SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG TRONG PHÒNG THỬ NGHIỆM VI SINH VẬT - PHẦN 1: ĐÁNH GIÁ NĂNG LỰC THỰC HIỆN ĐẾM KHUẨN LẠC

Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9330-1 : 2012 ISO 14461-1 : 2005 SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - KIỂM SỐT CHẤT LƯỢNG TRONG PHỊNG THỬ NGHIỆM VI SINH VẬT - PHẦN 1: ĐÁNH GIÁ NĂNG LỰC THỰC HIỆN ĐẾM KHUẨN LẠC Milk and milk products - Quality control in microbiological laboratories - Part 1: Analyst performance assessment for colony counts Lời nói đầu TCVN 9330-1:2012 hoàn toàn tương đương với ISO 14461-1:2005; TCVN 9330-1:2012 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố; Bộ tiêu chuẩn TCVN 9330:2012 Sữa sản phẩm sữa - Kiểm soát chất lượng phòng thử nghiệm vi sinh vật gồm có phần sau đây: - TCVN 9330-1:2012 Sữa sản phẩm sữa - Kiểm sốt chất lượng phịng thử nghiệm vi sinh vật - Phần 1: Đánh giá lực thực đếm khuẩn lạc; - TCVN 9330-2:2012 Sữa sản phẩm sữa - Kiểm soát chất lượng phòng thử nghiệm vi sinh vật - Phần 2: Xác định độ tin cậy số đếm khuẩn lạc đĩa song song bước pha loãng liên tiếp Lời giới thiệu Mỗi phương pháp vi sinh vật bao gồm số bước theo trình tự cụ thể (lấy mẫu con, pha loãng mẫu, đổ đĩa đếm khuẩn lạc) Độ không đảm bảo đo kết cuối xác định tính biến thiên tất bước liên quan quy trình phân tích Để thu kết có độ không đảm bảo đo không lớn so với kết dự kiến thực phương pháp, người phân tích cần tuân thủ quy định Thực hành phịng thử nghiệm tốt (GLP) Có ba yếu tố quan trọng để đạt số đếm đĩa xác là: - tính đồng vật liệu mẫu, - tính xác bước pha lỗng, - kỹ thuật cấy và/hoặc đếm khuẩn lạc đĩa ni cấy Có thể đánh giá khả thực kỹ thuật đếm khuẩn lạc phòng thử nghiệm đưa độ biến thiên mong muốn phương pháp cách đồng hóa kỹ vật liệu mẫu, tạo nhiều dãy dịch pha loãng cấy số đĩa từ dịch pha loãng Độ biến thiên lớn cho thấy bước thực phương pháp nằm ngồi tầm kiểm sốt Xác định bước cách so sánh đĩa ni cấy lặp lại, dịch pha lỗng khác dãy pha loãng khác Khi phát bước phương pháp phân tích có biến thiên lớn, phải tiến hành biện pháp cần thiết để kiểm soát bước SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - KIỂM SỐT CHẤT LƯỢNG TRONG PHỊNG THỬ NGHIỆM VI SINH VẬT - PHẦN 1: ĐÁNH GIÁ NĂNG LỰC THỰC HIỆN ĐẾM KHUẨN LẠC Milk and milk products - Quality control in microbiological laboratories - Part 1: Analyst performance assessment for colony counts Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn đưa quy trình kiểm tra lực thực đếm khuẩn lạc phòng thử nghiệm cách thiết lập độ biến thiên nội phòng thử nghiệm xác định bước có liên quan đến độ biến thiên mức kết Quy trình thích hợp để kiểm tra việc tn thủ xác Thực hành phịng thử nghiệm tốt (GLP) điều kiện tiên để tham gia kiểm tra phương pháp đếm khuẩn lạc phép thử liên phòng LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn VÍ DỤ: Các mẫu kiểm tra thích hợp sữa tươi nguyên liệu, sữa trùng sữa bột Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 6263 (ISO 8261) Sữa sản phẩm sữa - Hướng dẫn chung chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật TCVN 6404 (ISO 7218) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật TCVN 7150-4 (ISO 835-4) Dụng cụ thí nghiệm thủy tinh - Pipet chia độ - Phần 4: Pipet kiểu thổi ra1) TCVN 7151:2002 (ISO 648:1977) Dụng cụ thí nghiệm thủy tinh - Pipet mức 2) TCVN 8488 (ISO 4788) Dụng cụ thí nghiệm thủy tinh - Ống đong chia độ Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau: 3.1 Kỹ thuật đếm khuẩn lạc (colony-count technique) Việc đếm số lượng vi sinh vật xác định quy trình quy định tiêu chuẩn CHÚ THÍCH: Số lượng vi sinh vật biểu thị theo gam mililit mẫu thử Nguyên tắc (xem Hình 1) 4.1 Mẫu phân tích đồng hóa sau pha lỗng đến nồng độ làm việc thích hợp (ví dụ: 500 CFU/ml đến 10 000 CFU/ml) để thu huyền phù 4.2 Từ dung dịch pha loãng đầu tiên, chuẩn bị dãy pha loãng, dãy gồm 12 bước pha lỗng nhị phân CHÚ THÍCH: Sử dụng bước pha lỗng nhị phân (hai lần), khơng phải bước pha lỗng thập phân (10 lần) tiến hành thơng thường Với dung dịch pha lỗng nhị phân, đếm khuẩn lạc đĩa với dung dịch pha loãng, số lớn khuẩn lạc cải thiện đáng kể việc kiểm tra bước pha loãng 4.3 Mỗi dung dịch pha loãng dãy pha loãng đổ đĩa song song 4.4 Ủ ấm đĩa 4.5 Mã hóa đĩa đếm số khuẩn lạc đĩa 4.6 Lập bảng số đếm khuẩn lạc tính tốn "tính đồng có ý nghĩa thống kê" theo hai bước 4.7 Nếu giá trị thu đồng có ý nghĩa thống kê chất lượng việc ứng dụng phương pháp thỏa mãn không cần tiến hành đánh giá 4.8 Nếu kết khơng đồng có ý nghĩa thống kê tiến hành kỹ thuật phân tích phương sai (ANOVA) để xác định biến thiên kết điều kiện nhiều yếu tố bị thay đổi (nghĩa là: dãy pha loãng, mức pha loãng, việc đổ đĩa) Tiến hành đánh giá điều chỉnh yếu tố nhận diện CHÚ THÍCH: Người sử dụng phải thiết kế nguồn phát sinh lỗi chủ yếu thực phương pháp 1) Bộ tiêu chuẩn TCVN 7150:2002 (ISO 835:1981) (gồm phần) hủy bỏ thay TCVN 7150:2007 (ISO 835:2007) Dụng cụ thí nghiệm thủy tinh - Pipet chia độ 2) TCVN 7151:2002 (ISO 648:1977) hủy bỏ thay TCVN 7151:2010 (ISO 648:2008) Dụng cụ thí nghiệm thủy tinh - Pipet mức LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Hình - Đảm bảo chất lượng phịng thử nghiệm vi sinh vật: Thiết kế nghiên cứu thăm dò cho phương pháp đếm khuẩn lạc Dung dịch pha loãng, môi trường nuôi cấy thuốc thử Các thao tác mô tả Điều Điều phải tiến hành nhân viên chuẩn bị mơi trường riêng biệt chia nhóm với phân công nhiệm vụ rõ ràng cho thành viên Chỉ sử dụng thuốc thử đạt chất lượng phân tích nước cất nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có quy định khác Các thuốc thử nước phải không chứa chất tác động ngược đến phát triển vi sinh vật điều kiện phân tích Mơi trường ni cấy phải cơng nhận chất lượng vi khuẩn học Môi trường khử