Kỹ thuật PCR trong chẩn đoán lao pptx

Kỹ thuật PCR trong chẩn đoán lao KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) PHÁT HIỆN M. TUBERCULOSIS TRỰC TIẾP TRONG MẪU BỆNH PHẨM Kỹ thuật PCR cho phép xác định tác nhân gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm nhờ khả năng nhận biết và sao chép để khuyếch đại về mặt số lượng đoạn trình tự đặc hiệu trên genom của vi khuẩn. Đối với M.tuberculosis, kỹ thuật PCR phát hiện trình tự 249 đôi bazơ nằm trên đoạn IS 6110, là trình tự gắn (IS- insert sequence) đặc hiệu và có khả năng tự sao chép với số lượng lớn (1-25 lần) trong genome vi khuẩn thuộc nhóm M.tuberculosis (M.tuberculosis, M.microti, M.bovis và M.africanum). Quá trình sao chép được thực hiện trong một chu trình nhiệt lặp lại với sự tham gia của enzyme chịu nhiệu Taq polymerase có bản chất là ADN polymeraza, các deoxynucleotide triphosphat tự do (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) và cặp đoạn mồi đặc hiệu cho đoạn trình tự định sao chép. Sản phẩm PCR được phát hiện bằng kỹ thuật điện di trên gen agarosa hoặc các kỹ thuật lai ghép miễn dịch khác như lai ghép Dot plot (dot blot hybridzation), lai ghép Southern blot hoặc lai ghép với cơ chất trên phiến nhựa, v.v. I. CÁC THÔNG TIN CHUNG CẦN BIẾT VỀ PCR I.1. Nguyên lý của PCR PCR là kỹ thuật khuyếch đại số lượng ADN dựa trên trình tự ADN khuôn mẫu với quy trình tiến hành gồm 3 giai đoạn: biến tính, gắn mồi và tổng hợp kéo dài với sự trợ giúp của ADN polymerase chịu nhiệt, primers và deoxy-nucleotide triphosphates (dNTPs) I.2. Thông số chu kỳ PCR PCR được thực hiện với các chu trình ủ bệnh phẩm đã xử lý ở 3 nhiệt độ khác nhau tương ứng với 3 giai đoạn cần thiết cho việc tổng hợp ADN. Mỗi chu kỳ bao gồm 3 giai đoạn: Biến tính ở 90-95 0 C, gắn mồi ở 40-65 0 C và tổng hợp kéo dài ở 70-75 0 C. Tuỳ theo nồng độ ADN đích có trong bệnh phẩm mà xác định số lượng chu kỳ cần thực hiện, số lượng trình tự khuyếch đại càng nhiều nếu số chu kỳ càng tăng. I.3. Các bước cần thiết để tránh nhiễm với M.tuberculosis hoặc sản phẩm PCR (amplicon) từ đợt trước I.3.1. Yêu cầu đối với phòng thí nghiệm: Quy trình thực hiện PCR cần được tiến hành tại 3 phòng thí nghiệm khác nhau và theo nguyên tắc lưu thông một chiều để giảm thiểu lây nhiễm gây dương tính giả. Phòng thứ nhất: chuẩn bị hỗn dịch nền (Mix) chạy PCR; phòng thứ hai: chuẩn bị và xử lý mẫu bệnh phẩm và cho bệnh phẩm vào ống chứa mix; phòng thứ ba: phân tích sản phẩm PCR. Vận chuyển dụng cụ và hoá chất cần theo chiều từ phòng thứ nhất (chuẩn bị mix) đến phòng thứ ba, không được theo hướng ngược lại. Các dung dịch hoá chất pha chế và xử lý cần được khử trùng bằng hấp ướt ở 121 0 C trong 20 phút. Nguyên vật liệu như ống chạy PCR, đầu côn, pipet Pasteur, ống đựng bệnh phẩm, găng tay, v.v. cần được vô trùng và chỉ được dùng 1 lần, không dùng lại. I.3.2. Sử dụng enzyme tiêu diệt lây nhiễm sản phẩm PCR (amplicon) của những đợt trước: Enzyme uracil ADN glycosylasa (UDG) có tác dụng nhận biết và cắt trình tự ADN-sản phẩm PCR ở vị trí Uracil (U) và tạo những mảnh ADN gãy vụn, vô hiệu hoá amplicon nhiễm từ những đợt PCR trước đó. Do vậy, trước khi thực hiện các chu kỳ khuyếch đại trong chu