Vai trò của adenylyl cyclase hòa tan trong sản xuất cAMP dưới tác động kích thích của eCG trong tế bào leydig mLTC 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN NGUYỄN THỊ CHÍ HIẾU VAI TRỊ CỦA ADENYLYL CYCLASE HỊA TAN TRONG SẢN XUẤT cAMP DƯỚI TÁC ĐỘNG KÍCH THÍCH CỦA eCG TRONG TẾ BÀO LEYDIG mLTC-1 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Bình Định – Năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN NGUYỄN THỊ CHÍ HIẾU VAI TRỊ CỦA ADENYLYL CYCLASE HÒA TAN TRONG SẢN XUẤT cAMP DƯỚI TÁC ĐỘNG KÍCH THÍCH CỦA eCG TRONG TẾ BÀO LEYDIG mLTC-1 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Mộng Điệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Nguyễn Thị Chí Hiếu LỜI CẢM ƠN Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc kính trọng tới Ban giám hiệu Trường Đại học Quy Nhơn, Quý Thầy Cô trường tạo điều kiện truyền thụ kiến thức quý báu để tơi hồn thành khóa học Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Thị Mộng Điệp, người thầy đầy tâm huyết ln tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Cơ ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu khoa học, nguồn động lực lớn giúp vượt qua khó khăn q trình hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ đổi sáng tạo Vingroup (VINIF) tài trợ kinh phí để thực đề tài nghiên cứu Xin cảm ơn anh, chị công tác Học viện Quân Y Hà Nội hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi q trình thực Luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, người thân tập thể lớp Sinh học thực nghiệm K22 động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực đề tài Do thời gian hiểu biết thân có hạn nên luận văn khó tránh khỏi sai sót Tơi mong nhận lời góp ý, bảo thầy để hồn thiện luận văn Quy Nhơn, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Chí Hiếu MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu đề tài 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Cấu trúc luận văn Những đóng góp đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Adenylyl cyclase 1.1.1 Cấu trúc Adenylate cyclase 1.1.2 Hoạt động Adenylate cyclase 1.2 Cyclic adenosine monophosphat (cAMP) chế hình thành 13 1.2.1 cAMP - chất truyền tin thứ hai tế bào 13 1.2.2 Sự hình thành cAMP 13 1.2.3 Sự phân giải cAMP 15 1.2.4 Con đường truyền tín hiệu cAMP 15 1.2.5 Vai trò cAMP 17 1.3 Tế bào Leydig mLTC-1 18 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị hóa chất đối tượng nghiên cứu 23 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.2 Vật liệu sử dụng nghiên cứu 23 2.1.3 Thiết bị 23 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 24 2.3 Nội dung nghiên cứu 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu 24 2.4.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào mLTC-1 24 2.4.2 Đánh giá khả sống tế bào 25 2.4.3 Phương pháp xác định nồng độ cAMP 25 2.4.4 Phương pháp xác định nồng độ Progesterone 26 2.4.5 Phương pháp Western-Blotting 27 2.4.6 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang 27 2.4.7 Xác định mức lượng ATP tế bào 28 2.4.8 Phương pháp xử lý số liệu 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Xác định vị trí AC hịa tan tế bào mLTC-1 30 3.2 Đánh giá nồng độ cAMP nội bào kích thích eCG chuỗi đơn tái tổ hợp tế bào mLTC-1 31 3.3 Đánh giá ảnh hưởng KH7, 2-CE 4-CE đến khả sống mLTC-1 nồng độ ATP tế bào 35 3.4 Xác định liên kết AC màng AC hòa tan phản ứng tổng hợp cAMP kích thích eCG 41 3.5 Đánh giá hình thành steroid eCG tế bào mLTC-1 tế bào Leydig tinh hoàn ức chế hoạt động AC hòa tan 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 Kết luận 49 Kiến nghị 50 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (BẢN SAO) DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Từ đầy đủ AC Adenylyl Cyclase cAMP Cyclic adenosine monophosphate CaMK Calmodulin dependent protein kinase eCG GPCRs G-protein coupled receptors Gαs Stimulating G-protein α Gαi Inhibitory G-protein α hCG Human chorionic gonadotropin PKA Protein kinase A 10 AC hòa tan Sobuble Adenylyl cyclase 11 AC xuyên màng Transmembrane Adenylyl cyclase Equine chorionic gonadotropin DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Số hiệu Tên bảng Trang Tỷ lệ phần trăm (%) tế bào mLTC-1 sống theo nồng độ 3.1 KH7, 2-CE, 4-CE sau ủ với tế bào mLTC-1 38 DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc adenylate cyclase màng 1.2 Cấu trúc domain adenylate cyclase 1.3 Cấu trúc tinh thể enzyme Adenylate cyclase hòa tan người 1.4 Phản ứng chuyển đổi ATP thành cAMP 1.5 Các đặc tính quy định chung họ adenylyl cyclase 12 1.6 Mơ hình cấu trúc phân tử cAMP 13 1.7 Sơ đồ minh họa trình hình thành cAMP 14 1.8 Lộ trình tín hiệu cAMP 17 1.9 Tế bào Leydig mLTC-1 20 2.1 Cơ chế hoạt động Glosensor Luciferin phản ứng tạo cAMP 26 Cơ chế phản ứng phát quang Luciferin 2.2 CellTiter-Glo 2.0 xúc tác enzyme luciferase 29 ion Mg2+ 3.1 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang adenylyl cyclase hòa tan tế bào mLTC-1 31 Ảnh hưởng KH7, 2-CE, 4-CE đến nồng độ 3.2 cAMP nội bào tác động kích thích eCG 33 tế bào mLTC-1 3.3 3.4 Đồ thị chuẩn ATP Ảnh hưởng chất ức chế KH7, 2-CE, 4-CE đến nồng độ ATP tế bào mLTC-1 36 37 Số hiệu 3.5 3.6 Tên hình Đánh giá ảnh hưởng KH7, 2-CE, 4-CE đến khả sống tế bào mLTC-1 Tế bào mLTC-1 sau ủ với KH7 kiểm tra khả sống CellTiter-Blue Trang 39 41 Ảnh hưởng ddAdo5’ đến nồng độ cAMP nội bào 3.7 tác động kích thích eCG tế bào 42 mLTC-1 3.8 Ảnh hưởng ddAdo5’ đến khả tồn tế bào nồng độ ATP tế bào mLTC-1 43 Ảnh hưởng KH7 ddAdo5′ lên phản ứng 3.9 cAMP nội bào tác động kích thích eCG 44 tế bào mLTC-1 Ảnh hưởng KH7, 2-CE, 4-CE, ddAdo2’5’ đến 3.10 sản xuất progesterone kích thích eCG mLTC-1 47 40 Khả sống tế bào mLTC-1 đo sau ủ với nồng độ khác (0, 6,25, 12,5, 50, 100µM) KH7 (a), 2-CE (b), 4-CE (c) vịng Các thí nghiệm lặp lại lần; giá trị trung bình ± SE *: có ý nghĩa thống kê mẫu đối chứng (0µM) mẫu thí nghiệm (p