Nghiên cứu này xác định thành phần hóa học chính, nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn phân lập (Minimum Inhibitory Concentration - MIC), nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum Bactericidal Concentration - MBC), và nồng độ diệt nấm tối thiểu (Minimum Fungicidal Concentration - MFC) của tinh dầu 4 loài trong chi Ocimum, họ Hoa Môi (Lamiaceae): é trắng (Etr), húng quế (HQ), hương nhu trắng (HNTr) và hương nhu tía (HNT).
Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 59 Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu thuộc chi Ocimum, họ Hoa Môi (Lamiaceae) Nguyễn Thanh Tố Nhi*, Lê Thị Thu Trang, Trần Thị Hoàng Ngọc, Trần Thủy Tiên, Võ Phát Thịnh Khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành * nttnhi@ntt.edu.vn Tóm tắt Nghiên cứu xác định thành phần hóa học chính, nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn phân lập (Minimum Inhibitory Concentration - MIC), nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum Bactericidal Concentration - MBC), nồng độ diệt nấm tối thiểu (Minimum Fungicidal Concentration - MFC) tinh dầu lồi chi Ocimum, họ Hoa Mơi (Lamiaceae): é trắng (Etr), húng quế (HQ), hương nhu trắng (HNTr) hương nhu tía (HNT) Thành phần hóa học tinh dầu xác định phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS) Viện Cơng nghệ Hóa học; giá trị MIC, MBC, MFC xác định phương pháp vi pha lỗng mơi trường lỏng Kết nghiên cứu xác định thành phần hóa học mẫu tinh dầu khảo sát: citral (28,69 %) Etr, estragole (79,18 %) HQ, eugenol (23,49 %) HNT camphor (25,67 %) HNTr Tinh dầu Etr HNT có tác dụng ức chế tốt vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus nhạy methicillin (Methicillinresistant Staphylococcus aureus - MSSA), Staphylococcus aureus kháng methicillin (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus - MRSA) có MIC 2,5 µL/mL, tinh dầu Etr tác dụng ức chế tốt vi khuẩn Gram âm E.coli P.aeruginosa, hai chủng nấm C.albicans C.tropicalis với MIC µL/mL 0,625 µL/mL Đồng thời, tinh dầu HQ có tính diệt khuẩn (MBC ≈ MIC) tốt C albicans có MFC µL/mL, tinh dầu Etr có tính diệt khuẩn tốt lên E.coli P.aeruginosa với MBC l àL/mL đ 2021 Journal of Science and Technology - NTTU Đặt vấn đề Việt Nam với điều kiện khí hậu nhiệt đới thuận lợi cho sinh trưởng đa dạng loài thực vật có chứa tinh dầu, có chi Ocimum thuộc họ Lamiaceae [1] Tinh dầu biết đến từ lâu hương liệu sử dụng lĩnh vực thực phẩm mĩ phẩm Ngày nay, tượng kháng kháng sinh ngày trở nên phổ biến, kháng sinh không cịn liều thuốc vạn tìm thấy Nhiều hướng nghiên cứu khác thực để giảm thiểu sử dụng kháng sinh, sử dụng tinh dầu phương Nhận 02.03.2021 Được duyệt 14.05.2021 Cơng bố 15.07.2021 Từ khóa Ocimum, chất kháng khuẩn, tinh dầu, chất kháng nấm, thành phần hóa học pháp không đem lại nhiều kết khả quan [2] Khả kháng khuẩn số tinh dầu phụ thuộc vào nhiều yếu tố thành phần, nồng độ, thời gian tiếp xúc với tinh dầu chủng vi sinh vật Sự tăng trưởng vi sinh vật kháng đa kháng kháng sinh bị ức chế số loại tinh dầu Trên giới, có báo cáo khả kháng vi vật số tinh dầu thuộc chi Ocimum [3], [4] Tuy nhiên, Việt Nam tinh dầu loài chi chưa quan tâm nghiên cứu đầy đủ Do đó, nghiên cứu thực nhằm mục tiêu làm Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 60 phong phú thêm tính ứng dụng tinh dầu bảo quản thực phẩm y tế Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu mẫu thực vật tươi định danh sơ hình thái, đặc điểm vi phẫu môn Thực vật dược, khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành, phận dùng toàn thân trừ rễ lồi trình bày Bảng Bảng Các loài chi Ocimum sử dụng nghiên cứu Tên Việt Nam É trắng (Etr) Húng quế (HQ) Hương nhu trắng (HNTr) Hương nhu tía (HNT) Tên khoa học O basilicum var.pilosum (Willd.) Benth O basilicum L O gratissimum L O tenuiflorum L 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chiết tinh dầu mẫu dược liệu nghiên cứu Dược liệu rửa để loại bỏ bụi bám dính, sau cắt nhỏ cho vào bình cầu dung tích 000 mL, thêm nước cất vừa đủ ngập dược liệu, sau lắp ráp vào hệ thống chưng cất tinh dầu Clevenger Sau khoảng chưng cất, nhiệt độ chưng cất nhiệt độ sôi nước, tắt bếp để nguội, tinh dầu nhẹ nước nằm phía nên xả van để nước chảy trước, sau thu tinh dầu Dùng muối Na2SO4 để làm khan phần nước lẫn tinh dầu để thu tinh dầu nguyên chất Tinh dầu bảo quản tủ lạnh 0C - Hiệu suất chiết tinh dầu tính theo cơng thức sau: Khối lượng tinh dầu %Hiệu suất chiết = x 100 Khối lượng mẫu đó: khối lượng tinh dầu khối lượng chất chiết xuất (g), khối lượng mẫu khối lượng dược liệu đem chiết (g) Thành phần hóa học tinh dầu phân tích GC-MS Viện Cơng nghệ Hóa học 2.2.2 Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu Hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu đánh giá dựa nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ diệt khuẩn, diệt nấm tối thiểu MBC, MFC Thử nghiệm MIC tiến hành theo phương pháp vi pha lỗng mơi trường lỏng, thực khay nhựa 96 giếng, theo hướng dẫn CLSI M07A9 hoạt tính kháng khuẩn [5] CLSI M27-A2 hoạt tính kháng nấm [6], thử nghiệm lặp lại lần Đọc kết chất thị màu resazurin 0,015 %; Giếng chứng khơng có tinh dầu, vi khuẩn tăng trưởng làm thay đổi màu thị resazurin sang màu hồng khơng màu, dãy chứng có tinh dầu, khơng có vi khuẩn giữ nguyên màu xanh dương thị màu tím, giá trị MIC xác Đại học Nguyễn Tất Thành Nơi thu mẫu Đường số 3, thôn Tân Sinh Đông, xã Cam Thành Bắc, huyện Cam Lâm, tỉnh Khánh Hòa định giếng cuối dãy có nồng độ tinh dầu thấp ức chế tăng trưởng vi khuẩn Môi trường thử nghiệm MHB bổ sung 0,05 % Tween 80 vi khuẩn, MHB bổ sung % glucose 0,05 % Tween 80 vi nấm; vi khuẩn thử nghiệm: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213 (MSSA) Staphylococcus aureus ATCC 33591 (MRSA); vi nấm thử nghiệm: Candida albicans ATCC 10231 chủng lâm sàng Candida tropicalis Chất thử nghiệm: tinh dầu mẫu pha loãng thành dãy nồng độ giảm ½, vi khuẩn 40 µL/mL – 0,625 µL/mL, vi nấm 20 µL/mL – 0,3125 µL/mL Thử nghiệm MBC, MFC tiến hành phương pháp trải đĩa nồng độ MIC, MIC, 4MIC Môi trường thử nghiệm TSA vi khuẩn, SDA vi nấm Kết MBC, MFC đĩa khơng có vi khuẩn, vi nấm mọc Kết thảo luận 3.1 Chiết tinh dầu mẫu dược liệu Tinh dầu dược liệu khảo sát chiết phương pháp chưng cất lôi nước, kết tính hiệu suất tinh dầu trình bày Bảng Hiệu suất chiết tinh dầu thấp é trắng 0,022 %, cao húng quế 0,127 % Bảng Hiệu suất chiết tinh dầu mẫu khảo sát Mẫu Etr HQ HNT HNTr Khối lượng mẫu (g) 134,5 110,1 111,1 116,8 Khối lượng tinh dầu (g) 0,03 0,14 0,08 0,05 Hiệu suất (%) 0,022 0,127 0,072 0,043 Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 61 3.2 Thành phần hóa học tinh dầu khảo sát Tinh dầu mẫu dược liệu khảo sát gửi phân tích thành phần hóa học Viện Cơng nghệ Hóa học Kết cho thấy thành phần tinh dầu Etr ciitral (28,69 %), 2,6-Octadienal, 3,7-dimethyl (19,44 %) caryophyllen (9,96 %); tinh dầu HQ estragole (79,18 %), trans-.alpha.-Bergamotene (4,34 %), beta.Ocimene (3,1 %); tinh dầu hương nhu trắng camphor (25,67 %); tinh dầu hương nhu tía eugenol (23,49 %), cyclohexane (22,43 %), caryophyllene (15,23 %), germacrene D (15,73 %) Kết tương đồng với nghiên cứu Rao cộng sự, 2011 [7] Trong nghiên cứu Rao cộng sự, 14 mẫu thuộc loài chi Ocimum thu thập đánh giá thành phần hóa học hoạt tính sinh học tinh dầu từ loài Kết cho thấy 10 mẫu húng quế thu được, có mẫu T9 thành phần hóa học methyl chavicol (87 %); mẫu hương nhu trắng có thành phần hóa học eugenol (62,1 %), camphor (18,4 %); mẫu hương nhu tía có thành phần hóa học methyl eugenol (72,5 %) 3.3 Khả ức chế vi sinh vật tinh dầu khảo sát 3.3.1 Khả ức chế vi khuẩn (MIC) Bảng Bảng nhựa 96 giếng thử nghiệm xác định MIC tinh dầu húng quế, hương nhu tía Húng quế Hương nhu tía Nồng độ tinh dầu (µL/mL) E.coli P aeruginosa MSSA MRSA Chứng (không vk) E.coli P aeruginosa MSSA MRSA Chứng (không vk) 40 20 10 2,5 1,25 + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + - 0,625 + + + + - + + + + - Chứng không tinh dầu) + + + + - + + + + - Bảng Khả ức chế vi khuẩn tinh dầu khảo sát MIC (µL/mL) Tinh dầu E.coli P.aeruginosa MSSA HQ 10 10 20 HNT 10 2,5 HNTr 20 20 Etr 5 2,5 MRSA 20 2,5 20 2,5 Bảng Bảng nhựa 96 giếng thử nghiệm xác định MIC tinh dầu hương nhu trắng, é trắng Hương nhu trắng É trắng Nồng độ Chứng Chứng (µL/mL) E.coli P.aeruginosa MSSA MRSA (khơng E.coli P.aeruginosa MSSA MRSA (không vk) vk) 40 20 10 + + + + + + 2,5 + + + + + + 1,25 + + + + + + + + Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 14 62 0,625 + + + + - + + + + - Chứng (không tinh dầu) + + + + - + + + + - (+): vi khuẩn tăng trưởng; (-): vi khuẩn bị ức chế tăng trưởng Qua Bảng 3, Bảng 4, Bảng Hình cho thấy số lồi khảo sát chi Ocimum tinh dầu é trắng hương nhu tía có tác dụng tốt vi khuẩn Gram dương MSSA, MRSA với MIC 2,5 µL/mL, tinh dầu é trắng tác dụng tốt vi khuẩn Gram âm E.coli P.aeruginosa với MIC µL/mL Stefan cộng sự, 2013 [8] nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn tinh dầu loài chi Ocimum, kết cho thấy tinh dầu Ocimum basilicum L var Genovese có tác dụng tốt E coli S aureus 3.3.2 Khả ức chế vi nấm (MIC) Bảng Khả ức chế vi nấm (MIC) tinh dầu khảo sát MIC (µL/mL) Tinh dầu C albicans C tropicalis HQ 2,5 HNT 1,25 1,25 HNTr 1,25 0,625 Etr 0,625 0,625 Từ Bảng 6, Bảng Hình 2, cho thấy số loài chi Ocimum thuộc phạm vi nghiên cứu tinh dầu é trắng có tác dụng tốt hai chủng nấm C.albicans C.tropicalis với giá trị MIC 0,625 µL/mL Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Đinh Nga cộng [9] Tóm lại, loại tinh dầu khảo sát chi Ocimum đề tài cho khả ức chế vi nấm tốt vi khuẩn Hình Bảng nhựa 96 giếng thử nghiệm xác định MIC tinh dầu A: Húng quế, B: Hương nhu tía, C: Hương nhu trắng, D: É trắng 1: Chứng (không vi nấm), 2: Candida albicans, 3: Candida tropicalis, ’:chứng không tinh dầu Bảng Bảng nhựa 96 giếng thử nghiệm xác định MIC tinh dầu khảo sát Húng quế Hương nhu tía Hương nhu trắng Nồng độ Chứng Chứng Chứng (µL/mL) (khơng C.a C.t (khơng C.a C.t (không C.a C.t vi nấm) vi nấm) vi nấm) 20 10 2,5 + 1,25 + + 0,625 + + + + + 0,3125 + + + + + + Chứng (không tinh + + + + + + dầu) (+): vi khuẩn tăng trưởng; (-): vi khuẩn bị ức chế tăng trưởng C.a: Candida albicans, C.t: Candida tropicalis 3.4 Khả diệt vi sinh vật tinh dầu khảo sát Thử nghiệm tìm nồng độ diệt vi sinh vật tiến hành phương pháp trải đĩa nồng độ MIC, MIC, Đại học Nguyễn Tất Thành É trắng Chứng (không C.a vi nấm) + - + C.t + + MIC Kết MBC, MFC đĩa khơng có vi khuẩn vi nấm mọc Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 3.4.1 Khả diệt vi khuẩn Kết khả diệt vi khuẩn trình bày Bảng cho thấy số tinh dầu có tác dụng diệt khuẩn (MBC ≈ MIC), điển hình tinh dầu húng quế P aeruginsosa, MSSA với MBC 10 µL/mL, 20 µL/mL, tinh dầu hương nhu tía P aeruginosa với MBC 10 µL/mL, tinh dầu hương nhu trắng P aeruginosa v ới MBC 20 µL/mL, tinh dầu é trắng E.coli P.aeruginosa với MBC µL/mL Ngồi ra, số tinh dầu có tính chất kìm khuẩn (MBC > 4MIC), điển tinh dầu hương nhu tía tinh dầu hương nhu trắng E.coli với giá trị MBC > 20 µL/mL, tinh dầu é trắng MRSA với giá trị MBC > 10 µL/mL Bảng Khả diệt vi khuẩn tinh dầu khảo sát MBC (µL/mL) Tinh dầu E.coli P.aeruginosa MSSA MRSA HQ 20 10 20 40 HNT >20 10 10 10 HNTr > 20 20 40 40 Etr 5 > 10 3.4.2 Khả diệt vi nấm Kết khả diệt vi nấm trình bày Bảng cho thấy hầu hết tinh dầu khảo sát có tác dụng kìm vi nấm C.albicans C tropicalis (MFC > 4MIC), ngoại trừ tinh dầu húng quế có tác dụng diệt vi nấm (MFC ≈ MIC) C.albicans với MFC µL/mL Bảng Khả diệt vi nấm tinh dầu khảo sát MFC (µL/mL) Tinh dầu C albicans C tropicalis HQ 5 HNT >5 >5 HNTr >5 > 2,5 63 Etr > 2,5 2,5 Kết luận đề xuất Nghiên cứu khảo sát khả ức chế vi sinh vật mẫu tinh dầu, tinh dầu é trắng hương nhu tía có tác dụng ức chế tốt vi khuẩn Gram dương MSSA, MRSA với MIC 2,5 µL/mL, tinh dầu é trắng có tác dụng ức chế tốt vi khuẩn Gram âm E.coli P.aeruginosa, hai chủng nấm C.albicans C.tropicalis với MIC µL/mL 0,625 µL/mL Ngồi ra, khảo sát khả diệt vi sinh vật mẫu tinh dầu, số tinh dầu có tính diệt khuẩn (MBC ≈ MIC) tinh dầu húng quế vi khuẩn P aeruginsosa, MSSA cho giá trị MBC 10 µL/mL, 20 µL/mL, tinh dầu hương nhu tía P aeruginosa với MBC 10 µL/mL, tinh dầu hương nhu trắng P aeruginosa với MBC 20 µL/mL, tinh dầu é trắng E.coli P.aeruginosa với MBC µL/mL; tinh dầu húng quế C albicans với MFC µL/mL Với kết đạt trên, số định hướng nghiên cứu đề xuất phối hợp tinh dầu chi Ocimum để giảm thể tích sử dụng tạo mùi hương dễ chịu, thích hợp cho người sử dụng tăng khả kháng vi sinh vật, thử nghiệm tìm dạng bào chế thích hợp cho mục đích sử dụng khác (phun xịt, xơng hơi) tiến hành thực tế chế phẩm diệt vi sinh vật Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ - Đại học Nguyễn Tất Thành, đề tài mã số 2020.01.072 /HĐ-NCKH Tài liệu tham khảo Lê Ngọc Thạch (2003), Tinh dầu, NXB ĐHQG Tp HCM Celiktas O Y., Kocabas E H., Bedir E., Sukan F V., (2007), "Antimicrobial activities of methanol extracts and essential oils of Rosmarinus officinalis, depending on location and seasonal variations", Food Chemistry, 100 (2), pp 553-559 Pandey R R et al (2010), "Phytochemical and antimicrobial studies on essential oils of some aromatic plants", African Journal of Biotechnology (28), pp 4364-4368 Anand A et al (2011), "Essential oil composition and antimicrobial activity of three ocimum species from Uttarakhand (India)", International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences (3), pp 223-225 CLSI, (2012), Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, Approved Standard, 9th ed., CLSI document M07-A9 Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 64 Wayne P A (2002), "Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts, approved standard", CLSI document M27-A2 Rao, B R R., Kothari, S K., Rajput, D K., Patel, R P., & Darokar, M P (2011) “Chemical and Biological Diversity in Fourteen Selections of Four Ocimum Species” Natural Product Communications, 6(11), 1934578X1100601134 Stefan, M., Zamfirache, M.M., Padurariu, C et al The composition and antibacterial activity of essential oils in three Ocimum species growing in Romania cent.eur.j.biol 8, 600-608 (2013) Nguyễn Đinh Nga cộng (2010), Nghiên cứu sàng lọc thuốc kháng vi nấm gây bệnh da niêm mạc, 1-100 Screening for antimicrobial activity of essential oils of Ocimum, Lamiaceae Nguyen Thanh To Nhi*, Le Thi Thu Trang, Tran Thi Hoang Ngoc, Tran Thuy Tien, Vo Phat Thinh Pharmacy Faculty – Nguyen Tat Thanh University * nttnhi@ntt.edu.vn Abstract In order to screen the antimicrobial activity of essential oils of the genus Ocimum, microdilution on liquid medium was performed to determine the minimum inhibitory concentration of bacteria and fungi (MIC, the minimum bactericidal concentration (MBC), and the minimum fungicidal concentration (MFC) of the essential oils of species of lemon basil, basil, clove basil and holy basil Besides, the main chemical composition of essential oils was determined via gas chromatography-mass spectrometry GC-MS at the Institute of Chemical Technology The results of the study identified the main chemical compositions of essential oil samples: citral (28.69 %) of lemon basil, estragole (79.18 %) of basil, eugenol (23.49 %) of holy basil and camphor (25.67 %) of clove basil The essential oils of lemon basil and holy basil have the best inhibitory effect on methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (MSSA) and methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) with MICs of 2.5 µL/mL, and lemon basil essential oil had the best inhibitory effect on Gram-negative bacteria E.coli and P.aeruginosa, both C.albicans and C.tropicalis strains with MICs of µL/mL and 0.625 µL/mL, respectively At the same time, basil essential oil has good bactericidal properties (MBC ≈ MIC) on C albicans with MFC of µL/mL, while lemon basil essential oil has good bactericidal properties on E.coli and P aeruginosa with MBC of µL/mL Keywords Ocimum, antibacterial, antifungal, essential oil, chemical composition Đại học Nguyễn Tất Thành ... lượng tinh dầu khối lượng chất chi? ??t xuất (g), khối lượng mẫu khối lượng dược liệu đem chi? ??t (g) Thành phần hóa học tinh dầu phân tích GC-MS Vi? ??n Cơng nghệ Hóa học 2.2.2 Sàng lọc hoạt tính kháng vi. .. làm khan phần nước lẫn tinh dầu để thu tinh dầu nguyên chất Tinh dầu bảo quản tủ lạnh 0C - Hiệu suất chi? ??t tinh dầu tính theo cơng thức sau: Khối lượng tinh dầu %Hiệu suất chi? ??t = x 100 Khối lượng... vi sinh vật tinh dầu Hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu đánh giá dựa nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ diệt khuẩn, diệt nấm tối thiểu MBC, MFC Thử nghiệm MIC tiến hành theo phương pháp vi