trình PCR, cần ủ bệnh phẩm ở 40 0 C trong 10 phút với enzyme UDG để phá các trình tự sản phẩm PCR nhiễm từ các đợt trước. Các chu trình khuyếch đại tiếp theo sẽ làm bất hoạt hoạt tính của UDG với nhiệt độ > 55 0 C. Sau khi chạy xong các chu kỳ khuyếch đại, ủ mẫu ở 72 0 C trong thời gian hơn 30 phút để bất hoạt hoàn toàn hoạt tính của UDG, không gây cản trở cho việc đọc kết quả PCR. II. KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH M.TUBERCULOSIS II.1. Pha hỗn dịch Mix (thực hiện tại phòng chuẩn bị Mix) Để pha chế hỗn dịch mix, tính số lượng mẫu cần xét nghiệm và tính toán lượng Mix cần thiết với các thành phần tương ứng. Dưới đây là ví dụ cách tính để pha đủ cho 50 ống PCR với lượng 50ul mix/ống. Thành phần Trình tự cho vào Số lượng (ul) cho tổng 50ul/ống Nồng độ cuối cùng Nước cất 2 lần Milli Q Đệm phản ứng (10x) Tris 100mM, pH 8,3 NaCl 500 mM Gelatin 0,1% (w/v) MgCl2 25mM dNTP (hỗn hợp) - dATP 20mM - dCTP 20mM - dGTP 20mM - dUTP 20mM Mồi: 50uM 330ug/ml Ampli Taq polymerasa Uracil-ADN-glycosylase (UDG) 1U/ul Bệnh phẩm, ADN hoặc TE (a) (b) (c) (d) (e) (g) (h) (i) (k) Tính lượng cần thiết 5 5 4 hoặc 6 0,5 0,2 0,2 0,2 5-15 10mM TrisHCl 50 mM NaCl 0,01% 2-3 mM 0,2 mM/loại 0,2 uM 1U/50ul 0,2/ống 5-15ul/ống II.2. Xử lý bệnh phẩm Bước 1: - Dịch : Ly tâm lấy cặn trong ống Eppendorf, 12000 v/ phút x10 phút - Đờm : Khử nhiễm bằng 1 thể tích NaOH 1M (40gr NaOH/lit) + 1 thể tích Natri Citrat 0,1M (29,4gr Na- citrat.2H2O/lit) và 30mM N-acetyl-L-cystein (NALC) (15mg/100ml), lắc cho đờm loãng đều trong 15 phút, ly tâm tách cặn như đối với dịch - Mảnh sinh thiết và mủ: Ly giải bằng Protease K qua đêm ở 56 0 C Bước 2: Xử lý bệnh phẩm có máu bằng TTE (1% Triton X 100, 20mM Tris-HCl pH 8.3, 1m EDTA): cho 1 ml dung dịch TTE vào mẫu đã tách cặn, lắc kỹ cho tan máu, ly tâm loại bỏ nước nổi. Bước 3: Bất hoạt 100 OC trong 10 phút II.3. Tách ADN của vi khuẩn lao trong bệnh phẩm (Phương pháp BOOM) Bước 1: Phá tế bào giải phóng ADN Cho 0,9ml dung dịch ly giải tế bào L6 (120g GuSCN, 100ml 0.1 M Tris-HCl pH 6.4, 22ml 0.2M EDTA pH 8.0 và 2.6 ml Triton X 100) và 20ml diatom 20% vào mỗi bệnh phẩm Lắc kỹ bằng máy lắc trong ít nhất 10phút Ly tâm, lấy cặn Bước 2: Tinh sạch ADN Rửa 2 lần bằng dung dịch L2 (120g GuSCN, 100ml 0.1 M Tris-HCl pH 6.4) Rửa 2 lần bằng Ethanol 70% Rửa 1 lần bằng acetone Phơi khô trong bể nước 56 oC (10-15 phút ) Bước 3: Thu hồi ADN Cho 70ml TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA) vào mỗi mẫu, ủ 56 0 C, 10 phút . Lắc kỹ, ly tâm 12000 vòng / 2 phút Tách nước nổi chứa ADN và sử dụng để chạy PCR II.4. Cho mẫu vào ống phản ứng PCR Dung dịch có chứa ADN sau khi được tách từ bệnh phẩm được cho vào ống phản ứng đã chứa sẵn 35 ul hỗn dịch mix. Mỗi bệnh phẩm cần có hai ống phản ứng (ống a và ống b). ống a sử dụng để chạy phản ứng với bệnh phẩm, ống b dùng để kiểm tra chất ức chế nếu có trong bệnh phẩm. ống b ngoài ADN tách từ bệnh phẩm còn được cho thêm ADN của M.smegmatis đã được biễn đổi bằng gắn thêm một đoạn trình tự IS6110. Cặp mồi Pt18 và INS2 có khả năng khuyếch đại trình tự 249 đôi bazỏ trên IS 6110 của M. tuberculosis, và khuyếch đại cả trình tự 305 đôi bazơ trên IS6110 của M. smegmatis. - ống