nước phải chuẩn bị theo hướng dẫn nhà sản xuất 5.1 Dung dịch natri hydroxit axit clohydric (khoảng 0,1 mol/l), để chỉnh pH chất pha loãng môi trường nuôi cấy 5.2 Môi trường nuôi cấy: thạch trypton-glucoza-chất chiết nấm men, bổ sung sữa bột gầy 5.2.1 Thành phần Chất chiết nấm men 2,5 g Dịch thủy phân tryptic casein (trypton) 5,0 g Glucoza ngậm phân tử nước (C6H12O6.H2O) 1,0 g Sữa bột gầy 1,0 g Thạch 10 g đến 15 ga Nước 000 ml a Phụ thuộc vào sức đông thạch Trong tất trường hợp, cần phải thêm sữa bột gầy cho dù mơi trường hồn chỉnh khơ thương mại nhà cung cấp khuyến nghị không cần phải bổ sung 5.2.2 Chuẩn bị LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn Cần chuẩn bị lít mơi trường lơ Nếu sử dụng mơi trường hồn chỉnh khơ thương mại tn thủ hướng dẫn nhà sản xuất phải bổ sung sữa bột gầy Chỉnh pH cho sau khử trùng đạt 7,0 ± 0,2 khoảng 450C Nếu môi trường chuẩn bị từ thành phần khơ hịa tan phân phối vào nước làm nóng trước theo thứ tự sau: chất chiết nấm men, trypton, glucoza cuối sữa bột gầy Đun nóng để hịa tan phân phối mơi trường Bổ sung thạch đun đến sôi, vừa đun vừa khuấy đến hịa tan hồn tồn Hoặc đun sơi hỗn hợp 30 Lọc môi trường qua giấy lọc, cần Chỉnh pH cho sau khử trùng đạt 7,0 ± 0,2 khoảng 450C Phân phối 250 ml môi trường nuôi cấy vào chai (6.10) Khử trùng chai lúc nồi hấp áp lực (6.1) 1210C 15 Bảo quản môi trường chuẩn bị nơi tối nhiệt độ từ 0C đến 50C sử dụng vòng tháng 5.3 Các chất pha loãng: dung dịch muối/pepton dung dịch Ringer phần tư cho lô 5.3.1 Dung dịch muối/pepton Chất pha loãng dùng cho mục đích chung 5.3.1.1 Thành phần Pepton 1,0 g Natri clorua (NaCl) 8,5 g Thêm nước đến 1000 ml 5.3.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước, đun nóng cần Chỉnh pH cho sau khử trùng đạt 7,0 ± 0,2 250C 5.3.2 Dung dịch Ringer phần tư 5.3.2.1 Thành phần Natri clorua (NaCl) 2,25 g Kali clorua (KCl) 0,105 g Canxi clorua khan (CaCl2) 0,06 g Natri hydrocacbonat (NaHCO3) 0,05 g Thêm nước đến 1000 ml 5.3.2.2 Chuẩn bị Hòa tan muối nước Chỉnh pH cho sau khử trùng đạt 6,9 ± 0,2 250C 5.3.3 Chuẩn bị chất pha loãng Khử trùng chất pha loãng cách hấp áp lực với lượng không lớn 500 ml Sau dùng ống đong chia độ vơ trùng dụng cụ phân phối khác (6.11) để phân phối phần 90 ml chất pha loãng nhiệt độ phịng vào chai pha lỗng mẫu (6.8) vơ trùng dùng pipet vạch dung tích ml pipet chia độ dụng cụ phân phối khác (6.12) để phân phối phần ml chất pha lỗng vào ống nghiệm vơ trùng (6.9) Khi sử dụng pipet, chạm đầu pipet vào mặt nghiêng bình chứa để đảm bảo phân phối xác lượng chất pha lỗng CHÚ THÍCH: Việc phân phối phần chất pha lỗng trước khử trùng dẫn đến bay không đồng đều, kết phần chất pha lỗng có nồng độ cuối khác Làm mát bảo quản chất pha loãng phần chất pha loãng phân phối nhiệt độ từ 0C đến 50C Sử dụng chất pha loãng phần chất pha loãng phân phối chậm ngày Thiết bị dụng cụ thủy tinh Khử trùng thiết bị có khả tiếp xúc với mẫu cần phân tích, chất pha lỗng, nồng độ pha lỗng mơi trường nuôi cấy theo TCVN 6404 (ISO 7218) TCVN 6263 (ISO 8261) Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm vi sinh thơng thường cụ thể sau: 6.1 Nồi hấp áp lực, vận hành 121 0C ± 0C LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn 6.2 Tủ sấy, vận hành nhiệt độ lớn 180 0C 6.3 Tủ ấm, vận hành 30 0C ± 0C tất điểm dải nhiệt độ cho phép hoạt động tủ 6.4 Máy đo pH, hiệu chỉnh theo nhiệt độ, độ xác đến ± 0,1 đơn vị pH 6.5 Nồi cách thủy, vận hành 20 0C ± 0C, 45 0C ± 0C từ 44 0C đến 47 0C 6.6 Kính lúp, loại có độ phóng đại từ 2x đến 4x loại có độ phóng đại 8x 6.7 Bi thủy tinh, có đường kính khoảng mm 6.8 Chai pha lỗng, dung tích danh định từ 150 ml đến 250 ml, có nắp đậy kín, chứa từ đến 10 viên bi thủy tinh (6.7) Cho bi thủy tinh vào trước khử trùng chai pha loãng 6.9 Ống nghiệm, dài 150 mm, đường kính 15 mm, có nắp đậy 6.10 Chai, dung tích danh định 500 ml, có nắp đậy, để bảo quản phần 250 ml môi trường nuôi cấy 6.11 Ống đong chia độ, với độ chia chính, phù hợp với TCVN 8488 (ISO 4788) dụng cụ phân phối khác có độ xác tương đương 6.12 Pipet vạch pipet chia độ, hiệu chuẩn, có khả phân phối ml, ml 10 ml phù hợp với loại A TCVN 7151 : 2002 (ISO 648:1977), TCVN 7150-4(ISO 835-4) dụng cụ phân phối khác có độ xác tương đương 6.13 Đĩa Petri, làm thủy tinh không màu suốt vật liệu nhựa, đường kính đáy 90 mm không gây ảnh hưởng đến kết đếm khuẩn lạc 6.14 Máy khuấy trộn học, có khả trộn lượng chứa ống nghiệm, làm việc theo nguyên tắc lệch tâm (ví dụ: máy trộn vortex) 6.15 Cân, có phạm vi đo thích hợp, cân xác đến 0,05 g Lấy mẫu Mẫu gửi đến phịng thử nghiệm phải mẫu đại diện khơng bị hư hỏng bị biến đổi chất lượng suốt trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Chuẩn bị mẫu thử 8.1 Sữa Lắc mạnh mẫu thử cách đảo chiều vật chứa mẫu 25 lần cho vi sinh vật phân tán đồng Tránh tạo bọt để bọt lan rộng Khoảng thời gian xen kẽ trộn mẫu lấy phần mẫu thử không 8.2 Sữa bột Trộn lượng chứa vật chứa kín cách lắc đảo nhiều lần Nếu mẫu thử đựng vật chứa kín nguyên vẹn q đầy để trộn chuyển mẫu sang vật chứa lớn sau trộn Cách tiến hành 9.1 Yêu cầu chung Trong phương pháp đếm khuẩn lạc, đĩa cấy thường xun khơng đếm hồn tồn đếm phần nhiều nguyên nhân khác (khuẩn lạc mọc lan, nấm mốc phát triển, v.v…) Đối với phương pháp hành, chấp nhận thiếu số giới hạn kết đếm (xem 10.1) Nếu thiếu nhiều kết vật liệu mẫu khơng thích hợp phép thử có sai sót kỹ thuật Trong trường hợp vậy, lặp lại quy trình với vật liệu mẫu khác thích hợp tn thủ nghiêm ngặt quy trình phân tích 9.2 Số lượng bước pha loãng thập phân Xác định số bước pha loãng thập phân dựa mật độ vi sinh vật dự kiến có mẫu sau: a) số đếm dự kiến nhỏ 100 000 ml g mẫu chuẩn bị dung dịch pha loãng thập phân đến 0,1 (một bước pha loãng thập phân); LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn b) số đếm dự kiến từ 100 000 đến 000 000 ml g mẫu chuẩn bị dung dịch pha lỗng thập phân đến 10-2 (hai bước pha loãng thập phân); c) số đếm dự kiến lớn 000 000 ml g mẫu chuẩn bị dung dịch pha loãng thập phân đến 10-3 (ba bước pha loãng thập phân) 9.3 Chuẩn bị dung dịch pha loãng thập phân 9.3.1 Sữa Dùng pipet vô trùng (6.12) để lấy ml mẫu thử (8.1) thêm vào ml chất pha loãng (5.3) (hoặc 10 ml mẫu thử 90 ml chất pha loãng 11 ml mẫu thử 99 ml chất pha loãng) Lắc dung dịch pha lỗng ban đầu [ví dụ: lắc tay 25 lần chuyển động ngang 300 mm s dùng máy khuấy trộn học (6.14) từ s đến 10 s] để đạt độ pha loãng 10 -1 9.3.2 Sữa bột 9.3.2.1 Mở vật chứa (8.2), dùng dao trộn để lấy lượng phần mẫu thử cần thiết tiến hành theo 9.3.2.2 Đậy vật chứa 9.3.2.2 Cân 10 g mẫu thử vào dụng cụ thủy tinh thích hợp (ví dụ: cốc có mỏ) sau cho sữa bột vào chai pha lỗng chứa chất pha lỗng thích hợp (5.3) Cách khác, cân 10 g mẫu trực tiếp vào chai pha loãng chứa chất pha lỗng thích hợp Để hịa tan mẫu thử, xoay nhẹ nhàng để làm ướt sữa bột sau lắc chai (ví dụ: 25 lần với chuyển động ngang 300 mm khoảng s) Có thể sử dụng máy trộn kiểu nhu động làm thiết bị lắc Để yên min, lắc 9.4 Chuẩn bị dung dịch pha loãng thập phân Chuẩn bị dung dịch pha loãng theo TCVN 6263 (ISO 8261) 9.5 Làm tan chảy môi trường Trước bắt đầu thao tác theo 9.6, làm tan chảy môi trường (5.2) để nguội nồi cách thủy (6.5) đặt nhiệt độ từ 44 0C đến 47 0C Kiểm tra nhiệt độ môi trường cách đặt nhiệt kế vào 250 ml thạch (ví dụ: thạch nước) bình riêng biệt giống với bình đựng mơi trường Rót thạch lỏng vịng h sau làm tan chảy 9.6 Chuẩn bị dung dịch pha lỗng nhị phân cấy mơi trường 9.6.1 Dãy pha loãng (S1) Lấy 12 ống nghiệm pha loãng (6.9) chứa ml dung dịch pha loãng bảo quản lạnh (5.3.3) Chuẩn bị dung dịch pha loãng nhị phân (D1, D2,…) cách dùng pipet dung tích ml để lấy ml huyền phù dung dịch pha lỗng trước (9.4) vào ống nghiệm chứa ml chất pha loãng Trộn huyền phù lần s máy khuấy (6.14) trước lần lấy huyền phù để đưa vào ống nghiệm Đặt chai pha loãng thập phân cuối (9.4) trở lại tủ lạnh sau lấy dịch cấy Trước bắt đầu tiến hành dãy pha loãng nhị phân tiếp theo, cấy đĩa Petri (P 1, P2 P3) từ dung dịch pha loãng số 12 dung dịch pha loãng, dùng pipet chia độ pipet vạch dung tích ml (6.12) Sử dụng pipet vô trùng cho dung dịch pha loãng Sau cấy tất đĩa dãy (S1), rót từ 12 ml đến 15 ml mơi trường ni cấy (9.5) làm nóng chảy làm ấm (từ 44 0C đến 47 0C) vào đĩa Petri theo thứ tự lúc cấy mẫu Cẩn thận trộn môi trường với dịch cấy cách xoay đĩa Petri để khuẩn lạc phân bố đồng sau ủ Để cho hỗn hợp đông lại cách đặt đĩa Petri bề mặt phẳng nguội 9.6.2 Các dãy pha loãng (S2, S3 S4) Sau hoàn thành dãy pha loãng đổ đĩa, chuẩn bị dãy pha loãng thứ hai, thứ ba thứ tư (S2, S3 S4) tương tự, bắt đầu dãy pha loãng cách trộn lượng chứa chai pha loãng thập phân cuối (9.4) bảo quản tủ lạnh thời gian chờ đợi trước Dùng phần phần, phần gồm 250 ml môi trường làm tan chảy để đổ đĩa cho dãy pha loãng loại bỏ phần mơi trường cịn dư 9.7 Ủ ấm Lật úp đĩa chuẩn bị đặt tủ ấm (6.3) nhiệt độ 30 0C 72 h ± h Không chồng cao đĩa Đánh dấu vị trí đĩa chồng (dưới-giữa-trên) CHÚ THÍCH: Thơng tin có ích xuất biến thiên lớn đĩa cấy xem xét ảnh hưởng việc chồng đĩa LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Không để chồng đĩa sát sát thành tủ ấm trần tủ ấm Khơng để khay tủ ấm 9.8 Mã hóa ngẫu nhiên đĩa đếm khuẩn lạc 9.8.1 Mã hóa ngẫu nhiên Khơng đếm đĩa theo thứ tự pha lỗng nhóm theo bước pha lỗng điều dẫn đến kết ước lượng độ biến thiên thấp người đếm khuẩn lạc có mong muốn chủ quan tới kết Vì vậy, trước tiên phải kiểm tra mã hóa đĩa mô tả điều người khơng tham gia vào q trình đếm 9.8.2 Bắt đầu từ dãy pha loãng nhất, lựa chọn dung dịch pha lỗng đếm được, nghĩa dung dịch pha lỗng có số đếm dự kiến trung bình từ đến 300 khuẩn lạc đĩa Mã hóa tất đĩa dung dịch pha lỗng đếm được, sử dụng bảng số ngẫu nhiên để mã hóa ngẫu nhiên đĩa tất dãy dung dịch pha loãng Xem Bảng bảng số ngẫu nhiên vậy; sử dụng số ngẫu nhiên từ đến 144 Xóa dấu hiệu ban đầu đĩa, nên sử dụng nhãn dán tháo rời Chỉ rõ đĩa không đếm dấu trừ quy trình (xem Bảng 2) 9.8.2 Đếm khuẩn lạc Kiểm tra đĩa ánh sáng dịu Để hỗ trợ q trình đếm, nên dùng kính lúp (6.6) và/hoặc máy đếm thích hợp Chú ý tránh đếm nhầm thành phần mẫu khơng hịa tan chất kết tủa đĩa với khuẩn lạc nhỏ Kiểm tra khuẩn lạc nghi ngờ này, sử dụng kính lúp có độ phóng đại cao (6.6) để phân biệt khuẩn lạc với chất ngoại lai, cần Điền số đếm khuẩn lạc vào Bảng Độ lệch số đếm ảnh hưởng đến kết đánh giá, đĩa bị mọc lan toàn đĩa cần rõ bảng (Hình 2) Việc mã hóa đếm khuẩn lạc phải thực ngày kết thúc ủ ấm 10 Ước lượng thống kê 10.1 Sự phù hợp liệu CHÚ THÍCH: Trong bảng cơng thức, kí hiệu i, j k tương ứng số dãy pha loãng S, dung dịch pha lỗng D đĩa P Khi khơng thể đếm tất đĩa song song độ pha lỗng loại bỏ tất số đếm dung dịch pha loãng dãy pha lỗng khác Thực nghiệm ước lượng thống kê có liệu mức pha lỗng nhị phân Có thể chấp nhận thiếu 5% số đếm [nghĩa là: đĩa cấy tổng số 60 đĩa (5 mức pha loãng) đĩa cấy tổng số 72 đĩa (6 mức pha loãng)] trừ trường hợp số thiếu nằm trọn ba đĩa song song Trong trường hợp này, phải loại bỏ tất đĩa dung dịch pha lỗng tương ứng Thêm vào đó, số đếm trung bình mong muốn độ pha lỗng chấp nhận phải nằm khoảng đến 300 khuẩn lạc đĩa Nếu tất điều kiện khơng đáp ứng liệu coi khơng đầy đủ Lặp lại quy trình, chọn vật liệu mẫu thích hợp (nếu có q nhiều đĩa không đếm được) tuân thủ nghiêm ngặt hướng dẫn sử dụng, hai Bảng - Ví dụ bảng ghi số đếm khuẩn lạc, sử dụng q trình đếm đĩa mã hóa Bảng theo số thứ tự đĩa Đĩa Số khuẩn lạc Đĩa Số khuẩn lạc Đĩa Số khuẩn lạc Đĩa 37 73 109 38 74 110 39 75 111 40 76 112 41 77 113 42 78 114 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Số