PHƯƠNG PHÁP QUẢN LÝ MẪU BỆNH THỰC VẬT

PHƯƠNG PHÁP QUẢN LÝ MẪU BỆNH THỰC VẬT “Mọi tài liệu ghi chép kiểm tra lại mảnh giấy vụn mà thơi” R.W.G Dennis, theo British Ascomycetes (1968), J Cramer, Lehre, Germany ii LỜI CẢM ƠN Chúng xin chuyển lời cảm ơn sâu sắc tới TS John Alcorn, người hiệu đính sách Xin cảm ơn Tổ chức hỗ trợ phát triển Quốc tế Australia (AusAID) cung cấ p nguồn kinh phí quý báu cho việc đời xuất sách Xin giành lời cảm ơn đặc biệt cho ơng Eli Szandala, Vă n phịng chuyên viên bảo vệ thực vật cao cấp, Bộ Nông nghiệp, Thủy sản Lâm nghiệp Australia điều hành chương trình xuất sách Cuốn sách mô tả nhiều phương pháp thảo luận thành viên tham gia hội thảo tổ chức Chiang Mai, Thái Lan ngày 20 tháng 11 năm 2004 Chúng xin cảm ơn TS Srisuk Poonpolgul (Bangkok, Thái Lan), bà Srisurang Likhitekaraj (Bangkok, Thái Lan), TS Pornpimon Athipunyakom (Bangkok, Thái Lan), ông Woothisak Butranu (Bangkok, Thái Lan), TS Kartini Kramadibrata (Bogor, Indonesia), TS Lee Su See (Kepong, Malaysia), TS Hien Thuy Phan (Hà Nội, Việt Nam) ơng Eli Szandala (Canberra, Australia) đóng góp q báu cho thành công sách Các tác giả TS Roger Shivas TS Dean Beasley, Bảo tàng bệnh cây, Sở Nông nghiệp Thủy sản Queensland, Australia Các tác giả tham gia TS John Thomas TS Andrew Geering, Khoa virus học, Sở Nông nghiệp Thủy sản Queensland, Australia TS Ian Riley, Chuyên gia tuyến trùng học, Trường Đại học Adelaide, Bang Nam Australia, Australia © Commonwealth, Australia 2005 Cuốn cẩ m nang ‘Phươ ng pháp quản lý mẫ u bệnh thực vật’ đượ c đảm bảo quyền tác giả Tuy nhiên, bạn tải xuống, in chép cho việc s dụng riêng, khơng mục đích thương mại hoặ c sử dụng phạm vi quan Ngồi mục đích sử dụng phép phạm vi quy định Luật quyền năm 1968, tất quyền tác giả khác đảm bảo ISBN 0-9751686-9-X iii BẢNG CHỮ VIẾT TẮT AMV ACIAR ASEAN ASEANET AusAID BO BRIP DAFF DAR DNA ELISA FAO GA GBIF GPS KBA ICTV IJSB IJSEM IMI IPPC ISPM LNYV MEA MTA NA NSW OCPPO PCR PDA PEMV PRA PRSV QDPIF RIRDC RNA SEM SPA SPS SCBV SWG TMV TSWV TWA UV VIDE WFCC WTO Virus khảm linh lăng Trung tâm nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia Hiệp hội Quốc gia Đông Nam Á Hội thiết lập điều hành mạng lưới khu vực Đông Nam Á Tổ chức hỗ trợ phát triển Quốc tế Australia Bảo tàng Bogoriense Bảo tàng bệnh Queensland Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp Thủy sản Bảo tàng bệnh New South Wales Deoxyribonucleic Acid Kỹ thuật miễn dịch liên kết men Tổ chức lương thực Liên Hợp Quốc Glycerol Agar Phương tiện thơng tin đa dạng sinh học tồn cầu Hệ thống định vị toàn cầu King’s B Agar Ủy ban Quốc tế phân loại virus Tạp chí Quốc tế phân loại học vi khuẩn Tạp chí Quốc tế tiến hóa phân loại vi sinh vật học CABI Bioscience, UK Centre Công ước Quốc tế bảo vệ thực vật Tiêu chuẩn Quốc tế kiểm dich động thực vật Virus đốm vàng hoại sinh rau diếp Malt Extract Agar Văn thỏa thuận chuyển giao mẫu Nutrient Agar New South Wales Văn phòng chuyên viên bảo vệ thực vật cao cấp Phản ứng trùng hợp chuỗi Khoai tây - đường – Agar Virus khảm biến dạng đậu Đánh giá nguy dịch hại Virus đốm vịng đu đủ Sở Nơng nghiệp Thủy sản Queensland Tổ chức nghiên cứu phát triển nông thôn Ribonucleic Acid Kính hiển vi điện tử quét Sucrose Peptone Agar Kiểm dịch động thực vật Virus hình que hại mía Cân trọng lượng tiêu chuẩn Virus khảm thuốc Virus đốm héo cà chua Môi trường agar - nước máy Tia cực tím Cơ sở liệu trao đổi thông tin giám định virus Hiệp hội lưu giữ mẫu vi sinh vật Thế giới Tổ chức thương mại Thế giới iv LỜI TỰA Cuốn cẩm nang quản lý mẫu bệnh thực vật Bộ Nông nghiệp, Thủy sản Lâm nghiệp Australia tài trợ thực Cuốn sách đời với mục đích cung cấp tài liệu tham khảo cho nước khu vực nhằ m xây dựng danh mục dịch hại từ tiêu bả n mẫu bệnh thu được, đáp ứng nhu cầu thương mại Quốc tế hàng hóa nơng nghiệp Sự thành lập tổ chức thương mạ i Thế giới (WTO) nă m 1995 tiền đề cho đời kỷ nguyên tự thương mại Hiệp định WTO việc áp dụng biện pháp kiểm dịch động thực vật (Hiệp định SPS) thúc đẩy phát triển thươ ng mạ i hóa nơng sản, mục tiêu bị lãng quên số nước phát triển Ở nhiều nước giới, sưu tập sâu bệnh hại nghèo nàn dẫn đến hạn chế việc mơ t ả tình trạng lành mạnh nông nghi ệp lâm nghi ệp nước Đó nguyên nhân khiến nhiều tổ chức bả o vệ thực vật Quốc gia thực cơng tác phân tích nguy dịch hạ i cách đầy đủ tin cậy Tình trạng tiếp di ễn bất lợi lớ n cho nước phát triển khu vực việc đàm phán để mở rộng thị trường cho hàng nông sản Theo ều khoản hiệp định SPS, nước phát triển chấp thuậ n trợ giúp chuyên môn cho nước phát triển thành viên để phát triển kỹ có liên quan đến hiệ p định SPS đáp ứng điều kiện mà Hiệp định SPS đề Australia đóng góp trách nhiệm bằ ng nhiều cách khác thơng qua chương trình trợ giúp song phương khu vực, với nguồn vốn tài trợ Tổ chức hỗ trợ phát triển Quốc tế Australia (AusAID) Các hoạt động trợ giúp tiến hành nhiề u lĩnh vực, có việc xây dựng danh mục dịch hại sở mẫu tiêu Văn phòng chuyên viên bảo vệ thực vật cao cấ p thuộc Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp Thủy sản Australia đảm nhận công việc này, đối tượng nhận giúp đỡ chương trình nước khu vực Đơng Nam Á Chương trình trọng đến việc xây dựng lực nhà khoa học năm lĩnh vực sau: ¾ Điều tra dịch hại thực vật ¾ Chẩn đoán ¾ Bảo quản mẫu ¾ Phụ trách quản lý sưu tập mẫu Quản lý liệu Cuốn cẩm nang tóm tắt lại phương pháp kỹ thuật thường sử dụng tất c ả vấn đề bệnh cây, bao gồm thông tin bệnh hại có tầm quan trọng kinh tế, phương pháp thu thập mẫu bệnh đồng ruộng, phương pháp nuôi cấy môi trường nhân tạo, phương pháp phân lập, bảo quản mẫu thông tin, mẹo nhỏ vi ệc quản lý tiêu mẫu bệnh mẫu vi sinh vậ t hại Để đáp ứng nhu c ầu sử dụng rộng rãi, cẩm nang dịch sang tiếng Việt, tiếng Thái tiếng Bahasa ¾ Lois Ransom Chuyên viên bảo vệ thực vật cao cấp Bộ Nông nghiệp, Thủy sản Lâm nghiệp Australia MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN III BẢNG CHỮ VIẾT TẮT IV LỜI TỰA MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU U 1.1 Những trách nhiệm mang tính tồn cầu 1.2 Tình trạng lưu giữ mẫu sinh học nước ASEAN 1.3 TẦm quan trọng việc lưu giữ hồ sơ tiêu 1.4 Xây dựng phát triển công tác lưu giữ mẫu bệnh nước ASEAN LƯU GIỮ MẪU BỆNH HẠI THỰC VẬT 10 2.1 Bảo tàng mẫu 10 2.2 Bộ sưu tập vi sinh vật 10 2.3 Xây dựng mẫu bệnh 11 2.4 Danh mục dịch hại 12 XÂY DỰNG BỘ SƯU TẬP MẪU BỆNH 15 3.1 Nguồn mẫu 15 3.2 Thu thập mẫu bệnh đồng ruộng 15 3.3 Thu thập xử lý mẫu bệnh 17 3.3.1 Đối với lá, thân 18 3.3.2 Đối với rễ đất 19 3.3.3 Đối với nấm lớn 20 3.4 Cách ghi phiếu điều tra mẫu bệnh 21 3.5 Điều tra lấy mẫu 22 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA MẪU BỆNH 24 4.1 Nhuộm màu nấm vi khuẩn 24 4.2 Kính hiển vi quang học 26 4.3 Chụp ảnh mẫu 27 4.3.1 Cách quản lý đặt tên file ảnh 27 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP NẤM, VI KHUẨN VÀ TUYẾN TRÙNG TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM 29 5.1 Phân lập nấm 5.1.1 Buồng giữ ẩm 30 31 5.1.2 Phương pháp pha loãng 32 5.1.3 Phát triển sản sinh bào tử 32 5.2 5.3 Phân lập vi khuẩn Phân lập tuyến trùng 34 35 5.3.1 Mẫu đất 36 5.3.2 Mẫu bệnh 38 5.3.3 Bảo quản làm tiêu 39 5.4 Môi trường nuôi cấy CÁCH BẢO QUẢN VÀ LƯU GIỮ MẪU BỆNH 6.1 Tiêu mẫu bệnh 40 44 44 6.1.1 Tiêu khô 44 6.1.2 Tiêu chuẩn 46 6.1.3 Mẫu vi sinh vật khơ 47 6.1.4 Tiêu lam 47 6.1.5 Đóng gói vận chuyển tiêu 48 6.2 Mẫu vi sinh vật phân lập 48 6.2.1 Nuôi cấy mơi trường agar 49 6.2.2 Bảo quản dầu khống 49 6.2.3 Bảo quản nước vô trùng 50 6.2.4 Bảo quản đông khô 50 6.2.5 Bảo quản đất 50 6.2.6 Bảo quản silica gel 50 6.2.7 Bảo quản giấy thấm 51 6.2.8 Bảo quản lạnh sâu 51 6.2.9 Bảo quản nitơ lỏng 51 GIÁM ĐỊNH VI SINH VẬT GÂY HẠI 7.1 Nấm 52 52 7.1.1 Nấm gây bệnh rễ 53 7.1.2 Nấm gây bệnh thân 53 7.1.3 Nấm gây bệnh 54 7.1.4 Nấm gây bệnh hạt 56 7.1.5 Nấm gỉ sắt 56 7.1.6 Nấm than đen 58 7.2 7.3 Vi khuẩn Phytoplasma 59 61 7.4 Virus viroid 61 7.4.1 Các lồi virus thơng tin lưu giữ 62 7.4.2 Triệu chứng bệnh virus thực vật 63 7.5 Tuyến trùng 66 7.5.1 Những yêu cầu giám định 67 7.5.2 Nhận dạng tuyến trùng ký sinh thực vật 67 7.5.3 Giám định đến loài 68 7.6 Các kỹ thuật phân loại 69 7.6.1 Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy - SEM) 69 7.6.2 Kỹ thuật hóa sinh phân tử 69 7.6.3 Huyết (miễn dịch) 69 7.6.4 Kỹ thuật nucleic axit 70 QUẢN LÝ HỒ SƠ MẪU BỆNH 8.1 71 Hệ thống sở liệu (Database) 71 QUẢN LÝ BỘ SƯU TẬP MẪU 73 U 9.1 Điều kiện phòng mẫu 73 9.2 Phòng trừ cánh cứng hại tiêu mẫu 73 9.3 Phòng trừ nhện hại mẫu vi sinh vật 74 9.4 Cho mượn mẫu 75 9.5 Bảo đảm an toàn cho mẫu bệnh 76 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHỌN LỌC 78 DANH MỤC HÌNH Hình Trang thiết bị cần thiết cho việc xây dựng phòng tiêu mẫu vi sinh vật 11 Hình Nguồn thơng tin giúp cho việc xây dựng danh mục dịch hại xếp theo thứ tự tin cậy 12 Hình Ví dụ danh mục dịch hại đu đủ .12 Hình Thơng tin cần thiết cho hồ sơ dịch hại, xây dựng dựa ISPM 14 Hình Dụng cụ thường dùng để lấy mẫu bệnh 17 Hình Lọ làm khơ mẫu nghi ngờ nhiễm virus 19 Hình Ví dụ nhãn lấy mẫu sử dụng phòng lưu giữ mẫu bệnh BRIP .22 Hình Mặt cắt nghiêng buồng để mẫu nấm phân lập có ‘ánh sáng đen’ 33 Hình Cách vạch phân lập vi khuẩn mặt agar 35 Hình 10 Khay Whitehead dùng để tách tuyến trùng từ đất 37 Hình 11 Dùng phễu Baermann để tách tuyến trùng từ đất bệnh 37 Hình 12 Tách tuyến trùng từ mơ bệnh phương pháp phun sương 39 Hình 13 Ví dụ nhãn dán gói tiêu sử dụng phòng tiêu BRIP 45 Hình 14 Các gói tiêu Bảo tàng mẫu bệnh Ustilaginales Vánky (HUV) Bảo tàng bệnh QDPI&F (BRIP) 48 Hình 15 Triệu chứng bệnh virus (từ trái qua phải): vòng biến mầu, đốm vịng khảm 65 Hình 16 Hình thái mặt trước số nhóm tuyến trùng .68 Hình 17 Mơđun Catalogue KE EMu database 71 Hình 18 Địa Internet trang chủ hai database phân loại tin cậy 72 Hình 19 Vết bị nhện giọt nước đọng nắp đĩa Petri 75 DANH MỤC BẢNG Bảng Một số triệu chứng bệnh thường gặp .16 MỞ ĐẦU Tầm quan trọng vi ệc lưu giữ tiêu sinh vật, bao gồm mẫu thực vậ t bị bệnh vi sinh vật gây bệnh nói đến hàng loạt báo tạp chí khoa học Trong có nhan đề Trách nhiệ m t ương hỗ phân loại nấm học bệnh cây, Walker (1975) trích dẫn 18 tài liệu tham khảo tác gi ả nhấn mạnh t ầm quan trọng phân loại học sinh học ứng dụng tầm quan trọng công tác phân loại nấm, bao gồm nấm học nói chung bệnh nói riêng Những báo có ảnh hưởng t ới việc trợ giúp phát triể n bảo tàng bệnh hại phân loại học hay khơng? Câu trả lời có lẽ “không”, lấy dẫn chứng từ thực tế Australia, hầu hết bảo tàng mẫu bệnh Australia quan Chính quyền bang tài trợ Nguyên nhân tạ i ph ủ lại lưỡng lự việc đầu tư vào bảo tàng (phòng) tiêu sinh học chúng tả ng cho nghiên cứu phân loại vấn đề gây tranh cãi Có lẽ vấn đề chỗ nhà phân loại học không ý đến nhu cầu người có khả sử dụng chúng… nhiều nhà phân loại học thường không nghĩ đế n nhu cầu công việc nhà sinh học ứng dụng có nhà bệnh cây, chí số cịn có xu hướng tách khỏi lĩnh vực nghiên c ứu thực hành sinh học rộng lớn (Walker, 1975) Cùng với đời Tổ chức thương mại giới năm 1995 điều luật c tổ chức áp dụng cho hàng hóa nơng nghiệp, tình trạng s ức khỏe trồng trở thành vấn đề trị thương mại lớn Chịu áp lực từ nhiều thành phần khác nhau, Quốc gia phải sử dụng điều khoản Hiệp định kiểm dịch động thực vật (Hiệp đị nh SPS) để tối đa hóa lợi cạ nh tranh – hay nói cách khác để thúc đẩy mở c ửa thị trường trước bị đóng lạ i nghi ngờ vấn đề kiểm dịch loại trừ việc nhập hàng hóa có nguy ảnh hưởng xấ u tới ngành sản xuất nông nghiệp nước Dựa sở khoa học đánh giá nguy dịch hại, Hiệp định SPS đưa điều kiện để bảo vệ ngành sả n xuất nông nghiệ p trước xâm nhập c dị ch hại từ vào, đồng thời tạo điều kiện cho phát triển thương mại hóa nơng sản Hiệp định SPS cho phép thành viên quản lý thương mại hàng hóa nơng nghiệp dựa tình trạng sức khỏe tr ồng an toàn thực phẩm Tuy nhiên giới hạn đề phải rõ ràng phải có chứng kỹ thuật 1.1 NHỮNG TRÁCH NHIỆM MANG TÍNH TỒN CẦU Cơng ước Quốc tế bảo vệ thực vật (IPPC) Hiệp định SPS quy định: nước xuấ t phải có trách nhiệm cung cấp cho nước nhập danh mục dịch hại có khả theo hàng xuất Cụ thể sau: ¾ IPPC quy định nước có hàng hóa xuất phải cung cấp thơng số kỹ thuật sinh học hợp lệ cần thiết cho việc đánh giá nguy dịch hại để 1Biện pháp kiểm dịch động thực vật (trong hiệp định SPS) tiêu chuẩn quy định Quốc gia vấn đề như: lẫn tạp vi sinh vật, độc tố, kim loại nặng, tàn dư thuốc bảo vệ thực vật thực phẩm, sinh vật hại, cỏ dại 2Định nghĩa ‘dịch hại’ sử dụng để động vật chân đốt, vi sinh vật tuyến trùng gây hại cho thực vật sản phẩm thực vật phương pháp DNA hóa học giám định tuyến trùng địi hỏi phả i có trang thiết bị đại mặt khác lại giả m cần thiết phải có nhà phân loại có kỹ giám định tuyến trùng hàng ngày 7.6 CÁC KỸ THUẬT PHÂN LOẠI 7.6.1 Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy - SEM) Khơng giống kính hiể n vi quang học s dụng ánh sáng để quan sát mẫu, kính hiển vi ện tử quét (SEM) dùng điện tử để tạo hình ả nh c mẫu vật SEM có độ phân giải lớn nhiều lần so với kính hiển vi quang học điện t có bước sóng nhỏ 100.000 l ần so với bướ c sóng ánh sáng SEM có ích việc nghiên cứu cấu trúc bên bào tử nấm Độ phân giải tốt kính hiển vi quang học 0,2 µm hay 200 nm Độ phân giải SEM đạt tới - nm, tốt 100 lần so với kính hiển vi quang học Kính hiể n vi điện tử quét cung cấp