a: 10ml d 2 ADN đã tách từ bệnh phẩm - ống b: 5ml d 2 ADN đã tách từ bệnh phẩm + 5ml d 2 ADN M. smegmatis 10 -11 g/ml - ống chứng dương : 10 ml ADN của M. tuberculosis 10 -12 g/ml (hay 10 femtogram trong một ống phản ứng tương đương lượng ADN tách từ 2-3 vi khuẩn) - ống chứng âm : 10 ml d 2 TE II.5. Chương trình chạy PCR II.6. Điện di sản phẩm PCR Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2% (2 gr agarose/100 ml đệm TBE pH 8,3 với 0,89M Tris, 0,89M axit boric và 0,02 EDTA): 20ul/giếng, ở hiệu điện thế 110V, dòng điện 40 mA, từ 30 đến 45 phút. Gel được lấy ra và nhuộm trong dung dịch ethidium bromide 0.2mg/ml (20 phút) II.7. Chụp ảnh và đọc kết quả Soi gel dưới đèn UV, chụp ảnh bằng phim Polaroid Phân tích kết quả: Bệnh phẩm có kết quả PCR dương tính nếu cả 2 ống phản ứng a và b cùng dương tính, ống thứ nhất cho vạch đặc hiệu của đoạn ADN có độ dài phân tử là 249 đôi bazơ và ống thứ hai cho vạch đặc hiệu ứng với các phân tử có độ dài 305 đôi bazơ, PCR cho kết quả âm tính nếu ống thứ nhất âm tính (không có vạch) và ống thứ hai dương tính, nếu cả hai ống cùng cho kết quả âm tính thì bệnh phẩm có chất ức chế phản ứng (hình 1). Kết quả cũng có thể đọc bằng các phương pháp khác như lai ghép Dot-blot với probe đánh dấu bằng chất phóng xạ hoặc với hệ thống biotin III. CHUẨN BỊ HOÁ CHẤT, DUNG DỊCH CẦN THIẾT CHO PCR CHẨN ĐOÁN LAO Dung dịch TTE: 1% Triton X 100 pha trong 20mM Tris-HCl pH=8,3 + 1mM EDTA (bảo quản trong đông lạnh); Hấp ướt khử trùng 121 0 C x 15 phút Dung dịch TE: 10 mM Tris HCl + 1mM EDTA, pH 8,3; Hấp ướt khử trùng 120 0 C x 20 phút Dung dịch xử lý đờm: Dung dịch 1 ( NaOH 1M): 40 gr NaOH / 1 lít H 2 O Dung dịch 2 (Na-citrate 0,1M): 29,4gr Na-citrate.2H 2 O/lit, Dung dịch 3 (N-acetyl-L-cysteine-NALC): 15 mg trong 3ml dd 1+ dd 2 Hấp ướt khử trùng 120 0 C x 20phút đối với dung dịch 1 và 2 Dung dịch proteinase K: 5% Triton X-100, 1mg proteinase K hoà trong 1ml 20 mM Tris-HCl pH 8,3 + 1mM EDTA Dung dịch phá vỡ tế bào và tách ADN : Dung dịch L6: 120 gr Guaniginum thiocyanate GuSCN (Fluka, Thụy sỹ) pha trong 100ml 0,1M Tris HCl, pH 6,4 + 22ml EDTA 0,2M và 2,6ml Triton X-100; hấp ướt khử trùng 120 0 Cx20 phút Dung dịch rửa L2: 10 gr GuSCN /100ml Tris HCl 0,1M, pH 6,4; hấp ướt khử trùng 120 0 Cx20 phút Hỗn dịch Diatom (celite): 10 gr pha trong 50ml H 2 O + 500ul HCl 32% (hoặc 445ul HCl 36%) Dung dịch chạy điện di Dung dịch đệm TBE đặc 10X, pH=8,3: - 0,89M Tris 108g - 0,89M boric axit 55g - 0,02M EDTA 40ml 0,5M EDTA pH8,0 - H 2 O 1 lít Đệm chạy mẫu (loading buffer): 100% glycerol: 50ml TE 10X 50ml Bromophenol blue 0,015g . Kỹ thuật PCR trong chẩn đoán lao KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) PHÁT HIỆN M. TUBERCULOSIS TRỰC TIẾP TRONG MẪU BỆNH PHẨM Kỹ thuật PCR cho phép xác định tác. biotin III. CHUẨN BỊ HOÁ CHẤT, DUNG DỊCH CẦN THIẾT CHO PCR CHẨN ĐOÁN LAO Dung dịch TTE: 1% Triton X 100 pha trong 20mM Tris-HCl pH=8,3 + 1mM EDTA (bảo quản trong đông lạnh); Hấp ướt khử trùng 121 0 C. lai ghép với cơ chất trên phiến nhựa, v.v. I. CÁC THÔNG TIN CHUNG CẦN BIẾT VỀ PCR I.1. Nguyên lý của PCR PCR là kỹ thuật khuyếch đại số lượng ADN dựa trên trình tự ADN khuôn mẫu với quy trình