khuẩn lạc Công ty luật Minh Khuê Đĩa Số khuẩn lạc Đĩa www.luatminhkhue.vn Số khuẩn lạc Đĩa Số khuẩn lạc Đĩa 43 79 115 44 80 116 45 81 117 10 46 82 118 11 47 83 119 12 48 84 120 13 49 85 121 14 50 86 122 15 51 87 123 16 52 88 124 17 53 89 125 18 54 90 126 19 55 91 127 20 56 92 128 21 57 93 129 22 58 94 130 23 59 95 131 24 60 96 132 25 61 97 133 26 62 98 134 27 63 99 135 28 64 100 136 29 65 101 137 30 66 102 138 31 67 103 139 32 68 104 140 33 69 105 141 34 70 106 142 35 71 107 143 36 72 108 144 Số khuẩn lạc CHÚ THÍCH: Các đĩa không đếm đếm ghi "-", đĩa khơng có khuẩn lạc ghi "O" 10.2 Ước lượng liệu đầy đủ (xem Hình 2) 10.2.1 Lập bảng số đếm Mỗi số đếm thuộc dãy pha loãng cụ thể S i (S1, S2, S3 S4), dung dịch pha lỗng cụ thể Dj (D1, D2, …D6, D1 dung dịch pha lỗng cho đĩa đọc kết quả) đĩa cụ thể Pk (P1, P2 P3) Để khái quát kết quả, xếp số đếm Bảng theo dãy pha loãng Sj, nồng độ pha loãng Dj đĩa cấy Pk Bảng Bảng - Lập bảng số đếm Si Dj Pk P1 P2 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 P3 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Si Dj S1 D1 C111 C112 C113 D2 C121 C122 C123 Dj C1j1 … … … … … … D1 C211 … … D2 … … … Dj … … … … … … … Si Dj … Cij2 … … … … … … S2 Pk CHÚ THÍCH: C123 số đếm đĩa thứ ba, dung dịch pha loãng thứ hai dãy pha loãng 10.2.2 Kiểm tra tính đồng việc đổ đĩa: phép thử G 2P Bước ước lượng thống kê số đếm (xem Hình 2) bao gồm xác định độ lớn tính đồng có ý nghĩa thống kê đĩa cấy lặp lại Phép thử tiến hành để phát kết "quá tốt", nghĩa là: phát trường hợp độ biến thiên số đếm đĩa song song P1, P2 P3 nhỏ dự kiến ("phân tán thấp") Điều này, ví dụ, có nguyên nhân từ việc mã hóa đĩa khơng hợp lí trước đếm Tính đồng có ý nghĩa thống kê số đạt sau (xem Phụ lục A để có thêm thơng tin chi tiết phép thử G2P ví dụ Bảng 6) a) Xác định giá trị trung bình Cij nhóm đĩa song song (ví dụ: C12 = C121 + C122 + C123)/3, trung bình kết hàng bảng) b) Tính tốn đĩa với số đếm Cijk, giá trị Cijk.ln(Cijk/Cij), với Cij giá trị trung bình kết đĩa cấy song song c) Tính tổng giá trị hàng (các đĩa cấy song song) nhân với để thu giá trị G riêng biệt cho đĩa song song Viết thơng số vào bảng Tính tổng giá trị tất độ pha loãng dãy pha loãng để thu giá trị thử: G2P = [ (Cijk ln ) ] Trong s số dãy pha loãng, d số bước pha lỗng p số đĩa CHÚ THÍCH: Cơng thức thay thế, (A.6) (A.7), nêu Phụ lục A d) So sánh giá trị G2P với giá trị ("khi" bình phương) Bảng với 40 bậc tự (df = 40) trường hợp dung dịch pha loãng 48 bậc tự (df = 48) trường hợp dung dịch pha loãng Nếu số kết bị thiếu (xem 10.1) lấy bậc tự df trừ số kết bị thiếu trước so với giá trị Bảng Nếu giá trị G2P thấp giá trị xác suất 0,995 bảng số đếm đĩa song song có độ biến thiên thấp dự kiến: giá trị đồng mặt thống kê Người phân tích phải xác nhận điều cách mã hóa ngẫu nhiên đĩa lần đếm lại từ đầu Trong trường hợp xác nhận, phải lặp lại việc thực nghiệm tuân thủ nghiêm ngặt quy trình Nếu giá trị G2P lớn giá trị xác suất (P) 0,995 % bảng độ biến thiên đĩa song song không thấp Tiếp tục phép thử theo 10.2.3 Nếu giá trị G2P lớn đáng kể so với giá trị xác suất 0,01 đĩa song song có độ biến thiên lớn dự kiến Lưu ý đến điều sử dụng để diễn giải độ biến thiên tổng thể giai đoạn sau Bảng - Các giá trị cho df (P = 0,01 P = 0,995) df 37 59,89 18,59 44 68,71 23,58 38 61,16 19,29 45 69,96 24,31 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn df df 39 62,43 20,00 46 71,20 25,05 40 63,69 20,71 47 72,44 25,78 48 73,68 26,51 Hình - Lưu đồ phân tích thống kê nghiên cứu thành thạo đếm khuẩn lạc phịng thử nghiệm 10.2.3 Thử nghiệm tính đồng chung số đếm 10.2.3.1 Phép thử G2A Bước thứ hai (xem Hình 2) bao gồm xác định độ lớn tính đồng có ý nghĩa thống kê toàn liệu Trong phép thử này, số đếm so sánh với giá trị dự kiến, có tính đến ảnh hưởng dung dịch pha lỗng Tính đồng có ý nghĩa thống kê chung số đơn thu sau (xem thêm Ví dụ) a) Xác định tổng số đếm khuẩn lạc bảng (ΣCijk) tổng thể tích mẫu (ΣVijk) khuẩn lạc đếm LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn VÍ DỤ: Bốn dãy pha loãng S1, S2, S3 S4 chuẩn bị từ mẫu đồng tốt pha loãng thích hợp Chuẩn bị dãy pha lỗng nhị phân từ mẫu cấy đĩa song song P 1, P2 P3 từ dung dịch pha loãng Dj Sáu dung dịch pha loãng cho kết đếm Các số đếm trình bày Bảng Tất giá trị tính tốn máy tính điện tử có đầy đủ chức sau kết làm trịn đến chữ số thập phân Bảng - Dữ liệu gốc Si S1 S2 S3 S4 Dj Pk P1 P2 P3 Cij E(Cijk) G2 D1 2-6 84 113 109 102,00 205,80 4,997 D2 2-7 74 82 70 75,33 102,90 0,984 D3 -8 35 43 33 37,00 51,45 1,483 D4 2-9 10 13 16 13,00 25,72 1,397 D5 2-10 11 9,00 12,86 0,896 D6 -11 2 1,67 6,43 4,256 D1 2-6 238 236 226 233,33 205,80 0,356 D2 2-7 154 153 153 153,33 102,90 0,004 D3 -8 154 126 111 130,33 51,45 7,226 D4 2-9 33 34 38 35,00 25,72 0,395 D5 2-10 16 15 21 17,33 12,86 1,161 D6 -11 5,00 6,43 0,403 D1 2-6 154 151 136 147,00 205,80 1,280 D2 2-7 84 68 72 74,67 102,90 1,831 D3 -8 44 65 63 57,33 51,45 4,899 D4 2-9 25 35 25 28,33 25,72 2,275 D5 2-10 13 13 13 13,00 12,86 0,000 D6 -11 2,67 6,43 6,993 D1 2-6 238 236 224 232,67 205,80 0,496 D2 2-7 154 156 146 152,00 102,90 0,371 D3 -8 63 61 56 60,00 51,45 0,437 D4 2-9 17 32 28 25,67 25,72 4,980 D5 2-10 11 10 12 11,00 12,86 0,182 D6 -11 4,00 6,43 5,062 Các số: i = 4, j = 6, k = Tổng = G = 52,364 Trong Bảng 6, cột Cij gồm giá trị trung bình đĩa song song, cột E(C ijk) gồm giá trị trung bình dự kiến dung dịch pha lỗng Các giá trị E(Cijk) tính sau (các bước pha loãng sử dụng: từ D = 2-6 đến D6 = 2-11) Các thể tích biểu thị theo đơn vị tương đối (độ pha loãng cao -11 coi đơn vị thể tích): - V1 (tương ứng với D1) = 25V6 = 32 - V2 (tương ứng với D2) = 24V6 = 16 - V3 (tương ứng với D3) = 23V6 = - V4 (tương ứng với D4) = 22V6 = LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn - V5 (tương ứng với D5) = 21V6 = - V6 (tương ứng với D6) = - Tổng số khuẩn lạc: 84 + 113 + 109 + 74+ … + + + = 4862 - Tổng thể tích (theo đơn vị V6): (12 x 32) + (12 x 16) + (12 x 8) + (12 x 4) + (12 x 2) + (12 x 1) = 756 - Số khuẩn lạc dự kiến E(Cijk) thể tích V6 = 4862/756 = 6,43 - Số khuẩn lạc dự kiến E(Cijk) thể tích V5 = 4862/756 x = 12,86 - Số khuẩn lạc dự kiến E(Cijk) thể tích V4 = 4862/756 x = 25,72 - Số khuẩn lạc dự kiến E(Cijk) thể tích V3 = 4862/756 x = 51,45 - Số khuẩn lạc dự kiến E(Cijk) thể tích V2 = 4862/756 x 16 = 102,90 - Số khuẩn lạc dự kiến E(Cijk) thể tích V1 = 4862/756 x 32 = 205,80 Dữ liệu dãy pha loãng nêu sơ đồ Hình Đường thẳng biểu đồ số bốn biểu đồ nêu lên giá trị dự kiến dung dịch pha loãng dãy pha loãng tiến hành hoàn hảo Mỗi giá trị dãy pha lỗng kí hiệu dấu "+" Hình a) biểu diễn bốn đường thẳng Hình biểu đồ Các độ lệch tương hỗ chúng cho biết chất lượng việc lấy mẫu Hình b) trung bình đĩa song song (cột Cij Bảng 6) dãy pha loãng Trong trường hợp lý tưởng, tất điểm nằm đường a) Dãy pha loãng b) Dãy pha loãng LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn c) Dãy pha loãng d) Dãy pha loãng CHÚ DẪN X độ pha loãng 2-x (thang nhị phân) Y số đếm khuẩn lạc (thang nhị phân) Hình - Các dãy pha lỗng LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn a) Các trung bình theo khối lượng dãy pha lỗng b) Các trung bình đĩa cấy song song dãy pha loãng CHÚ DẪN X độ pha loãng 2-x (thang nhị phân) Y số đếm khuẩn lạc (thang nhị phân) Hình - Các trung bình theo khối lượng trung bình đĩa cấy song song 10.2.3.2 Tính giá trị phép thử G Đối với phép tính này, sử dụng giá trị cột Cij Tính giá trị G (cột cuối Bảng 6) đĩa song song hàng [ 84•ln (84/102) + 113•ln (113/102) + 109•ln (109/102)] = 4,997 [ 74•ln (74/75,33) + 82•ln (82/75,33) + 70•ln (70/75,33)] = 0,984 … [ 1•ln (1/4) + 7•ln (7/4) + 4•ln (4/4)] = 5,062 Cộng tất giá trị để thu giá trị tính đồng chung việc đổ đĩa song song: LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê G www.luatminhkhue.vn = 4,997 + 0,984 + … + 5,062 = 52,364 Số bậc tự G tính tổng tất bậc tự G Trong ví dụ nêu khơng thiếu số đếm nào, hàng có bậc tự tổng số bậc tự df = 48 Giá trị G (52,364) lớn giá trị 26,51 nhỏ giá trị 73,68 Bảng 4, độ biến thiên đĩa song song nằm giới hạn cho phép 10.2.3.3 Tính giá trị phép thử G Các giá trị E(Cijk) cột dùng để tính tốn: G = [ 84•ln (84/205,80) + 113•ln (113/205,80) + … + 4•ln (4/6,43)] = (420,35) = 840,70 Số bậc tự = (72 -1) = 71 Giá trị G (840,70) lớn nhiều so với giá trị 101,62 Bảng Do độ biến thiên tổng thể vượt giới hạn; phân tích thống kê nên tiếp tục để tìm nguồn gốc độ biến thiên lớn 10.2.4 Nguồn gốc sai số phân tích phương sai (xem Hình 2) 10.2.4.1 Mỗi yếu tố quy trình liên quan đến độ biến thiên xác định (thuật ngữ thống kê gọi phương sai) Trừ thay đổi lý tưởng đĩa song song, biết độ lớn phương sai yếu tố phương pháp áp dụng Tuy nhiên, thay đổi lớn nhiều so với giá trị dự kiến vấn đề bước cụ thể phương pháp Vì kết liên quan đến số nguồn biến thiên (lấy mẫu con, pha lỗng, đổ đĩa kết hợp yếu tố này), cần phải tách biến thiên liên quan đến nguồn từ liệu chung Điều thực cách dùng kỹ thuật thống kê gọi "phân tích phương sai" CHÚ THÍCH 1: Đối với sở lý thuyết kỹ thuật nêu trên, xem sách thống kê CHÚ THÍCH 2: Nếu thiếu liệu (xem 10.1) giá trị tương ứng ước lượng cách lấy trung bình đĩa song song dãy pha loãng nồng độ pha loãng Sai số thao tác nhỏ có ảnh hưởng khơng đáng kể đến kết luận 10.2.4.2 Thực tách phương sai sau Các số đếm Cijk bảng (xem 10.2.2) chuyển thành giá trị T ijk theo cơng thức: Tijk = Trong E(Cijk) giá trị dự kiến dung dịch pha loãng (xem 10.2.3) CHÚ THÍCH: Nếu nhiều liệu bị thiếu ước lượng (xem Chú thích 10.2.4.1) phải tính lại giá trị dự kiến E(C ijk) liệu tổng thể trước thực chuyển đổi Các số đếm vi sinh vật tuân theo phân bố thống kê gọi phân bố Poisson Tuy nhiên, việc phân tích phương sai lại tuân thủ theo phân bố Gauss (còn gọi phân bố chuẩn), liệu thơ khơng sử dụng trực tiếp tính tốn Chuyển dạng khai liệu cho phương sai số đếm hợp lý với giả định lý thuyết kỹ thuật phân tích phương sai 10.2.4.3 Từ liệu chuyển dạng, Tijk tính giá trị tổng số Tổng số tất giá trị chuyển dạng: (v) = Trong đó: s số dãy pha lỗng Si (= 4); d số bước pha loãng Dj (=5 6); p số đĩa Pk (=3) Tổng bình phương tất giá trị chuyển dạng: (w) = LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Tổng bình phương tồn nhóm đĩa cấy lặp lại, P k: (x) = Tổng bình phương tồn dãy pha lỗng S i: (y) = Tổng bình phương tồn dung dịch pha loãng Dj: (z) = 10.2.4.4 Các tổng dùng để tính tổng bình phương: Nguồn biến thiên Tổng bình phương Giữa dãy pha lỗng S (Σ1) = Các bước pha loãng D dãy pha loãng S (Σ2) = Giữa đĩa song song (Σ3) = (w) - Tổng số (Σ4) = (w) - Các tổng bình phương dùng để tính bình phương trung bình, bình phương trung bình với bình phương trung bình dự kiến lý thuyết dùng để xác định phương sai Các bước trình bày Bảng Bảng - ANOVA: Các bình phương trung bình bình phương trung bình dự kiến Nguồn biến thiên Tổng bình phương df Giữa dãy pha loãng S (Σ1) s-1 = Giữa bước pha loãng D dãy pha loãng (Σ2) s(d - 1) = Giữa đĩa song song (Σ3) s x d(p - 1) Tổng (Σ4) s x d x p -1 Phương sai đĩa, pha loãng, lượng từ ( - = Bình phương trung bình dự kiến +p + dp +p = ước lượng từ S Phương sai bước pha loãng dãy , ước lượng từ ( )/dp Tổng phương sai Bình phương trung bình + + - )/p phương sai dãy pha loãng, , ước 10.2.5 Ước lượng phương sai Giá trị lý tưởng khoảng 0,25; kinh nghiệm cho thấy tổng phương sai có sai lỗi nghiêm trọng lớn Nếu tổng phương sai nhỏ phương pháp coi điều kiện kiểm sốt thống kê Nếu tổng phương sai lớn nhiều yếu tố kiểm soát mặt thống kê Trong trường hợp này, phải mở rộng phân tích phương sai để xác định khuyết điểm tiến hành phương pháp Việc mở rộng phân tích thống kê bao gồm hai bước Đầu tiên, phương sai liên quan đến "các bước pha loãng dãy pha loãng" phân thành phương sai liên quan đến bước pha loãng phương sai sinh tương tác xảy bước pha lỗng dãy pha lỗng Sau phương sai kiểm tra ý nghĩa thống kê để phân loại yếu tố theo mức quan trọng Trước hết nên tính giá trị bổ sung sau đây: LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn Tổng bình phương dung dịch pha loãng D: (Σ5) = Tổng bình phương tương tác bước pha lỗng dãy pha lỗng tính bằng: (Σ6) = (Σ2) - (Σ5) Các kết phân tích phương sai hoàn chỉnh nêu Bảng Bảng - Các kết phân tích phương sai Nguồn biến thiên Tổng bình phương df Bình phương trung bình Giữa dãy pha loãng S (Σ1) s-1 = Giữa bước pha loãng D (Σ5) d-1 = Tương tác (Σ6) (s -1)(d - 1) = Giữa đĩa song song (Σ3) s x d(p - 1) = Tổng (Σ4) (s x d x p) - Giá trị F Xác định giá trị F để kiểm tra ý nghĩa phương sai tương ứng Các giá trị F tỷ số hai phương sai tử số phương sai tính liên quan đến yếu tố cần xem xét mẫu số phương sai dự kiến yếu tố cần xem xét khơng tạo nên tổng phương sai Nếu yếu tố cần xem xét khơng có ảnh hưởng hai phương sai độc lập tỷ số chúng nằm dải xác định trước Tuy nhiên, hệ số làm tăng độ biến thiên phương sai tử số trở nên lớn khiến cho tỉ lệ F nằm dải xác định trước So sánh giá trị F thu với F(f1, f2) tương ứng Bảng mức xác suất P = 0,01 Các kí hiệu f1 f2 số bậc tự (cột df Bảng 8) phương sai tử số phương sai mẫu số tương ứng Bảng - Giá trị F cho kết hợp lựa chọn f1/f2 (P = 0,01) f1 f2 F 12 5,95 15 5,42 12 5,41 15 4,56 12 40 2,66 15 48 2,44 10.2.6 Kết luận hành động Cần xem xét kỹ yếu tố làm cho giá trị F vượt giá trị tới hạn Bảng Chúng cho thấy khía cạnh (tính đồng mẫu, thao tác) nên đưa điều kiện kiểm soát trước sử dụng số đếm khuẩn lạc Giải thích giá trị có nghĩa yếu tố khác sau: a) dãy pha loãng S: sai số hệ thống việc chuẩn bị dãy pha loãng khác (đồng hóa vật liệu mẫu, phân phối); b) bước pha loãng D: sai số cách chuẩn bị bước pha loãng; c) tương tác: sai số chung tiến hành công việc; d) đĩa: phương sai đĩa lớn nhiều so với 0,25 phải giải thích rõ; giá trị cao khơng phải đĩa cấy song song thay đổi mức (xem thành phần giá trị G Bảng 6) xem xét ảnh hưởng việc chồng đĩa cách tính tổng số đếm khuẩn lạc tồn liệu theo vị trí chúng chồng đĩa (trên-giữa-dưới); LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn e) ước lượng ảnh hưởng phương sai cao phân tích phương sai Sau xem xét hiệu bước khiếm khuyết áp dụng phương pháp, phải lặp lại tồn quy trình để xác nhận vấn đề hiệu VÍ DỤ: Dữ liệu Bảng thay giá trị chuyển dạng: hai cột bên phải đưa tổng giá trị hàng tổng giá trị bình phương hàng Bảng 10 - Các liệu chuyển dạng Si S1 S2 S3 S4 Dj Pk Tổng Tổng bình phương P1 P2 P3 D1 -6 -5,181 -3,716 -3,905 -12,801 55,895 D2 2-7 -1,542 -1,089 -1,777 -4,408 6,720 D3 -8 -1,257 -0,615 -1,428 -3,300 3,998 D4 -9 -1,910 -1,466 -1,072 -4,448 6,946 D5 2-10 -0,941 -0,270 -0,586 -1,797 1,302 D6 -11 -2,536 -1,122 -0,804 -4,462 8,336 D1 2-6 1,082 1,017 0,688 2,786 2,676 D2 -7 2,266 2,225 2,225 6,716 15,038 D3 -8 5,237 4,052 3,363 12,652 55,153 D4 2-9 0,673 0,759 1,092 2,524 2,222 D5 -10 0,414 0,287 0,996 1,696 1,245 D6 -11 -0,536 -0,300 -0,086 -0,922 0,385 D1 2-6 -1,936 -2,057 -2,684 -6,677 15,184 D2 -7 -0,979 -1,898 -1,659 -4,535 7,311 D3 2-8 -0,540 0,889 0,764 1,114 1,667 D4 -9 -0,072 0,844 -0,072 0,700 0,723 D5 -10 0,019 0,019 0,019 0,057 0,001 D6 2-11 -0,300 -2,536 - 0,804 -3,640 7,167 D1 -6 1,082 1,017 0,621 2,719 2,589 D2 -7 2,266 2,346 1,939 6,551 14,398 D3 2-8 0,764 0,637 0,310 1,712 1,087 D4 -9 -0,949 0,585 0,220 -0,144 1,291 D5 2-10 -0,270 -0,424 -0,122 -0,816 0,268 D6 -11 -1,536 0,110 -0,536 -1,962 2,659 2 2 2 Tổng tổng (v) -10,685 Tổng tổng bình phương (w) 214,260 (x) = tổng [các bình phương tổng nhóm đĩa cấy lặp lại] = tổng bình phương giá trị cột "tổng" Bảng 10 = (-12,801)2 + (-4,408)2 + … + (-1,962)2 = 598,070 (z) = tổng [ bình phương tổng dãy pha loãng] Các dãy pha lỗng Tổng số Các bình phương S1 -31,216 974,445 S2 25,452 647,800 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Các dãy pha lỗng Tổng số Các bình phương S3 -12,981 168,494 S4 8,059 64,953 Tổng (v) 1855,693 (y) Các tổng (v), (w), (x) (y) sử dụng để tính tổng bình phương: Nguồn biến thiên Tổng bình phương Giữa dãy pha loãng S (Σ1) = Các bước pha loãng D dãy pha loãng S = 101,508 (Σ2) = Giữa đĩa cấy song song = 96,263 (Σ3) = 214,260 - Tổng =14,903 (Σ4) = 214,260 - =212,674 Từ tổng bình phương thu được, tính bình phương trung bình sau coi chúng bình phương trung bình dự kiến theo lý thuyết để ước lượng phương sai Nguồn biến thiên Tổng bình phương df Giữa dãy pha lỗng S (Σ1) Các bước pha loãng D dãy pha loãng (Σ2) 20 Giữa đĩa song song (Σ3) 48 Các bình phương trung bình = = 33,836 = = 4,813 = = 0,310 Ước lượng thành phần phương sai (xem Bảng 7): ước lượng = 0,310; ước lượng ( - )/p = (4,813 - 0,310)/3 = 1,510; ước lượng ( - )/dp = (33,836 - 4,813)/18 = 1,612; ước lượng 0,310 + 1,501 + 1,612 = 3,424 Khi giá trị cuối lớn giá trị cho phép cực đại phải tiến hành xem xét nguồn gốc sai số Các giá trị sau phải tính tốn trước tiên: (z) = tổng bình phương tổng cho bước pha lỗng Các bước pha lỗng Tổng Các bình phương D1 -13,974 195,271 D2 4,325 18,703 D3 12,178 148,299 D4 -1,368 1,872 D5 -0,859 0,739 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Các bước pha lỗng Tổng Các bình phương D6 -10,986 120,695 Tổng (v) 485,579(z) Tổng bình phương bước pha lỗng (Σ5) = =38,879 Tổng bình phương tương tác (Σ6) = 96,263 - 38,879 = 57,384 Sử dụng giá trị để hoàn thành bảng phân tích phương sai (xem Bảng 8): Bảng 11 - Tính tốn Nguồn biến thiên Tổng bình phương df Bình phương trung bình Giá trị F Giữa dãy pha loãng S 101,508 s12 = 33,836 8,845a Giữa bước pha loãng D 38,879 s52 = 7,776 2,033 (n.s.)b Tương tác 57,384 15 s62 = 3,826 12,321a Giữa đĩa song song 14,903 48 s32 = 0,310 Tổng 212,674 71 a Có nghĩa mức ý nghĩa P = 0,01 b n.s.: khơng có ý nghĩa thống kê So sánh giá trị F mức xác suất 0,01 (Bảng 9) với giá trị tính đây: - dãy pha loãng S: F0,01 (3;15) = 5,42 < 8,845 có ý nghĩa; - bước pha lỗng D: F0,01(5;15) = 4,56 > 2,033 khơng có ý nghĩa; - tương tác: F0,01 (15;48) = 2,44 < 12,321 có ý nghĩa Giá trị "giữa dãy pha loãng S" cao cho thấy sai số hệ thống việc chuẩn bị dãy pha lỗng (tính đồng vật liệu mẫu, phân phối mẫu) tính không ổn định quần thể vi sinh vật Giá trị "tương tác" cao cho thấy mặt thống kê, có khác độ tuyến tính (hoặc phi tuyến tính) số đếm khuẩn lạc bốn dãy pha lỗng (xem Hình Hình 4) Điều khẳng định có sai sót thao tác kỹ thuật, cho thấy tương tác sinh học phát triển bất thường mà người đếm khuẩn lạc nhầm Trong trường hợp này, khơng có thơng tin giá trị chấp nhận "giữa bước pha loãng D" có tương tác đáng kể Kết cho biết khơng có sai số hệ thống việc chuẩn bị dung dịch pha loãng Phụ lục A (Tham khảo) Kiểm tra trung bình theo khối lượng mẫu thử tính đồng số đếm khuẩn lạc A.1 Giới thiệu Khi có sẵn số đếm khuẩn lạc từ đĩa cấy song song, từ thể tích huyền phù khác từ nhiều độ pha lỗng tốt sử dụng thông tin để ước lượng mật độ tốt Tính số khuẩn lạc trung bình Ngun tắc xuất lần đầu tài liệu vi sinh vật (xem Tài liệu tham khảo [2]) Thông thường đĩa có số đếm khuẩn lạc từ 30 đến 300 từ 25 đến 250 "đáng tin cậy" Nếu tuân thủ quy tắc thường cịn lại dung dịch pha lỗng có số khuẩn lạc đếm khơng cần tính số khuẩn lạc trung bình Tuy nhiên, lãng phí bỏ qua đĩa LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn 25 khuẩn lạc, đặc biệt đĩa có số khuẩn lạc thấp đáng tin cậy mặt sinh học Giới hạn dưới, trung bình khoảng khuẩn lạc đĩa giới hạn phù hợp mặt thống kê Số khuẩn lạc trung bình lý tưởng tổng số tất số đếm khuẩn lạc quan sát chia cho tổng thể tích mẫu liên quan (được biểu thị theo mẫu ban đầu) Cách biểu thị chung nguyên tắc chung sau: M = = (A.1) Trong đó: M số đếm khuẩn lạc trung bình mililit mẫu ban đầu; Ci số khuẩn lạc đếm đĩa thứ i; Vi thể tích sử dụng để đếm khuẩn lạc đĩa thứ I; i số đĩa sử dụng (i = 1, 2, …n); n tổng số đĩa sử dụng Để thu thập liệu với độ tin cậy thích hợp, trước hết cần kiểm tra xem khuẩn lạc đồng hay không (biến thiên ngẫu nhiên) Để làm điều này, số đồng chung cần thiết để kiểm tra số đếm khuẩn lạc có nguồn gốc từ V1, V2, …Vn có phải lấy từ huyền phù đồng hay không Phép thử tốt G2, mô tả A.2 Nếu phép thử cho thấy liệu khơng đồng khơng nên sử dụng tất số đếm khuẩn lạc để tính trung bình máy tính Đồng thời, kết dấu hiệu xem xét thêm lý khơng đồng Có hai thành phần cấu thành số đồng G2 việc đếm khuẩn lạc Nó sử dụng để xác nhận đồng liệu trước tính số khuẩn lạc trung bình áp dụng phân tích "độ lệch" để tìm khơng đồng liệu số đếm khuẩn lạc Trong tiêu chuẩn này, số G2 sử dụng để kiểm tra tính đồng chung, ngồi cịn để kiểm tra tính đồng chung việc đổ đĩa song song A.2 Phép thử G2 tính ngẫu nhiên (tính đồng nhất) Chỉ số G2 số đồng thích hợp để kiểm tra liệu đếm khuẩn lạc Chỉ số biểu thị dạng đơn giản là: G2n-1 = (A.2) Trong đó: Oi số đếm khuẩn lạc quan sát thứ i; Ei số đếm dự kiến thứ i; i số lần đếm (i = 1, 2, …n); n tổng số lần đếm Trong phép thử "tính đồng nội bộ", giả sử số đếm khuẩn lạc quan sát tuân thủ thể tích nghiên cứu Do đó, số đếm khuẩn lạc dự kiến Ei thu cách tính phần tổng tất khuẩn lạc quan sát mà lý thuyết thể tích phải chứa: Ei = ΣCi (A.3) Trong thực tế, công thức chung (A.2) bao gồm việc tính giá trị E i khơng cần dùng cho mục đích khác (trong trường hợp này, Cơng thức A.2 sử dụng ANOVA cần giá trị E i) Trong trường hợp đó, đưa số đếm dự kiến Công thức (A.3) cấu trúc lại cơng thức, thu dạng thích hợp hơn: G2n-1 = (A.4) Hiển nhiên kiểm tra tính đồng nội bộ, thể tích thực số đếm tỉ lệ với chúng thay Vi Trong hầu hết trường hợp, tỉ lệ lựa chọn theo cách cho thể LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn tích tương đối Ri số nguyên đơn Sự thay đổi khiến công thức trở nên đơn giản để tính tốn máy tính cầm tay G2n-1 = (A.5) Trong đó: Ci số khuẩn lạc đếm từ đĩa thứ i; Vi thể tích thực sử dụng cho đĩa thứ i; Ri thể tích tương đối tương ứng sử dụng đĩa thứ i; i số đĩa sử dụng (i = 1, 2, …, n); n tổng số đĩa sử dụng Các số có giá trị cao cho thấy biến thiên cao mức ngẫu nhiên, gọi phân tán rộng Các số có giá trị thấp cho thấy biến thiên thấp bất thường (phân tán hẹp) Có thể xem xét ý nghĩa thống kê phân tán rộng phân tán hẹp cách so sánh giá trị tính với phân bố x2 lý thuyết mức xác suất lựa chọn với n - bậc tự Các giá trị cần thiết ví dụ mơ Bảng A.1 Các tính tốn nêu cho số đồng chung GA2 sử dụng nội dung Chương trình BASIC để tính số đồng theo Cơng thức (A.5) nêu Phụ lục B Bảng A.1 - Các giá trị tới hạn lựa chọn cho phân bố X2 df Xác suất Phân tán hẹp Phân tán rộng 0,99 0,95 0,10 0,05 0,01 0,001 - 0,004 2,71 3,84 6,63 10,38 0,020 0,103 4,61 5,99 9,21 13,81 0,115 0,352 6,25 7,81 11,34 16,27 0,297 0,711 7,78 9,49 13,28 18,47 0,554 1,145 9,24 11,07 15,09 20,52 A.3 Sự phù hợp chung việc đổ đĩa song song Cách sử dụng thứ hai phép thử G2 tiêu chuẩn kiểm tra tính đồng việc đổ đĩa song song Có thể thực điều cách tính giá trị số đồng đĩa song song Việc đơn giản hóa thực tế tất thể tích (hoặc thể tích tương đối) đĩa cấy song song thay giá trị Do đó, tổng thể tích tương tổng số đĩa song song (n) Công thức (A.5) viết lại sau: G2n-1 = (A.6) Trong đó: Ci số khuẩn lạc đếm đĩa thứ i; i số đĩa sử dụng (i = 1, 2, …n); n số đĩa cấy song song Giá trị cứng số đồng sử dụng hạn chế Tuy nhiên, có m đĩa cấy với số lượng đĩa song song thấy ưu điểm việc bổ sung G Cộng giá trị G2 bậc tự tương ứng từ tất đĩa cấy để thu giá trị tính đồng chung Trong tiêu chuẩn này, đại lượng nêu gọi G P2: G2P = G2m(n-1) = (A.7) Một vài phân tán rộng phải nằm khoảng cho phép tính tốn phân tích vi sinh, phép đo thể tích phù hợp với chuẩn làm việc chấp nhận phép đo LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn khơng xác tuyệt đối Do đó, dường mức xác suất 1% (P = 0,01) thay cho mức 5% thông thường cần coi "giới hạn cảnh báo" A.4 Các ví dụ A.4.1.1 Ví dụ 1: Phép thử tính đồng chung Một số đếm khuẩn lạc thu từ hai độ pha loãng thập phân liên tiếp Chuẩn bị hai dãy đĩa song song từ độ pha loãng Các số đếm nêu Bảng 2, với thể tích tương đối Bảng A.2 - Đếm số khuẩn lạc hai dãy pha loãng song song thể tích tương đối Độ pha lỗng Các số đếm khuẩn lạc Tổng Thể tích tương đối Tổng 10-4 251 305 556 10 10 20 10-5 31 36 67 1 Tổng 623 22 Tính ngẫu nhiên tồn đĩa tính số G sau: G2 = 2[251•ln(251/10) + 305•ln(305/10) + 31•ln(31/1) + 36•ln(36/1) - 623•ln(623/22)] = 7,607 Khi có bốn số hạng tổng, có - = bậc tự Phải so sánh giá trị tính với giá trị hàng thứ ba phân bố Bảng A.1 Giá trị 7,607 tính cho thấy độ biến thiên cao so với phân bố lý thuyết (giá trị xác suất 1% = 7,81) tồn liệu xem phân bố ngẫu nhiên từ huyền phù đồng Tỉ số số đếm dung dịch pha loãng (556/67 = 8,3) khác nhiều so với giá trị lý tưởng 10 : 1, xuất tình cờ Khơng có lý thống kê thích hợp để coi liệu khơng đồng Do đó, số khuẩn lạc trung bình tính theo Cơng thức (A.1) sử dụng số đếm khuẩn lạc sẵn có A.4.1.2 Ví dụ 2: Phép thử tính đồng chung cách phân tích độ lệch Với liệu tương tự khác, có ba đĩa song song, có giá trị nêu Bảng A.3 Bảng A.3 - Số đếm khuẩn lạc ba dãy đĩa cấy song song thể tích tương đối Độ pha lỗng 10-5 10 Tổng -6 Các số đếm khuẩn lạc Tổng Thể tích tương đối Tổng 122 74 92 288 10 10 10 30 12 15 10 37 1 325 33 Bộ liệu dường phân tán rộng, số: G2 = 2[122•ln(122/10 + 74•ln(74/10)+ … + 10•ln(10/1) - 325•ln(325/33)] = 15,077 Giá trị gần giá trị xác suất 1% bậc tự Kết có nghĩa việc tính số khuẩn lạc trung bình dựa liệu tồn khơng thận trọng Do đó, cần phải kiểm tra trường hợp Công thức (A.3) sử dụng lặp lại để nghiên cứu chi tiết liệu Tổng biến thiên bao gồm ba thành phần: chênh lệch đĩa song song độ pha loãng 10 -5, chênh lệch đĩa song song độ pha loãng 10 -6 chênh lệch mức pha loãng: G(2)2 = 2[122•ln(122/10) + 74•ln(74/10) + 92•ln(92/10) - 288•ln(288/30)] = 12,127 G(2)2 = 2[12•ln12 + 15•ln15 + 10•ln10 - 37•ln(37/3)] = 1,020 G(1)2 = 2[288•ln(288/30) + 37•ln(37/3) - 325•ln(325/33)] = 1,930 Các số G2 biểu thị số bậc tự kèm theo Việc chia nhỏ tổng biến thiên dẫn đến phép phân tích độ lệch nêu Bảng A.4 Chú ý tổng 12,127 + 1,020 + 1,930 = 15,077 tổng số tính Bảng A.4 - Tổng biến thiên - Phân tích độ lệch LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Nguồn biến thiên Giữa độ pha loãng Độ pha loãng song song 10-5 Độ pha loãng song song 10 -6 Tổng G2 df P 1,930 > 0,10 1,020 > 0,30 12,127 > 0,01 15,077 < 0,02 Khi so sánh giá trị tính với phân số lý thuyết theo số bậc tự thích hợp, dường nguyên nhân đáng ý phân tán rộng liệu không đồng đĩa song song có số khuẩn lạc cao (ít pha lỗng hơn) Khơng nên sử dụng số đếm Điều có nghĩa nên tính giá trị trung bình từ số đếm khuẩn lạc thấp (độ pha loãng cao hơn) Do đó, khơng nên coi liệu bị thiếu hẳn cho dù liệu ban đầu không đồng A.4.1.3 Ví dụ 3: Tính đồng số đếm song song Cùng nhân viên thử nghiệm sử dụng đĩa kép để tạo nên số đếm khuẩn lạc Thực đánh giá thống đĩa song song Các số đếm ban đầu xếp theo giá trị số đếm trung bình tăng dần Bảng A.5 Đối với cặp số đếm, số đồng tính Công thức (A.6) Bảng A.5 - Cặp số đếm: số đồng Số Các số đếm song song G2 df 22 18 0,401 35 41 0,474 80 99 2,021 191 164 2,056 340 297 2,905 7,857 Tổng Tổng (7,857) số G riêng rẽ kiểu thống kê ứng dụng nội dung để tính thống chung việc đổ đĩa song song (GP2) Theo giá trị hàng thứ năm Bảng 5, phù hợp chung đĩa song song ví dụ dường thỏa mãn Có thể sử dụng liệu liệu tương tự theo cách khác Có thể so sánh số riêng rẽ với giá trị phân bố theo bậc tự tương ứng Tuy nhiên, với trường hợp xác định phù hợp nghi ngờ khơng cần ý q nhiều, G thay đổi ngẫu nhiên sinh giá trị độ lệch cách tình cờ Tuy nhiên, hàng chục hay hàng trăm giá trị số dựng biểu đồ kiểm sốt kết cho thơng tin hữu ích khơng cho người tiến hành phân tích mà cịn cho giới hạn tiến hành phương pháp Khi liệu đạt khóa đào tạo, dựng giá trị số riêng biệt theo thứ tự Thường có giá trị thông tin nhiều vẽ giá trị so với số đếm khuẩn lạc trung bình Thường xuyên có khuynh hướng giá trị số cao (phù hợp kém, phân tán rộng) số đếm trung bình tăng lên Xu hướng dường xuất ví dụ Cuối cùng, kết phải giới hạn (và giới hạn dưới) phương pháp người phân tích thực (các giá trị số dựng biểu đồ kiểm soát riêng rẽ) Phụ lục B (Tham khảo) Chương trình BASIC để tính số G2 10 PRINT "LIKELIHOOD RATIO-INDEX G^2" 20 INPUT "NUMBER OF TERMS, n-"; N 30 C = 0; R = 0; S = 0; T = 0; D = 40 FOR I=1 TO N LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn 10 PRINT "LIKELIHOOD RATIO-INDEX G^2" 50 PRINT "/=";/ 60 INPUT "COLONY COUNT="; C 70 INPUT "RELATIVE VOLUME ="; R 80 IF (C=0) THEN W = 0: GOTO 100 90 W = C*LOG(C/R) 91 REM IN THIS BASIC LOG = NATURAL LOGARITHM 100 S=S+W 110 T=T+R 120 D=D+C 130 NEXT / 140 Y = * (S - D*LOG(D/T) 150 REM IN THIS BASIC LOG = NATURAL LOGARITHM 160 PRINT 170 PRINT "INDEX G^2="; Y 180 PRINT 190 PRINT 200 INPUT "ANOTHER SET?(Y/N)"; H$ 210 IF H$ = Y" GOTO 20, ELSE TO 220 220 END THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu [2] FARMILOE, F.J., CORNFORD, S.J., COPPOCK, J.B.M and INGRAM, M The survival of Bacillus subtilis spores in the baking of bread J Sci Food Agric., 5, 1954, pp 294-404 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162