dexamethason, metylprednisolon, prednisolon Thuốc làm giãn vân: benzodiazepin, baclofen… Thuốc chống co thắt: Hyoscin-N-butyl bromid, alverin… Thuốc điều chỉnh xương: calcitonin, bisphosphat Thuốc mê dạng hít, liều thấp để giảm đau cấp tính: nitrous oxid, isofluran, enfluran, methoxyfluran 154 download by : skknchat@gmail.com ... tài ? ?Nghiên cứu đánh giá thành phần hóa học, hoạt tính sinh học tác dụng chăm sóc sức khỏe sản phẩm Cao Khai sản xuất từ dây khai (Coptosapelta Flavescens Korth. )” tiến hành nhằm tập trung nghiên. .. hỗ trợ sức khỏe, học viên tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu đánh giá thành phần hóa học, hoạt tính sinh học tác dụng chăm sóc sức khỏe sản phẩm ? ?Cao Khai? ?? sản xuất từ dây khai (Coptosapelta Flavescens. .. tài đánh giá thành phần hóa học, hoạt tính sinh học, tính an tồn vi sinh, độc tính cấp tác dụng chăm sóc sức khỏe sản phẩm Cao Khai sản xuất từ dây Khai (Coptosapelta flavescens Korth. ), bao gồm: