Nghiên cứu sinh học, sinh thái và nhân giống rong bắp sú (kappaphycus striatus) (f schmitz) doty ex p c silva, 1996 TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VŨ THỊ MƠ NGHIÊN CỨU SINH HỌC, SINH THÁI VÀ NHÂN GIỐNG RONG BẮP SÚ – Kappaphycus striatus (F Schmitz) Doty ex P.C Silva, 1996 Chuyên ngành: Mã số: THỦY SINH VẬT HỌC 42 01 08 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC KHÁNH HỊA, 2022 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: GS.TS DƯƠNG TẤN NHỰT Người hướng dẫn khoa học 2: GS.TS NGUYỄN NGỌC LÂM Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Rong Bắp sú (Kappaphycus striatus) thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta), phân bố chủ yếu vùng biển nhiệt đới, thủy vực biển hở ven bờ vũng vịnh, nơi có trao đổi nước, độ mặn cao ổn định, nước cường độ ánh sáng (CĐAS) cao… Rong Bắp sú không giàu chất xơ thô, sắt axit béo omega-3, chất chống oxy hóa mà chứa hợp chất sinh học phục vụ cho ngành dược phẩm sinh học Vì vậy, rong Bắp sú có giá trị kinh tế sử dụng làm nguyên liệu để chiết xuất K-carrageenan, thực phẩm… làm phân bón nơng nghiệp Năm 2005, Việt Nam di trồng thành cơng lồi rong Bắp sú có nguồn gốc từ Phillipines Những năm đầu di trồng, rong có tốc độ tăng trưởng (TĐTT) cao trồng quanh năm vực nước có độ mặn cao ổn định Vì vậy, nghề ni trồng rong Bắp sú góp phần xóa đói giảm nghèo thành cơng việc bảo đảm sinh kế cho nhiều cộng đồng cư dân ven biển Tuy nhiên, sau gần hai mươi năm di trồng, rong Bắp sú không giữ đặc tính sinh học chất lượng carrageenan ban đầu Tại Việt Nam, từ di trồng thành công đến nay, nhân giống phương pháp sinh sản sinh dưỡng phương pháp sử dụng ni trồng lồi rong Vì vậy, rong giống suy giảm sức sống, làm rong biển dễ bùng phát dịch bệnh dẫn đến suất chất lượng rong giảm cách đáng kể Do đó, rong bị thối hóa sau thời gian dài nhân giống phương pháp sinh sản sinh dưỡng Nuôi cấy in vitro phương pháp nhân giống phụ thuộc vào thời tiết, đáp ứng số lượng rong giống lớn đường tạo nguồn rong giống bệnh, kháng bệnh, suất cao, chống chịu với sâu bệnh phát triển tốt điều kiện nghèo dinh dưỡng Ngồi ra, rong có nguồn gốc ni cấy in vitro có TĐTT nhanh 1,5 – 1,8 lần so với giống truyền thống Đặc biệt, rong có khả phát triển tốt điều kiện nhiệt độ cao kháng mầm bệnh trắng nhũn thân, thêm vào hàm lượng chất lượng carrageenan cao giá trị dinh dưỡng tốt so với rong có nguồn gốc từ sinh sản sinh dưỡng Tuy nhiên nghiên cứu đặc điểm sinh học nhân giống rong đặc biệt nhân giống in vitro hạn chế Do đó, nhằm nghiên cứu biến đổi đặc điểm sinh học số dòng rong Bắp sú sau gần hai mươi năm di trồng, qua chọn dịng rong vượt trội thích nghi cao với điều kiện sinh thái vùng biển Việt Nam để tiến hành nhân giống dựa kết hợp phát huy ưu điểm công nghệ nuôi cấy in vitro, nghiên cứu sinh tiến hành thực luận án: “Nghiên cứu sinh học, sinh thái nhân giống rong Bắp sú – Kappaphycus striatus (F Schmitz) Doty ex P C Silva, 1996” Mục tiêu nghiên cứu luận án Tìm dịng rong có đặc điểm sinh học phù hợp để làm vật liệu nghiên cứu tạo nguồn giống chất lượng cao phương pháp nuôi cấy in vitro Nghiên cứu để tìm điều kiện ni cấy in vitro thích hợp cho q trình phát sinh hình thái khác (cảm ứng mô sẹo, phát sinh phôi tái sinh hoàn chỉnh…) rong Bắp sú Đánh giá chất lượng giống có nguồn gốc in vitro rong Bắp sú thơng qua khả thích nghi tự nhiên, hàm lượng chất lượng carrageenan 3 Các nội dung nghiên cứu luận án Đặc điểm sinh học sinh thái dịng rong thuộc lồi rong Bắp sú Nhân giống lồi rong Bắp sú phương pháp ni cấy in vitro Những đóng góp luận án Cung cấp liệu cụ thể đặc điểm sinh học, sinh thái dịng rong thuộc lồi rong Bắp sú sau gần hai mươi năm di trồng vịnh Vân Phong vịnh Cam Ranh, Khánh Hòa Sử dụng nano bạc chất khử trùng cho nuôi cấy in vitro rong biển Cung cấp liệu q trình phát sinh phơi vơ tính xây dựng quy trình nhân giống rong Bắp sú phương pháp ni cấy in vitro Luận án đóng góp cho công tác đào tạo giảng dạy lĩnh vực ni cấy in vitro thực vật nói chung rong biển nói riêng CHƯƠNG TỔNG QUAN Rong Bắp sú lồi rong có giá trị kinh tế, thuộc ngành Rhodophyta nuôi trồng rộng rãi nước như: Philippines Ấn Độ… Năm 2005, Việt Nam di trồng thành cơng dịng rong thuộc lồi rong là: Dòng rong xanh Sacol, dòng rong nâu Sacol dịng rong nâu Payaka Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng chất lượng rong rong yếu tố sinh thái (nhiệt độ, ánh sáng độ mặn…) nguồn gốc giống Những năm qua, số nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh thái rong Bắp sú thực Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đánh giá so sánh sinh trưởng hàm lượng chất lượng dòng rong sau gần hai mươi năm di trồng vào Việt Nam Mặt khác, giới, nhân giống in vitro thực đối tượng rong Sụn, rong Sụn gai với phương pháp tái sinh chồi trực tiếp phương pháp phát sinh phơi vơ tính cho kết khả quan Ni cấy in vitro rong biển phương pháp đơn giản hiệu việc lưu giữ nguồn gen quí phục vụ cho việc sản xuất đại trà theo phương pháp truyền thống Quá trình phục hồi nhân nhanh thành rong non có tác dụng “trẻ hóa” nguồn giống, tăng cường khả chống chịu với môi trường Bên cạnh đó, việc kết hợp với kỹ thuật di truyền chuyển gen, lai tạo tế bào nuôi cấy in vitro rong biển làm tăng nhanh chất lượng rong giống theo ý muốn Ở Việt Nam, số tác giả nghiên cứu nhân giống in vitro rong Sụn kết hạn chế chưa đưa quy trình nhân giống Vì vậy, đến thời điểm chưa ứng dụng vào sản xuất thực tiễn Trên đối tượng rong Bắp sú, tái sinh chồi trực tiếp thực Tuy nhiên, phương pháp có nhược điểm hệ số nhân giống thấp dẫn đến không đáp ứng nhu cầu nguồn giống Vì vậy, nghiên cứu nhân giống in vitro phương pháp phát sinh phơi vơ tính thơng qua mơ sẹo việc làm cần thiết Kết tạo hệ có đặc tính tốt, có khả chịu nhiệt độ cao, kháng bệnh, từ nâng cao suất nuôi trồng chất lượng rong Nhân giống phương pháp phát sinh phơi vơ tính thơng qua mô sẹo trải qua giai đoạn sau: Tạo nguồn vật liệu ban đầu, cảm ứng nhân nhanh mô sẹo, tái sinh phơi vơ tính, tái sinh hồn chỉnh từ phơi vơ tính ni thích nghi ngồi tự nhiên Nghiên cứu điều kiện ni cấy in vitro thích hợp cho q trình phát sinh hình thái khác (cảm ứng mô sẹo, phát sinh phôi, tái sinh hoàn chỉnh…) rong Bắp sú để tìm quy trình nhân giống in vitro điều cần thiết CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Những bụi rong – tuần tuổi, khỏe, không bị bệnh, màu nâu nhạt, khơng trầy xước dịng rong nâu Payaka dịng rong nâu Sacol thuộc lồi rong Bắp sú, khối lượng khoảng 400 g, kích thước 30 – 40 cm, thu thập vịnh Vân Phong vịnh Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa 2.2 Nội dung nghiên cứu Đặc điểm sinh học sinh thái dịng rong thuộc lồi rong Bắp sú Nhân giống lồi rong Bắp sú phương pháp nuôi cấy in vitro 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Hiện trạng dòng rong Bắp sú nuôi trồng vịnh Vân Phong vịnh Cam Ranh Thu thập phân loại dịng thuộc lồi rong Bắp sú Tiến hành đánh giá sinh trưởng, hàm lượng chất lượng carrageenan dịng thuộc lồi rong Bắp sú để tìm dịng rong có đặc điểm sinh học tốt dùng làm vật liệu nghiên cứu nhân giống in vitro 2.3.2 Nhân giống dịng rong nâu Sacol thuộc lồi rong Bắp sú Tạo nguồn vật liệu Những nhánh rong khỏe dòng rong phù hợp theo kết chọn Tiến hành thử nghiệm loại môi trường dinh dưỡng sinh trưởng rong giống điều kiện in vitro giai đoạn hóa Sau đó, rong khử trùng nano bạc kháng sinh phổ rộng để tìm điều kiện khử trùng tốt Cảm ứng nhân nhanh mô sẹo Những mẫu rong vô trùng sử dụng để cảm ứng mô sẹo Các yếu tố nuôi cấy khảo sát là: Mơi trường dinh dưỡng (MS, ½ MS, MS ½, PES, ½ PES, PES ½, MPI, ½ MPI, MPI ½); bổ sung đơn lẻ kết hợp NAA (0,1; 1,0 mg.L-1) BAP (0,1; 1,0 mg.L-1); hàm lượng agar (5 – 20 mg.L-1) đặt ánh sáng trắng đèn huỳnh quang CĐAS khác (0 – 55 µmol photons.m-2.s-1) Sau tuần nuôi cấy, mô sẹo nghiệm thức tốt sử dụng để nghiên cứu khả nhân nhanh mô sẹo rong Bắp sú Sự phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo Cụm mơ sẹo 16 tuần tuổi có kích thước khoảng x mm khối lượng khoảng 10 mg cấy vào môi trường PES độ rắn khác Sau đó, bổ sung NAA BAP để tìm điều kiện phát sinh phơi vơ tính tốt Khả tái sinh thích nghi điều kiện sống tự nhiên Phơi trưởng thành có kích thước 0,5 – 0,6 mm sử dụng để tái sinh Các yếu tố nuôi cấy khảo sát: Môi trường dinh dưỡng (MS, ½ MS, MS ½, PES, ½ PES, PES ½, MPI, ½ MPI, MPI ½); xáo trộn nước (sục khí, 50 vịng/phút 100 vịng/phút); CĐAS (0 – 70 µmol photons.m-2.s-1); độ mặn (20 – 40‰) nhiệt độ (20 – 35°C) để tìm điều kiện tái sinh tốt Cây tuần tuổi đưa ngồi ni trồng bán thích nghi Các yếu tố khảo sát nguồn ánh sáng loại in vitro Cây 16 tuần tuổi có nguồn gốc in vitro ni trồng điều kiện bán tự nhiên có kích thước khoảng 50 – 70 g nuôi trồng vịnh Vân Phong để đánh giá khả thích nghi ngồi tự nhiên Sau 10 tuần ni trồng ngồi tự nhiên, rong có nguồn gốc in vitro thu hoạch để đánh giá hàm lượng carrageenan theo phương pháp Istinii cộng (1994) chất lượng carrageenan theo phương pháp Stanley (1987) 2.3.4 Xử lý số liệu Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, nghiệm thức lặp lại lần, số liệu thể giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (TB ± SD) Số liệu xử lý phần mềm Microsoft Excel 2010, so sánh ANOVA yếu tố với phép thử Duncan (p mm) nghiệm thức tốt thu để tiến hành thí nghiệm nhân nhanh mơ sẹo Sự cảm ứng phát triển mơ sẹo dịng rong nâu Sacol quan sát suốt q trình thí nghiệm kính hiển vi soi Kết cho thấy, sau – ngày nuôi cấy, tế bào mô sẹo hình thành sợi màu trắng quan sát từ vài đỉnh nhánh (10%) Sau tuần cấy mẫu, cụm mơ sẹo có cấu trúc hình cầu, gồm chuỗi tế bào hình dài xếp lại tạo thành sợi Những cấu trúc phát triển nhanh chóng, sau tuần đạt kích thước 2,25 – 2,5 mm Những cụm mô sẹo dạng sợi nhô lên phủ lên tồn vết cắt, có màu trắng sáng sau tuần (Hình 3.9 I, K) 13 Hình 3.9 Q trình phát triển mơ sẹo dịng rong nâu Sacol Thước: 1mm A: Mô cấy ban đầu B: Mô sẹo cảm ứng phần tế bào trung tâm C: Mơ sẹo cảm ứng lớp biểu bì D: Mơ sẹo cảm ứng phần tế bào trung tâm lớp biểu bì E, F, G: Mơ cấy mang mơ sẹo sau tuần nuôi cấy H: Mô sẹo sau tuần nuôi cấy I, K, L, M: Mô sẹo sau tuần nuôi cấy N, O: Mẫu cấy cảm ứng mô sẹo dạng sợi mô sẹo cứng sau tuần nuôi cấy Ở giai đoạn nhân nhanh mô sẹo, mô sẹo tuần tuổi đặt vào mơi trường dinh dưỡng (MS, ½ MS, MS ½, PES, ½ PES, PES ½, MPI, ½ MPI, MPI ½) Sau tuần nuôi cấy, kết nhân nhanh mô sẹo môi trường PES tốt so với môi trường dinh dưỡng cịn lại Sau đó, bổ sung đơn lẻ kết hợp NAA (1; 2; mg.L-1) BAP (1; 2; mg.L-1) vào môi trường PES Sau tuần nuôi cấy, kết môi trường PES bổ sung mg.L-1 NAA + mg.L-1 BAP có khả 14 nhân nhanh mô sẹo tốt (215,27 mg) gấp lần so với đối chứng (111,33 mg) (Hình 3.10 Hình 3.11) Hình 3.10 Hình thái cụm mơ sẹo dịng rong nâu Sacol mơi trường dinh dưỡng khác sau tuần nhân nhanh Thước: 1mm A: B: C: D: E: Mẫu mô sẹo đặc hoại tử sau tuần cấy chuyển sang môi trường MS Mẫu mơ sẹo có tế bào mơ sẹo tiếp tục phân chia nuôi môi trường PES Mẫu mô sẹo tiếp tục phát triển nuôi mơi trường PES ½ Mẫu mơ sẹo rắn lại nuôi môi trường MPI Mẫu mô sẹo rắn lại, tế bào mô sẹo không phân chia nuôi cấy mơi trường MPI ½ Hình 3.11 Hình thái cụm mơ sẹo dịng rong nâu Sacol mơi trường PES bổ sung NAA BAP nồng độ khác sau tuần nhân nhanh Thước: mm A: Đối chứng B: mg.L-1 NAA C: mg.L-1 BAP D: mg.L-1 NAA + mg.L-1 BAP E: mg.L-1 NAA + mg.L-1 BAP F: mg.L-1 NAA + mg.L-1 BAP G: mg.L-1 NAA + mg.L-1 BAP 15 Sau đó, cụm mơ sẹo 16 tuần tuổi có kích thước lớn thu từ nghiệm thức tốt sử dụng để cảm ứng phơi vơ tính 3.2.3 Sự phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo Cụm mơ sẹo dịng rong nâu Sacol 16 tuần tuổi có kích thước khoảng x mm khối lượng khoảng 10 mg cấy vào môi trường PES độ rắn khác Sau tuần nuôi cấy, khả phát sinh phôi môi trường rắn (15 g L-1 agar) mơi trường lỏng cho kết hồn tồn khác Ở môi trường bán lỏng (4 g.L-1 agar), mô sẹo có khả phát sinh phơi vơ tính (15,67 phơi/mẫu) tốt so với nghiệm thức cịn lại (Hình 3.12) Hình 3.12 Hình thái giải phẫu mơ sẹo dịng rong nâu Sacol điều kiện nuôi khác A: Môi trường rắn; B, C: Môi trường bán lỏng; D: Mơi trường lỏng Tiếp đó, mơi trường PES bán lỏng (4 g.L agar) bổ sung đơn -1 lẻ kết hợp NAA (1; 2; mg.L-1) BAP (1; 2; mg.L-1) để đánh giá nghiên cứu khả phát sinh phôi Sau tuần nuôi cấy, kết thu nhận cho thấy, phát sinh phôi tốt kết hợp mg.L-1 NAA + mg.L-1 BAP với 113,33 phôi/mẫu, 189,67 mg tươi 18,10 mg khơ (Bảng 3.11) Như vậy, mơ sẹo dịng rong nâu Sacol cảm ứng phôi tốt môi trường PES bán lỏng (4 g.L-1 agar) có bổ sung mg.L-1 NAA + mg.L-1 BAP 16 Bảng 3.11 Ảnh hưởng NAA BAP đơn lẻ kết hợp phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo dịng rong nâu Sacol sau tuần ni cấy, n = 30 CĐHSTTV (mg.L-1) NAA BAP Số phôi /mẫu Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg) 0 20,00d ± 2,00 63,33e ± 4,93 5,83e ± 0,29 0,00f ± 0,00 69,33e ± 2,08 6,20e± 0,20 0,00f ± 0,00 69,67e ± 2,08 6,63de± 0,32 f f 0,00 ± 0,00 7,67 ± 1,15 0,67f ± 0,21 61,67c ± 4,73 84,67d ± 5,51 8,13c ± 0,71 0,00f ± 0,00 85,67d ± 5,13 7,63cd ± 0,15 0,00f ± 0,00 5,67f ± 0,58 0,53f ± 0,06 1 57,33c ± 2,52 126,00c ± 5,20 12,67b ± 2,08 113,33a ± 6,66 189,67a ± 3,06 18,10a ± 1,01 69,00b ± 3,61 125,67c ± 5,51 12,23b ± 0,40 2 73,67b ± 5,03 138,00b ± 4,36 13,33b ± 0,58 Mơ tả hình thái Cụm mơ sẹo tiếp tục phát triển, xuất số phôi Một số cụm mô sẹo bị hoại tử, tăng sinh chậm, khơng có phơi Một số cụm mô sẹo bị hoại tử, tăng sinh chậm, khơng có phơi Mơ sẹo hoại tử Cụm mơ sẹo màu nâu, tăng sinh nhanh, xuất phôi Cụm mơ có màu nâu trắng, tăng sinh nhanh, khơng có phơi Mơ sẹo hoại tử Phơi hình thành, phơi xếp lại với dày đặc, phơi có kích thước nhỏ 100 – 200 µm Cụm tế bào màu nâu nhạt, phơi có kích thước lớn 200 – 500 µm Xuất phơi Phơi hình thành, phơi xếp lại với dày đặc, phơi có kích thước nhỏ 100 – 200 µm Sự phát triển từ mơ sẹo thành thơng qua phơi vơ tính theo dõi ghi nhận suốt q trình thí nghiệm ảnh hưởng độ rắn môi trường Kết giải phẫu hình chụp kính hiển vi điện tử hình dạng phát triển phơi cho thấy phơi thu nhận từ nghiệm thức khơng có khác biệt hình thái Sau tuần ni cấy, giải phẫu thấy vi hạt – pigmented callus dày đặc (Hình 3.14 B) Ban đầu vách hai tế bào mơ sẹo, hình thành lên tế bào tiền sinh phôi Những tế bào ban đầu nhỏ, có màu nâu, vách ngăn thường hình thành hai tế bào đối xứng hai bên, sau lớn dần lên, đạt kích thước khoảng 50 – 100 µm Những tế bào có nhân, màu nâu (Hình 3.14 C), sau xuất vách ngăn phân chia tế bào chất, ngăn đôi tế bào cũ thành tế bào sau 17 tuần ni cấy (Hình 3.14 D) Hình 3.14 Sự phát sinh phơi vơ tính dịng rong nâu Sacol thơng qua mơ sẹo Hình A chụp vật kính x10, hình B – J chụp vật kính x20, Hình K, L chụp máy ảnh khơng qua kính hiển vi A: Cụm mơ sẹo chứa tế bào có khả sinh phơi B: Mơ sẹo có chứa sắc tố C: Sợi mơ sẹo mang tế bào mô sẹo chứa sắc tố D: Tế bào nhân đôi E: Sợi mô sẹo mang cụm tế bào nhân ba F, G: Cụm đa bào H: Phơi vơ tính hình lưỡi liềm hình thành cực chồi I: Phơi vơ tính hình cầu J: Phơi vơ tính hình đế dày K: Cụm phơi L: Các phơi rời Tiếp theo, tế bào tiếp tục lớn lên phân chia thành tế bào sau tuần nuôi cấy thành tế bào sau tuần ni cấy… (Hình 18 3.14 E, F) đa bào sau tuần ni cấy (Hình 3.14 G) Khi dạng đa bào gọi phơi phơi có hình lưỡi liềm (Hình 3.14 H), hình cầu (Hình 3.14 I) hay hình đế giày (Hình 3.14 J) kích thước tương đối lớn (150 – 500 µm) Quan sát kính hiển vi thấy cụm mơ phơi có màu nâu, phôi nhỏ xếp chồng lên chất rời (Hình 3.14 K) Khi ni điều kiện lỏng lắc tuần phơi rời có kích thước 0,5 – 0,6 mm tiếp tục phát triển, cực chồi phôi nảy mầm, xuất mầm (Hình 3.14 L) Những phơi rời có kích thước 0,5 – 0,6 mm thu từ thí nghiệm sử dụng để nghiên cứu tái sinh 3.2.4 Khả tái sinh thích nghi điều kiện sống tự nhiên Các yếu tố môi trường khảo sát giai đoạn tái sinh hoàn chỉnh từ phơi vơ tính trưởng thành Sau tuần ni cấy, kết phơi vơ tính dịng rong nâu Sacol có khả tái sinh tốt mơi trường PES có sục khí CĐAS 55 µmol photons.m-2.s-1, độ mặn 35‰ nhiệt độ 25 – 27°C (Bảng 3.12 – 3.16) Bảng 3.12 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng khả tái sinh từ phơi vơ tính dịng rong nâu Sacol sau tuần nuôi cấy, n = 30 Môi trường Tỉ lệ Số nhánh Chiều dài dinh dưỡng sống (%) /cây (mm) Đối chứng 16,7cd ± 5,1 PES 50,0a ± 5,8 ½ PES 46,7a ± 1,9 PES ½ 40,0ab ± 5,8 MPI 36,7abc ± 1,9 ½ MPI 30,0bcd ± 5,8 MPI ½ 26,7bcd ± 5,1 Mơ tả hình thái Tỉ lệ sống thấp, chậm phát triển, màu 1,33c ± 0,58 1,33e ± 0,58 sắc nhạt còi cọc Màu sắc rong tươi sáng, bóng phân 9,67a ± 1,15 22,00a ± 1,00 nhánh nhiều 5,67b ± 0,58 18,00bc ± 1,00 Màu sắc rong tươi sáng bóng đặc Màu sắc rong tươi sáng, có độ bóng đặc 5,33b ± 0,58 18,67b ± 1,53 trưng rong, đầu nhánh vót nhọn Màu sắc rong tươi sáng, có độ bóng đặc b c 5,00 ± 1,00 17,00 ± 1,00 trưng rong, đầu nhánh rong tù Màu sắc rong tươi sáng, màu sắc rong 2,33c ± 0,58 7,67d ± 0,58 nhợt nhạt, đầu nhánh rong tù Màu sắc rong tươi sáng, màu sắc rong c d 1,67 ± 0,58 6,67 ± 0,58 nhợt nhạt, đầu nhánh rong bị tù 19 Bảng 3.13 Ảnh hưởng tần số lắc (số vịng/phút) sục khí khả tái sinh từ phơi vơ tính dịng rong nâu Sacol sau tuần nuôi cấy, n = 30 Tỉ lệ sống (%) Nghiệm thức Lắc (100 vòng/phút) Lắc (50 vòng/phút) Sục khí Số nhánh/ Chiều dài (mm) Mơ tả hình thái Rong phát triển tốt có màu nâu bóng đặc trưng 40,00ab ± 10,00 3,00b ± 1,00 17,67b ± 1,53 30,00b ± 10,00 2,00b ± 1,00 15,00c ± 1,00 Rong phát triển chậm 53,33a ± 5,77 9,33a ± 0,58 21,67a ± 0,58 Rong phát triển tốt, màu nâu Bảng 3.14 Ảnh hưởng CĐAS khả tái sinh từ phơi vơ tính dịng rong nâu Sacol sau tuần ni cấy, n = 30 CĐAS Tỉ lệ (µmol.m-2.s-1) sống (%) Hoại tử 36,67c ± 5,77 15 40,00bc ± 10,00 35 53,33a ± 5,77 55 56,67a ± 5,77 75 50,00ab ± 10,00 Số nhánh /cây Hoại tử 3,33d ± 0,58 4,00d ± 1,00 5,67c ± 0,58 10,00a ± 1,00 8,00b ± 1,00 Chiều dài (mm) Hoại tử 15,00c ±1,00 17,33b ±0,58 20,67a ± 1,53 21,00a ± 1,00 15,33c ± 0,58 Mơ tả hình thái Rong hoại tử 100% sau tuần nuôi Rong phát triển chậm Rong phát triển tốt Rong phát triển tốt Rong màu nâu phát triển tốt Rong phát triển chậm Bảng 3.15 Ảnh hưởng độ mặn khả tái sinh từ phơi vơ tính dịng rong nâu Sacol sau tuần nuôi cấy, n = 30 Độ mặn (‰) Tỉ lệ sống (%) Số nhánh /cây 20 6,7c ± 5,8 2,67c ± 0,58 b c 25 30,0 ± 10,0 3,00 ± 1,00 30 40,0b ± 10,0 7,00b ± 1,00 35 56,7a ± 5,8 40 c 13,3 ± 5,8 9,33a ± 0,58 3,00c ± 1,00 Chiều dài (mm) Mơ tả hình thái Rong bị nhũn, màu sau – ngày nuôi hoại tử 90% sau tuần nuôi 6,00 ± 1,00 Màu sắc nhạt, rong phát triển chậm Rong phát triển tốt, chiều dài nhánh 17,33b ± 0,58 lớn có màu nâu bóng Rong phát triển tốt, chiều dài 22,33a ± 0,58 nhánh lớn có màu nâu bóng 5,00cd ± 1,00 Rong phát triển chậm 3,67d ± 0,58 c Bảng 3.16 Ảnh hưởng nhiệt độ khả tái sinh từ phơi vơ tính dịng rong nâu Sacol sau tuần nuôi cấy, n = 30 Nhiệt độ (°C) 20 Tỉ lệ sống (%) Số nhánh /cây 50,0a ± 10,0 3,33b ± 0,58 a a Chiều dài (mm) 17,67b ± 0,58 a 25 60,0 ± 10,0 9,33 ± 1,53 21,00 ± 1,00 27 63,3a ± 5,8 9,67a ± 1,53 21,67a ± 1,53 30 26,7b ± 11,5 2,67b ± 0,58 5,00c ± 1,00 35 13,3b ± 5,8 4,00c ± 1,00 2,00b ± 1,00 Mơ tả hình thái Rong chậm phát triển Rong phát triển tốt, màu nâu bóng đặc trưng rong Rong phát triển tốt, màu nâu bóng đặc trưng rong Rong phát triển chậm, thân rong bị nhũn đầu nhánh Rong chậm phát triển, rong bị nhũn thân, màu hoại tử nhiều 20 Sau tái sinh hoàn chỉnh, chuyển ngồi để ni bán thích nghi Cây tuần tuổi có nguồn gốc in vitro ni bể kính tích 100 L, sục khí liên tục, có hệ thống điều nhiệt để đạt nhiệt độ 27°C đặt nguồn ánh sáng khác Kết sau tuần nuôi, rong sinh trưởng tốt nguồn ánh sáng tự nhiên giảm ½ CĐAS tơn lưới xanh đen (nguồn ánh sáng 4) với tỉ lệ sống (86,67%), khối lượng tươi (64,7 g) TĐTT (7,73%/ngày) cao (Hình 3.20 D) Hình 3.20 Hình thái dịng rong nâu Sacol có nguồn gốc in vitro nguồn ánh sáng khác giai đoạn thích nghi sau tuần ni trồng Thước: cm A: Nguồn ánh sáng B: Nguồn ánh sáng C: Nguồn ánh sáng D: Nguồn ánh sáng E: Nguồn ánh sáng 21 Bên cạnh kết đánh giá nguồn ánh sáng thích hợp, loại (khác số nhánh, kích thước khối lượng) kiểm tra Kết sau tuần nuôi trồng điều kiện bán tự nhiên, tỉ lệ sống, khối lượng TĐTT dòng rong nâu Sacol loại (6,67 nhánh/cây; 3,01 cm; 1,23 g) có nguồn gốc in vitro (86,67%; 73,27 g; 7,86%/ngày; tương ứng) cao so với nghiệm thức cịn lại (Hình 3.21 F) Hình 3.21 Hình thái dịng rong nâu Sacol có nguồn gốc in vitro loại khác giai đoạn thích sau tuần ni trồng Thước: cm A: Cây loại 1; B: Cây loại 2; C: Cây loại 3; D: Cây loại 4; E: Cây loại 5; F: Cây loại Sau nuôi trồng điều kiện bán tự nhiên, rong đạt khối lượng 50 – 70 g chuyển tự nhiên để đánh giá chất lượng giống in vitro Kết sau 12 tuần nuôi trồng vịnh Vân Phong cho thấy, rong có nguồn gốc in vitro có khối lượng tươi khô (420,57 g, 51,53 g; tương ứng) cao gấp 5,25 lần so với khối lượng tươi khô rong có nguồn gốc từ tự nhiên (80,17 g; 8,50 g; tương ứng) TĐTT tích lũy rong có nguồn gốc in vitro đạt 2,57%/ngày cao gấp 4,42 lần TĐTT 22 rong có nguồn gốc từ tự nhiên (0,57%/ngày) (Biều đồ 3.14) Bên cạnh đó, tỉ lệ khơ tươi cao rong có nguồn gốc in vitro (12,50%) cao so với rong có nguồn gốc tự nhiên (10,81%) sau 10 tuần nuôi trồng (Biểu đồ 3.15) Như vậy, rong thu hoạch sau 2 -2 10 12 Tỉ lệ khô tươi (%) Tốc độ tăng trưởng (%/ngày) 10 tuần nuôi trồng để đánh giá hàm lượng chất lượng carrageenan Thời gian nuôi (tuần) Giống in in vitro vitro Giống Giống tự nhiên Biểu đồ 3.14 Tốc độ tăng trưởng rong in vitro rong tự nhiên ni trồng ngồi tự nhiên sau 12 tuần 15 10 10 12 Thời gian nuôi (tuần) Giống Giốngin invitro vitro Giống tự nhiên Biểu đồ 3.15 Tỉ lệ khô tươi rong in vitro rong tự nhiên ni trồng ngồi tự nhiên sau 10 tuần Kết phân tích hàm lượng carrageenan cho thấy, rong có nguồn gốc in vitro có hàm lượng carrageenan (28,83%/w) cao so với hàm lượng carrageenan rong có nguồn gốc tự nhiên (24,33) sau 10 tuần nuôi (Biểu đồ 3.16) Sức đông độ nhớt carrageenan chiết xuất từ rong có nguồn gốc in vitro (928,67 g.cm-2; 34,17 cps; tương ứng) cao so với sức đông độ nhớt carrageenan có nguồn gốc tự nhiên (909,00 g.cm-2; 28,50 cps; tương ứng) (Biểu đồ 3.17) 23 950 Sức đông (g.cm-2) Hàm lượng carrageenan (%/w) 40 30 20 10 920 890 860 830 800 Giống in Giống in vitro vitroGiống tựtựnhiên Giống nhiên Giống in vitro Giống in vitro Giống tự nhiên Giống tự nhiên Biểu đồ 3.16 Hàm lượng carrageenan Biểu đồ3.17 Sức đông carrageenan rong in vitro rong tự chiết xuất từ rong có nhiên ni trồng ngồi nguồn gốc in vitro rong tự nhiên sau 10 nhiên sau 10 tuần Từ kết nghiên cứu, sơ đồ quy trình nhân giống in vitro dịng rong nâu Sacol thuộc lồi rong Bắp sú thơng qua mơ sẹo tiến hành sau: Hình 3.22 Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống in vitro dịng rong nâu Sacol (1) Thuần hóa rong (2) Khử trùng mẫu (3) Cảm ứng mô sẹo (4) Nhân nhanh mô sẹo (5) Cảm ứng phơi vơ tính (6) Tạo phơi rời trưởng thành (7) Tái sinh cm (8) Nuôi thích nghi bán tự nhiên (9) Ni thích nghi ngồi tự nhiên 24 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Hiện nay, có hai dịng rong nâu Payaka nâu Sacol nuôi trồng vịnh Vân Phong vịnh Cam Ranh Sau gần hai mươi năm di trồng, dịng rong bị thối hóa thể TĐTT, hàm lượng chất lượng carrageenan giảm so với trước Dòng rong nâu Sacol ni trồng vịnh Vân Phong có hàm lượng carrageenan cao lựa chọn để nghiên cứu nhân giống in vitro Nghiên cứu thành cơng quy trình nhân giống in vitro dòng rong nâu Sacol thuộc rong Bắp sú phương pháp nuôi cấy in vitro phát sinh phơi vơ tính, mở hướng nghiên cứu tương lai Kết nghiên cứu tìm chất khử trùng nano bạc, chất khử trùng mới, lần ứng dụng đối tượng rong biển, có khả diệt khuẩn tốt thân thiện với môi trường Đã đánh giá khả thích nghi có nguồn gốc in vitro ngồi mơi trường tự nhiên đánh giá hàm lượng chất lượng carrageenan Cây có nguồn gốc in vitro có khả sinh trưởng tốt, sinh khối thu gấp 5,25 lần hàm lượng carrageenan cao so với rong có nguồn gốc ngồi tự nhiên 4.2 Kiến nghị Tiếp tục đánh giá sinh trưởng tính ổn định di truyền rong có nguồn gốc in vitro sau – hệ Nghiên cứu sản xuất giống quy mô lớn nhằm cung cấp giống cho sản xuất thương mại, góp phần nâng cao chất lượng giống DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Vũ Thị Mơ, Trần Văn Huynh, Lê Trọng Nghĩa, Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Ngọc Lâm, Dương Tấn Nhựt, Cảm ứng hình thành mơ sẹo từ nhánh rong Bắp sú (Kappaphycus striatus) điều kiện nuôi cấy khác nhau, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2018, 16 (2), 301– 309 Vu Thi Mo, Le Kim Cuong, Hoang Thanh Tung, Tran Van Huynh, Le Trong Nghia, Chau Minh Khanh, Nguyen Ngoc Lam, Duong Tan Nhut, Somatic embryogenesis and plantlets regeneration from seaweed Kappaphycus striatus, Acta Physiologiae Plantarum, 2020, 42, 104 Vũ Thị Mơ, Võ Thành Trung, Lê Trọng Nghĩa, Hoàng Thanh Tùng, Vũ Quốc Luận, Đỗ Mạnh Cường, Hoàng Đắc Khải, Nguyễn Thị Như Mai, Phan Minh Thụ, Nguyễn Ngọc Lâm, Dương Tấn Nhựt, Đặc điểm sinh trưởng, hàm lượng chất lượng carrageenan hai dòng rong Bắp sú (Kappaphycus striatus (F Schmitz) Doty ex P C Silva, 1996) sinh trưởng vùng biển Khánh Hòa, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 2021, Chấp nhận đăng ... h? ?c, sinh thái nhân giống rong B? ?p sú – Kappaphycus striatus (F Schmitz) Doty ex P C Silva, 1996? ?? M? ?c tiêu nghiên c? ??u luận án Tìm dịng rong c? ? đ? ?c điểm sinh h? ?c phù h? ?p để làm vật liệu nghiên c? ??u. .. h? ?c sinh thái dòng rong thu? ?c loài rong B? ?p sú Nhân giống loài rong B? ?p sú phương ph? ?p nuôi c? ??y in vitro Những đóng g? ?p luận án Cung c? ? ?p liệu c? ?? thể đ? ?c điểm sinh h? ?c, sinh thái dịng rong thu? ?c. .. Phong vịnh Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa 2.2 Nội dung nghiên c? ??u Đ? ?c điểm sinh h? ?c sinh thái dòng rong thu? ?c loài rong B? ?p sú Nhân giống loài rong B? ?p sú phương ph? ?p nuôi c? ??y in vitro 2.3 Phương pháp