hình ả nh bề mặt chi tiế t, rõ nét có chiều sâu kính hiển vi quang học, điều có nghĩa lúc quan sát nhiều mẫu SEM dùng chùm điện tử để quét bề mặt mẫu vật, tạ o hình ảnh khơng gian ba chi ều mẫ u vậ t Các ện t có kích thước nhỏ dễ dàng lệch hướng tác động phân tử khí khơng khí Vì vậy, để điệ n tử tiếp cận mẫu vậ t, hệ thống ống bắn điện tử buồng mẫu vật bảo quản môi trường chân không Để giữ nguyên vẹn cấu trúc mẫu sinh học điều kiện chân không, phải làm khô mẫu cẩ n thận carbon dioxide (CO2) lỏng hệ thống máy gọi máy làm khô tới hạn (critical point dryer) Thông thường, mẫu cố định mẩu kim loại (thanh gá mẫu) dùng băng dính mặt đặ c biệt, sau tiêu mạ lớp kim loại mỏng, ví dụ vàng để kích thích tính dẫ n điện Bào tử nấm gỉ sắt than đen có thành dày khơng cần phải làm khơ tới hạn mạ kim loại sau mẫu cố định gá mẫu 7.6.2 Kỹ thuật hóa sinh phân tử Nếu khơng thấy triệu chứng bệnh xuất hiệ n khơng có nghĩa hồn tồn bệnh Trong trường hợp đó, nhà bệnh nên sử dụng biện pháp kỹ thuật phân tử hóa sinh để phát vi sinh vật Indexing khái niệm dùng để quy trình sử dụng để kiể m tra có mặt vi sinh vật biết đến, đặc biệt virus ký sinh thực vật Indexing giúp thực nhanh biện pháp phòng trừ hạn chế khả phát dịch Indexing quan trọng việc thực kiểm dịch để hạn chế xâm nh ập c bệnh ngoại lai hệ thống chứng sản xuất giống nhân giống bệnh 7.6.3 Huyết (miễn dịch) Trong kỹ thuậ t huyết thanh, kháng thể đặc hiệu tạo (nhờ có mặt kháng nguyên sản sinh từ vi sinh vật hại) khai thác cho mục đích chẩn đốn 69 Các kháng thể bao gồm kháng thể đa dòng polyclonal (hỗn hợp kháng thể sản xuất từ hệ miễn dị ch động vật sau tiêm chất tiế t vi sinh vậ t vào máu động vật) kháng thể đơn dòng (tế bào tủy spleen sản sinh loạ i kháng thể từ hệ miễn dịch động vật nhân vô tính ni cấy mơ tế bào) Một phương pháp chẩn đoán huyết phổ biến kỹ thuật miễn dịch liên kế t men (enzyme linked immunosorbent assay - ELISA) Kháng thể đặt vào giếng đĩa microtitre Dung dịch kiểm tra đượ c nhỏ vào giếng, kháng nguyên có mặt chúng tương tác với kháng thể Rửa s ạch giếng, đặt enzyme tiếp hợp kháng thể vào giếng rửa lại lần nữa, sau cho giá thể enzyme vào Nếu kháng nguyên có mẫu, tổ hợp kháng thể - enzyme làm biến đổi màu giá thể Chẩn đoán bệ nh ph ương pháp huyết có nhiều ưu điểm Mặc dù sản xuất kháng thể đòi hỏi thời gian vài tuần bảo quản phươ ng pháp kháng thể trì trạng thái ổn định thời gian dài cho kết nhanh chóng Phương pháp huyết áp dụng phịng thí nghiệm ngồi đồng ruộng 7.6.4 Kỹ thuật nucleic axit Các vi sinh vật chúng có nhi ều kiểu gen nhìn chung, gen có chức đơn vị phân loại (taxon) khác có trình tự chuỗi xếp chuỗi DNA khác Sự sai khác khai thác giám định kỹ thuật phân t như: lai nucleic axit phản ứng trùng hợp chuỗi (PCR) Các kỹ thuật phân tử phân tích nucleic axit nhạy cảm đến mức mà điều kiện lý tưởng, lượng DNA phát đến picogram Một chuỗi phản ứng PCR điển hình liên quan đến q trình làm nóng DNA, enzyme DNA polymerase, đoạn mồi (DNA primers) dNTP dung dị ch đệm tới nhiệt độ 90°C để làm biến tính DNA, sau làm lạnh tới khoảng 50-60°C để gắn đoạn mồi (primers) vào chuỗi DNA đơn sau t ăng nhiệ t độ lên 72°C, nhi ệt độ tối thích cho phả n ứng trùng hợp gắ n chuỗi DNA bổ sung vào nhau, vị trí đoạn mồi Cứ sau vịng biến tính, gắn mồi trùng hợp, lượng DNA lại nhân đơi Sau 30 vịng nhân lên theo cấp số mũ, lượng DNA tăng nhiều đến mức nhìn thấy agarose sau nhuộm ethidium bromide Kỹ thuậ t nucleic acid áp dụng cho giám định có lợ i nhanh nhạy vượt xa phương pháp huyết Nhược điểm phương pháp phải có trang thiết bị, hóa chất đắt tiền, khơng tiến hành với nhi ều mẫu lúc phương pháp huyết nhạy cảm đồng nghĩa với việc mẫu bị tạp kết bị sai nghiêm trọng 70 8.1 QUẢN LÝ HỒ SƠ MẪU BỆNH HỆ THỐNG CƠ SỞ DỮ LIỆU (DATABASE) Việc nhập thông tin hồ sơ bệnh vào hệ thống c sở liệu (database) điệ n tử quan trọng nhờ có hệ thống này, cán phịng mẫu tiếp cận thông tin cách nhanh nhấ t mà không cần phải lục tìm đống tài li ệu Số liệu xếp có hệ thống nên dễ dàng tìm kiếm, khơi phục, xử lý cập nhật cần thiết Thông tin lưu giữ database sử dụng để tạo đồ phân b ố vi sinh vật hại, quan trọng công tác kiểm dịch đánh giá nguy dịch hại Một database đơn giản bảng biểu xây dựng từ phần mềm Microsoft Excel, chương trình sở liệu phức tạp Microsoft Access, Oracle, BioLink KE EMu Những chương trình cho phép quản lý hình ảnh kỹ thuật số đồng thời có cơng cụ cho phép việc trao đổi thơng tin cách nhanh chóng Hệ thống Database KE EMu (Hình 17) nói vơ giá cho phép người sử dụng tìm kiếm thay đổi Điều đặc biệt có ích người sử dụng muốn thay đổi thông số tìm kiếm tên vi sinh vật hại tên ký chủ Hình 17 Mơđun Catalogue KE EMu database Database khơng l ưu giữ hình ảnh kỹ thuật số mà phương tiện khác như: file văn bản, file PDF, html phim video Ngồi ra, database cịn cho phép lưu giữ thơng tin chi tiết người lấy mẫu, người giám định, người trồng cây, ví dụ 71 địa chỉ, số ện thoại, số fax, email, tiểu s ử, tài liệ u tham khảo Database cịn giúp nhân viên phòng mẫu lên lịch, đặt cho số công việc định Người nhập thông tin vào database phải bả o đảm thông tin lưu giữ database xác Hiện có nhiều database phân loại sẵn có mạng Internet (Hình 18) www.indexfungorum.org - CABI Bioscience Database of Fungal Names www.ipni.org - The International Plant Names Index Hình 18 Địa Internet trang chủ hai database phân loại tin cậy Trong phạm vi Quốc gia, database phòng mẫu bệnh phân bố rải rác địa điểm khác kết nối với qua hệ thống mạng để tạo thành bảo tàng mẫu ảo Ví dụ: Database dịch hại thực vật Australia Australian Plant Pest Database (APPD, http://appd.cmis.csiro.au/) hệ thống sở liệu dịch hại trồng ảo, mang tính Quốc gia APPD hợp hồ sơ mẫu dịch hại từ điểm nút khác phân bố toàn lãnh thổ Australia, tạo điều kiện cho việc tìm vị trí mẫu dịch hại cách nhanh chóng tìm kiếm thơng tin cách hiệu Trên phạm vi toàn cầu, Nguồn thơng tin đa dạng sinh học tồn cầu - Global Biodiversity Information Facility (GBIF, http://www.gbif.org/) có hệ thống database xây dựng với mục đích đưa thơng tin chủ yế u đa dạng sinh học giới lên mạng internet cho tất người GBIF sử dụng cổng để truy cậ p vào số databases vi sinh vật hại vấn đề có liên quan đến đa dạng sinh học toàn cầu 72 9.1 QUẢN LÝ BỘ SƯU TẬP MẪU ĐIỀU KIỆN PHỊNG MẪU Một phịng mẫu bệnh phải có vị trí an tồn vĩnh cửu để lưu giữ mẫu Phòng để mẫu phải có khả chống trùng, chống cháy chống mưa dột Một phòng mẫu bệ nh thực vật lớn vừa phải (lưu giữ khoảng 50.000 mẫu) cần sử dụng diện tích t ối thiểu m2, đặ c biệ t sử dụng tủ nhiều ngăn để xếp mẫu tiêu Giá tủ để tiêu kim loại có khả chống trùng làm gỗ Phịng giữ mẫu nên có hệ thống điều khiển nhiệt độ (20-23°C) độ ẩm (40-60%) khơng khí Trong điều kiện nhiệ t độ độ ẩm vậ y hạn chế s ự phá hủy c côn trùng hại, đặc biệt kết hợp với biện pháp đặt mẫu vào tủ đá trước lưu giữ phòng mẫu Nên sử dụng máy điề u hịa khơng khí để điều khiển nhiệt độ dùng máy hút ẩm để giả m độ ẩm Ln ln đóng cửa vào cửa sổ để ngăn ngừa côn trùng xâm nhập Dùng rèm che cửa sổ để tránh ánh nắng mặt trời 9.2 PHÒNG TRỪ BỘ CÁNH CỨNG HẠI TIÊU BẢN MẪU Ở khu vực nhiệt đới, nhiệt độ ẩm độ cao phù hợp với phát triển côn trùng phá hại Một số côn trùng, đặc biệt bọ cánh cứng, thường ăn mẫu tiêu khô nhanh chóng phá hủy sưu tập mẫu Để khắc phục tình trạng nên đặt mẫu bệnh vào tủ lạnh sâu -20°C thấp ngày để diệt hết nguồn sâu hại Các mẫu bảo quản phòng nên luân phiên đặt vào tủ lạnh sâu khoảng thời gian định Trước mẫu đưa vào tủ lạnh sâu, nên gói mẫu túi nilon hộp xốp đậy nắp chặt để tránh đọng nước mẫu Sau lấy từ tủ lạnh sâu, để mẫu phòng có điều hịa thời gian mẫu đạt đến nhiệt độ phòng bảo quản mẫu Mẫ u bệ nh tươi thường chuyển đến phòng mẫ u để giám định Không nên giữ mẫu tươ i gần phòng bảo quản mẫu mà nên kiểm tra mẫu khu vực xa phòng bả o quản mẫ u Tấ t mẫu bệnh lấy cho mượn để kiểm tra phải để vào tủ lạnh sâu ngày trước đặt trở lại vào vị trí cũ phịng mẫu Nhiều phịng mẫ u bệ nh có ng ười chun trách việ c xơng phịng mẫu năm lần hóa chất khử trùng phép lưu hành, ví dụ methyl bromide, carbon bisulphide, carbon tetrachloride, ethylene dichloride, hydrocyanic gas, lindane, dichlorvos strips paradichlorobenzene Phải ý làm việc với chất khử trùng chúng có hại cho sức khỏe người thườ ng dễ cháy Tuy nhiên, khử trùng xơng hơ i khơng thơi chưa đủ để phịng trừ trùng biện pháp thường khơng hiệu trứng côn trùng nhện 73 9.3 PHÒNG TRỪ NHỆN HẠI MẪU VI SINH VẬT Vấn đề nhện ăn nấm phân lập môi trường nhân tạo vấn đề phổ biến nguy hiể m phòng mẫu vi sinh vật Nh ện xâm nhập vào phịng thí nghiệm thơng qua mẫu bệnh tươi, giày dép, quần áo, côn trùng mẫu vi sinh vật phân lập từ phịng thí nghiệm khác Chúng phát triển mạnh điều kiện nhiệt đới Không ăn mẫu vi sinh vật phân lập, nhện mang bào tử nấm vi khuẩn ruột,trên thể lây nhiễm sang mẫu khác Nếu khơng phát sớ m, nhện gây h ọa lớn phịng thí nghiệ m chúng có khả phát triển nhanh, di chuyển từ đĩa cấy sang đĩa cấy khác tủ bàn để mẫu cấ y Nếu nhìn kỹ đĩa cấy mắt thường, phát nhện dạng chấm trắng nhỏ bề mặ t môi trường Thông thường, nhện đượ c phát qua vết bị chúng để lại mơi trườ ng nấm vi khuẩn qua vết bò chúng để l ại giọt nướ c đọng nắ p đĩa Petri (Hình 19) Khi phát nhện mắt thường nhện bùng phát Chú ý ngăn ngừa xuất nhện, không nên để đến nhện bùng phát tìm cách diệt trừ Có thể phịng nhện sau: ¾ Kiểm tra tất mẫu vi sinh vật chuyển đến phịng thí nghiệm xem có nhện hay khơng Nếu muốn giữ mẫu vi sinh vật, nên cấy truyền bỏ mẫu ban đầu vào nồi hấp diệt trùng để diệt hết nguồn nhện tiềm tàng; ¾ Đặt đĩa cấy đĩa cấy phân lập ban đầu vào hai tủ giá để khác nhau; ¾ Hấp tiệt trùng mẫu phân lập cũ mẫu bệnh sau sử dụng sớm tốt; ¾ Thường xuyên lau mặt bàn phòng mẫu cồn 70% lau bàn thí nghiệm mặt tủ để mẫu cấy thuốc diệt côn trùng không gây hại cho nấm; ¾ Bọc đĩa cấy parafin nilon siêu mỏng, nhiên cách hạn chế phần cuối nhện xâm nhập vào đĩa cấy bọc; ¾ Loại bỏ tất mẫu vi sinh vật bị nhiễm nhện cách hấp tiệt trùng Nếu mẫu vi sinh vật có giá trị khơng có mẫu thay để mẫu vào tủ lạnh sâu 24 để diệt hết nhện trưởng thành trứng Sau cấy truyền vi sinh vật lên mơi trường hủy bỏ mẫu cũ Một số loài nấm khơng thể sống sót sau để lạnh 74 Hình 19 9.4 Vết bị nhện giọt nước đọng nắp đĩa Petri CHO MƯỢN MẪU Các mẫu bệnh lưu gi ữ cho mượn thời gian ngắn cho mục đích nghiên cứu khoa học Tuy nhiên, cần phải đề quy định người mượn để bảo đảm an toàn mẫ u bệ nh T ốt cho phòng mẫu bệnh khác mượn mẫu với điều kiện họ phải bảo đảm an toàn cho mẫu vận chuyể n làm việc với mẫu Người lưu giữ mẫ u có quyền định khơng cho mượ n mẫu xem xét thấy vi ệc sử dụng mẫu không cần thiết, không phù hợp v ới mục đích nghiên cứu cảm thấy mẫu bị sử dụng không chỗ hay bị hỏng Mẫu chuyển nước số trường hợp phải qua xử lý kiểm dịch đến nơi Phương pháp xử lý nhiệt, xơng xử lý tia phóng xạ gamma Các phương pháp xử lý làm hỏng mẫ u tác động đế n cấu trúc DNA vi sinh vật Vì vậy, người lưu giữ mẫu phả i có trách nhiệm áp dụng biện pháp để bảo đả m mẫu cho mượn giữ điều kiệ n tốt Nếu nghi ngờ cách xử lý mẫu hay hậu việc xử lý mẫu khơng nên cho mượn mẫu Thời gian cho mượn mẫu thường - 12 tháng, kéo dài thời gian cho mượn tùy thuộc vào yêu cầu người mượn Người cho mượn nên yêu cầu người mượn trả mẫu lại sau hoàn thành cơng việc nghiên cứu Người mượn trả lại phần mẫu (khơng phải tồn mẫu) phải thỏa thuận trước với người chịu trách nhiệm trông giữ mẫu Một điề u kiện cho mượn mẫ u mẫu phải đượ c bảo quản điều kiện an tồn Khơng nên gập, bẻ đè bẹp gói mẫu làm hỏng mẫu Ln ln giữ mẫu gói mẫu lúc khơng dùng đến Tất mẫu đề u phải gói cẩn thận trình bảo quản phải giữ ngun gói mẫu ban đầu trả phịng mẫu cũ Các mẫu cho mượn sử dụng cho mục đích nghiên cứu ki ểm tra mẫu tiêu quan sát hình thái vi sinh vật hại kính hiển vi Người mượn mẫu khơng phép lấy mẫu để lưu giữ riêng bấ t kỳ hình thức hay chuyển mẫu cho tổ chức thứ ba mà khơng có văn cho phép người phụ trách 75 phịng mẫu cho mượn Có thể tách phần tiêu bệnh tách DNA cho số mục đích nghiên cứu cụ thể Tuy vậy, phải cẩn thận tách mẫ u tiêu tách phận tiêu cầ n thiết điều kiện đủ tiêu để giữ lại phòng mẫu ban đầu Đặc biệt, phải cẩn thận cắt tiêu gốc (tiêu chuẩn) Các thích phải sử dụng để ghi chép thông tin liên quan đến mẫu bệnh, bao gồm c ả thông tin danh pháp phân loại Bản thích phải làm từ giấy lưu trữ chất lượng cao Dướ i tất c ả thông tin cầ n thiết ghi giấy cho mượn Nên chuẩ n bị giấy cho mượn, bả n gửi cho người mượn với mẫu người phụ trách phòng mẫu giữ sao: Số cho mượn (1 số cho mẫu cho mượn để không bị lẫn) Tên thông tin liên lạc người mượn mẫu Mục đích mượn mẫu (phạm vi nghiên cứu phân loại danh pháp) Ngày mượn ngày trả mẫu Mẫu vật cho mượn (một danh mục tất tiêu mẫu cho mượn) Tấ t mẫu cho mượn phải người quản lý phòng mẫ u chứng nhận, ký vào ghi ngày cụ thể trước chuyển đến cho người mượn mẫu 9.5 BẢO ĐẢM AN TOÀN CHO MẪU BỆNH Gi ữ an toàn cho mẫu hai dạng Thứ đảm bảo an toàn học cho mẫu thứ hai trách nhiệm hợp pháp đạo đức nghề nghiệp người quản lý mẫu An toàn học Để bảo đảm an toàn học cho mẫu bệ nh, không nên để mẫu nơi mà vào Bộ mẫ u nên đượ c bả o quản nơi an tồn, khơng chịu ảnh hưở ng thời tiết, tốt nên khu vực có khóa an tồn có bảo vệ ngày lẫn đêm Nên bảo quản tiêu mẫu bệnh giá hoặ c tủ làm kim loại Nên có hệ thống chữa cháy tự động tốt nhấ t dùng khí (vì nước làm hỏng mẫu tiêu khơ) Nên đặt bình cứu hỏa cá nhân rải rác khu nhà đội ngũ cán phải huấn luyện để sử dụng hệ thống chữa cháy Đảm bảo an tồn cho thơng tin lưu giữ quan trọng Nên thường xuyên copy file máy tính cập nhậ t vào đĩ a (có thể ngày lần) Những cán sử dụng chương trình quản lý liệu phức tạp EMu (đã thảo luận chi tiết chương 8) cần phải có kỹ máy tính để xem thơng tin hiệu đính hồ sơ mẫu Trách nhiệm hợp pháp đạo đức nghề nghiệp Bất quan lưu giữ mẫu bệnh có giá trị khoa học phải có trách nhiệm hợp pháp đạo đức nghề nghiệp để bảo đảm mẫu quan 76 tâm bảo vệ bảo quản điều kiện t ốt Vì vậy, quan lưu giữ mẫu phải hạn chế t ối đa vi ệc sử dụng biện pháp k ỹ thuật khơng có sở khoa học, điều kiện mơi trường khơng thích hợp để bảo vệ tiêu cho mục đích sử dụng tương lai Cơ quan l ưu giữ nên đề sách quy định vă n việc quản lý, chăm sóc s dụng mẫu bệnh Cơ quan lưu giữ mẫu phải bảo đảm điều kiện tốt sở vật chất, cán có chun mơn cho việc lưu giữ lâu dài mẫ u bệnh hồ sơ có liên quan Chính phủ s ố nơi nhận giá trị sưu tập mẫu bệnh thông qua số luật bảo vệ mẫu sưu tập Ví dụ, phòng mẫu DAR đượ c bảo vệ theo luật mẫu khoa học nông nghiệp Agricultural Scientific Collections Trust Act 1983 (NSW) 77 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHỌN LỌC Tài liệu chung Crop Protection Compendium 2004 CAB International, Wallingford, UK Disease Compendium Series American Phytopathological Society, St Paul, Minnesota, USA Greuter, W., McNeill, J., Barrie, F.R., Burdet, H.M., Demoulin, V., Filgueiras, T.S., Nicolson, D.H., Silva, P.C., Skog, J.E., Trehane, P., Turland, N.J and Hawksworth, D.L 2000 International Code of Botanical Nomenclature (Saint Louis Code) Regnum Vegetabile, 138 Koletz Scientific Books, Germany Holiday, P 2001 A Dictionary of Plant Pathology 2nd Edition Cambridge University Press, UK Holmgren, P.K., Holmgren, N.H and Barnett, L.C (eds) 1990 Index Herbariorum th Part 1: The Herbaria of the World Edition Regnum Vegetabile, 120 New York Botanical Garden Ploetz, R.C 2003 Diseases of Tropical Fruit Crops CABI Publishing, Wallingford, UK Walker, J 1975 Mutual responsibilities of taxonomic mycology and plant pathology Annual Review of Phytopathology, 13: 335 – 355 Waller, J.M., Lenné, J.M and Waller, S.J (eds) 2002 Plant Pathologist’s Pocketbook 3rd Edition CABI Publishing, Wallingford, UK Waller, J.M., Ritchie, B.J and Holderness, M 1998 Plant Clinic Handbook IMI Technical Handbook No CAB International, Wallingford, UK Vi khuẩn Bradbury, J.F and Sadler, G.S 1997 Guide to Plant Pathogenic Bacteria 2nd Edition CAB International Mycological Institute, Surrey, UK Fahy, P.C and Persley, G.J 1983 Plant Bacterial Diseases A Diagnostic Guide Academic Press, Sydney Goto, M 1992 Fundamentals of Bacterial Plant Pathology Academic Press, San Diego, USA Schaad, N.W., Jones, J.B and Chun, W 2001 Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria 3rd Edition APS Press, St Paul, Minnesota, USA Swings, J.G and Civerolo, E.L 1993 Xanthomonas Chapman & Hall, London, UK 78 Nấm Agrios, G.N 2005 Plant Pathology 5th Edition Elsevier Academic Press, USA Ainsworth, G.C., Sparrow, F.K and Sussman, A.S 1973 The Fungi An Advanced Treatise Vols IVA, IVB Academic Press, New York rd Arx, J.A von 1981 The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture Edition J Cramer, Lehre Barnett, H.L and Hunter, B.B 1998 Illustrated Genera of Imperfect Fungi 4th Edition APS Press, St Paul, Minnesota, USA Barron, G.L 1968 The Genera of Hyphomycetes from Soil The Williams & Wilkins Company, Baltimore, USA Boerema,G.H., de Gruyter, J., Noordeloos, M.E and Hamers, M.E.C 2004 Phoma Identification Manual CABI Publishing, Wallingford, UK Braun, U 1987 A monograph of the Erysiphales (powdery mildews) Nova Hedwigia 89 Braun, U 1995 A Monograph of Cercosporella, Ramularia and Allied Genera (Phytopathogenic Hyphomycetes) Vol IHW-Verlag, München, Germany Braun, U 1998 A Monograph of Cercosporella, Ramularia and Allied Genera (Phytopathogenic Hyphomycetes) Vol IHW-Verlag, München, Germany Burgess, L.W., Summerell, B.A., Bullock, S., Gott, K.P and Backhouse, D 1994 Laboratory Manual for Fusarium Research 3rd Edition Fusarium Research Laboratory, Department of Crop Sciences, University of Sydney Carmichael, J.W., Kendrick, W.B., Connors, I.L and Sigler, L 1980 Genera of Hyphomycetes University of Alberta Press, Edmonton, Canada Crous, P.W and Braun, U 2003 Mycosphaerella and its anamorphs: Names published in Cercospora and Passalora CBS Biodiversity Series Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands Cummins, G.B and Hiratsuka, Y 2003 Illustrated Genera of Rust Fungi Edition APS Press, St Paul, Minnesota, USA rd Domsch, K.H., Gams, W and Anderson, T.-H 1993 Compendium of Soil Fungi Vols I, II Academic Press, New York Ellis, M.B 1971 Dematiaceous Hyphomycetes CMI, Kew, UK Ellis, M.B 1976 More Dematiaceous Hyphomycetes CMI, Kew, UK Ellis, M.B and Ellis, J.P 1997 Microfungi on Land Plants Richmond, London, UK Erwin, D.C and Ribeiro, O.K 1996 Phytophthora Diseases Worldwide APS Press, St Paul, Minnesota Hansford, C.G 1961 The Meliolineae Sydowia, Beih 2:1-806 79 Hansford, C.G 1963 CCLXXXV Iconographia meliolinearum Sydowia, Beih 5: pls I- Hawksworth, D.L 1974 Mycologist’s Handbook Commonwealth Agricultural Bureaux, UK Hughes, S.J 1976 Sooty moulds Mycologia 68:693-820 Index of Fungi CAB International Mycological Institute, Surrey, UK Kirk, P.M., Cannon, P.F., David, J.C and Stalpers, J.A (eds) 2001 Dictionary of the Fungi th Edition CABI Publishing, Wallingford, UK McLaughlin, D.J., McLaughlin, E.G and Lemke, P.A 2001 The Mycota Vol VII Systematics and Evolution Springer-Verlag, Berlin Mueller, G.M., Bills, G.F and Foster, M.S (eds) 2004 Biodiversity of Fungi Inventory and Monitoring Methods Elsevier Academic Press, USA Nag Raj, T.R 1993 Coelomycetous Anamorphs with Appendage-Bearing Conidia Mycologue Publications, Waterloo, Canada Pitt, J.I and Hocking, A.D 1999 Fungi and Food Spoilage Aspen Publishers, Gaithersburg, Maryland, USA Rossman, A.Y., Palm, M.E and Spielman, L.J 1987 A Literature Guide for the Identification of Plant Pathogenic Fungi The American Phytopathological Society, St Paul, Minnersota, USA Sivanesan, A 1984 The Bitunicate Ascomycetes and their Anamorphs J Cramer, Vaduz, Liechtenstein Spencer, D.M 1981 The Downy Mildews Academic Press, London Sutton, B.C 1980 The Coelomycetes CMI, Kew, UK Smith, D and Onions, A.H.S 1994 The Preservation and Maintenance of Living Fungi 2nd Edition IMI Technical Handbook No CAB International, Wallingford, UK Vánky, K 2002 Illustrated Genera of Smut Fungi Paul, Minnesota, USA 2nd Edition APS Press, St White, J.F., Bacon, C.W., Hywel-Jones, N.L and Spatafora, J.W 2003 Clavicipitalean Fungi: Evolutionary Biology, Chemistry, Biocontrol, and Cultural Impacts Mycology Series 19 Marcel Dekker, New York Wingfield, M.J., Seifert, K.A and Webber, J.F 1999 Ceratocystis and Ophiostoma: Taxonomy, Ecology and Pathogenicity APS Press, St Paul, Minnesota 80 Tuyến trùng Anon 2005 Interactive diagnostic key to plant parasitic, freeliving and predaceous nematodes University of Nebraska - Lincoln Nematology Laboratory, http://nematode.unl.edu/key/nemakey.htm Bell, M 2004 Plant Parasitic Nematodes: Lucid key to 30 genera of plant parasitic nematodes http://www.lucidcentral.com/keys/nematodes/ Eisenback, J.D 2002 Identification guides for the most common genera of plantparasitic nematodes Mactode Publications, Blacksburg USA Hodda, M 2005 Key to the nematodes of Australia http://www.ento.csiro.au/science/nematode.html Hunt, D.J 1993 Aphelenchida, Longidoridae and Trichodoridae : their systematics and bionomicộng CAB International, Wallingford, UK Nickle, W.R 1991 Manual of agricultural nematology M Dekker, New York Nobbs, J.M 2004 Plant parasitic nematodes of Australia [CD] South Australian Research and Development Institute, Adelaide (available from nobbs.jackie@saugov.sa.gov.au) Shurtleff, M.C and Averre, C.W 2000 Diagnosing plant diseases caused by nematodes APS Press, St Paul, Minnesota, USA Siddiqi, M.R 2000 Tylenchida: parasites of plants and insects CABI Publications, Wallingford, UK Stirling, G.R., Nicol J and Reay, F 1999 Advisory services for nematode pests: operational guidelines Rural Industries Research and Development Corporation, Barton, A.C.T viii, 111 p (http://www.rirdc.gov.au/reports/Ras/99-41.pdf) Phytoplasma Whitcomb, R.F and Tully, J.G (Eds) 1989 The Mycoplasmas Vol Academic Press, New York Virus Brunt, A., Crabtree, K., Dallwitz, M., Gibbs, A and Watson, L 1996 Viruses of Plants: Descriptions and Lists from the VIDE Database CABI Publishing, Wallingford, UK Hull, R 2002 Matthews’ Plant Virology Academic Press, London, UK 81