- Gà bản ựịa (các giống gà Móng, gà đông Tảo, gà Hồ, gà Ri) khỏe hoặc nghi mắc CRD nuôi tại các trang trại, gia trại tại Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Dương, Hà Nam.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 25
- Huyết thanh gà: huyết thanh ựược lấy từ các ựàn gà bản ựịa tại các ựịa bàn nghiên cứu.
- Mycoplasma gallisepticum (MG) và Mycoplasma synoviae (MS)
mang mã hiệu ATCC 19610 và ATCC 27399, hai loài này ựược cung cấp bởi Viện nghiên cứu thú y của Hàn Quốc. Chủng virus Newcastle (Lasota) và 3 loài vi khuẩn gồm Pasteurella multocida, Salmonella sp., và Escherichia coli
làm ựối chứng âm.
- Kháng nguyên chuẩn Mycoplasma gallisepticum do Viện Thú y Hàn Quốc sản xuất.
- Dụng cụ phục vụ mục ựắch lấy mẫu bệnh phẩm: Panh, kéo, dao mổ, tăm bông, ống lấy mẫu, túi ựựng bệnh phẩm, bơm tiêm, phiến kắnh, bút viết kắnh, găng tay, ựá khô, hộp bảo quản mẫu.
- Dụng cụ sử dụng cho việc nuôi cấy, phân lập và giám ựịnh ựặc tắnh sinh học của vi khuẩn: panh, kéo, bông cồn, ựèn cồn, que cấy, hộp lồng, ống nghiệm.
- Dụng cụ sử dụng cho phương pháp PCR: que cấy, micropipet, micopipet tip, găng tay không bột, ống eppendoft.
- Môi trường, hóa chất sử dụng cho phân lập, giám ựịnh ựặc tắnh
Mycoplasma và các loại vi khuẩn cộng phát ở ựường hô hấp: nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch socola, MacConkey, Briliant Green, EMB,... và các loại ựường dùng cho phản ứng sinh hóa do hãng Oxoid của Anh sản xuất. Các loại môi trường lỏng và ựặc thắch hợp cho sự phát triển của Mycoplasma gallisepticum là môi trường Frey ựược chuẩn hóa theo quy trình của tổ chức dịch tễ thế giới.
+ Môi trường Frey dành cho phân lập MG:
Môi trường nước thịt (Mycoplasma Broth - MB)(1000 ml): Thành phần A: Môi trường nước thịt gồm:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 26
PPLO broth base ( Difco) 21g Nước cất hoặc nước khử ion 700ml
Hấp ở 121oC/15 phút, sau ựó làm mát ựể bổ sung vào thành phần B. Thành phần B:
Huyết thanh lợn (ngựa) ủ ở 56oC/30h 150ml 25% fresh yeast extract 100ml
Glucose 10 gr
1% NAD 10 ml
Thallium acetate 10ml 200.000 UI penicillin G 5ml 1% dung dịch phenol ựỏ 2ml
điều chỉnh pH ở 7,6 ọ 7,8, lọc qua màng lọc 0,2ộm, bảo quản ở 40C hoặc tủ lạnh âm sâu với thời gian lâu hơn.
Môi trường thạch (Mycoplasma Agar- MA) (1000 ml): Phần 1:
Bactor agar 12 g
Nước cất 500 ml Hấp ở 1210/15 phút. Phần 2:
Nước cất 300 ml
PPLO broth base (Difco) 21 g Huyết thanh lợn ( ủ ở 56oC/3h) 120m
(nếu dùng huyết thanh lợn 200 ml)
25% fresh yeast extract 50ml
Glucose 10 gr
1% NAD 10 ml
Thallium acetate 5% 5 ml 200.000 IU penicillin G 5ml
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 27
1% dung dịch phenol ựỏ 2ml
Chỉnh pH = 7,6 ọ 7,8, lọc qua màng lọc 0,2 ộm, giữ ở 560C/5 phút. Sau khi hoàn thiện trộn ựều phần 1 và phần 2, ựổ ựĩa.
Chế Fresh Yeast Extract 25%:
Cho 400 ml vào bình lớn (2 lắt)
Nhỏ từ từ Nitten Dry Yeast (100g), lắc hoặc dùng khuấy từ làm tan ựều đun cách thủy ở nhiệt ựộ 800C trong vòng 20 phút
Làm lạnh
Ly tâm 12.000 v/p trong vòng 20 phút ở 200C
Lấy phần nước trong, chỉnh pH = 7 (dùng NaOH 1N)
Lọc vô trùng qua màng lọc 0,4 ộm (lần 1) rồi ựến 0,2ộm (lần 2), bảo quản ở tủ lạnh - 200C.
Quan sát tắnh chất mọc của vi khuẩn ở các môi trường MA và MB. Vi khuẩn phát triển làm thay ựổi ựộ môi trường MB từ ựỏ sang da cam, và cuối cùng là màu vàng. Trên môi trường MA khuẩn lạc phát triển có dạng trứng ốp lếp. Nhiệt ựộ nuôi cấy thắch hợp là 370C với 5%CO2.
+ Môi trường dùng cho các phản ứng sinh hóa:
0,5% Glucose trong nước thịt PPLO (MB) + 0,002% phenol red, pH = 7,8.
0,2% Arginine trong MB + 0,02% phenol red, pH = 6,8 0,02% Tetrazolium chlorid (TTC) trong MB
0,01% Phenolphtalein diphosphate, muối natri (PHO) trong MB 0,002 phenol red trong MB, pH = 7,5
- Môi trường, vật liệu, hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR: Kắt ỘQIAamp ADN Kit mini prepsỢ của hãng QIAGEN, dung dịch ATL, protease K, dung dịch AL, cồn tuyệt ựối dung dịch AW1, AW2, ựệm AE.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
Cặp mồi ựặc hiệu ựược sử dụng trong phản ứng PCR có trình tự như sau: Mồi xuôi MG14F: 5′-GAGCTAATCTGTAAAGTTGGTC-3′: mồi ngược MG13R: 5′-GCTTCCTTGCGGTTAGCAAC-3′. Cặp mồi này ựược thiết kế trên trình tự gene 16S rRNA ựặc hiệu cho Mycoplasma gallisepticum (OIE., 2008). Gel 1,5% agarose (ABgene, UK) ựược chuẩn bị trong dung dịch ựệm 1x TAE (10 mM Tris, 5 mM acetate, 0.1 mM EDTA).
- Trang thiết bị, máy móc sử dụng cho nghiên cứu vi sinh vật: tủ ấm 370C, tủ ấm CO2, tủ sấy, nồi hấp, ựèn tử ngoại, cân ựiện tử, kắnh hiển vi, máy ly tâm, máy lắc, máy ổn nhiệt.
- Trang thiết bị, máy móc sử dụng cho phản ứng PCR: máy siêu ly tâm, máy nhân gen, máy ựiện di, máy chụp ảnh UV, tủ lạnh âm sâu (- 860C), tủ lạnh thường, buồng cấy an toàn sinh học (Biosafety cabinet).