2.4.1. Phương pháp làm phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh ựể phát hiện kháng thể Mycoplasma gallisepticum
Phản ứng dựa trên nguyên lý: kháng nguyên Mycoplasma gallisepticum
khi gặp kháng thể ựặc hiệu sẽ kết hợp với nhau tạo thành mạng lưới ngưng kết mắt thường nhìn thấy ựược. Dùng kháng nguyên chuẩn ựể tìm kháng thể có trong huyết thanh của gà nghi mắc bệnh.
- Huyết thanh của gà ựược lấy ngẫu nhiên trong ựàn gà bản ựịa ở các giống, các lứa tuổi khác nhau.
- Cách lấy máu: Dùng bơm tiêm lấy máu tĩnh mạch cánh (0,5 - 1ml), sau ựó bơm từ từ lên thành ống nghiệm, ựậy nút ựể nghiêng 450, ựể yên cho máu ựông, các mẫu máu mang về phòng thắ nghiệm ựể ở tủ lạnh 40C trong 2h, sau ựó chắt lấy huyết thanh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29
- Kháng nguyên chuẩn Mycoplasma gallisepticum do Viện Thú y Hàn Quốc sản xuất. Kháng nguyên phải ựảm bảo ựúng tiêu chuẩn: không có hạt hoặc kết tủa.
- Kháng thể chuẩn Mycoplasma gallisepticum do Viện Thú y Hàn Quốc chế tạo, ựựng trong ống thủy tinh 0,1ml, kháng thể ựược bảo quản ở - 200C.
Trước khi làm phản ứng, kháng nguyên và kháng thể phải ựược ựể ở nhiệt ựộ phòng, kháng nguyên phải lắc nhẹ cho ựều.
Tiến hành phản ứng:
- đối chứng dương: giữa kháng nguyên chuẩn Mycoplasma gallisepticum
và kháng thể chuẩn khi kết hợp với nhau sau 1 ọ 2 phút xuất hiện ngưng kết ựiển hình, hạt ngưng kết màu xanh lấm tấm, nước xung quanh trong.
- đối chứng âm: giữa kháng nguyên chuẩn Mycoplasma gallisepticum
với nước sinh lý không có hiện tượng ngưng kết và dung dịch vẫn giữ màu như cũ.
- Thắ nghiệm ựược tiến hành trên phiến kắnh sạch vô trùng.
- Nhỏ lên phiến kắnh 01 giọt kháng nguyên, sau ựó nhỏ tiếp 01 giọt huyết thanh cần chẩn ựoán, trộn ựều thành vòng tròn.
- Sau khi trộn 1 ựến 2 phút ựọc kết quả.
- Phản ứng dương tắnh: Mycoplasma gallisepticum tập trung thành từng ựám màu xanh, nước xung quanh trong tương tự như ựối chứng dương. Kết luận gà nhiễm Mycoplasma gallisepticum.
Phản ứng âm tắnh: Sau khi trộn 2 ọ 5 phút không có hiện tượng ngưng kết, dung dịch giữ màu như cũ.
2.4.2. Phương pháp xác ựịnh bệnh CRD qua chẩn ựoán lâm sàng và giải phẫu bệnh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30
Trong nghiên cứu về bệnh CRD, ựể nâng cao ựộ tin cậy trong xác ựịnh ca bệnh, phương pháp chẩn ựoán lâm sàng và giải phẫu bệnh dựa vào triệu chứng, bệnh tắch ựặc trưng ựược tiến hành ở những ựàn gà có kết quả dương tắnh với phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh.
Những gà nghi mắc CRD là những gà thuộc ựàn gà có kết quả dương tắnh với phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh và có những biểu hiện về triệu chứng lâm sàng (thể trạng gầy, thở khò khè, chảy nước mũi, sưng khớp) ựồng thời khi mổ khám có biểu hiện bệnh tắch ựại thể ựặc trưng: tắch dịch ở khắ quản, viêm phổi và ựặc biệt là viêm túi khắ.
2.4.3. Phương pháp xác ựịnh một số ựặc ựiểm dịch tễ học CRD ở gà bản ựịa
- Phương pháp ựiều tra: sử dụng phiếu ựiều tra và phân tắch số liệu dịch tễ theo Toma và cộng sự (1999).
- Phương pháp ựiều tra dịch tễ học hồi cứu và dịch tễ học mô tả ựể thu thập thông tin bệnh tại những thời ựiểm khác nhau.
- Xử lý thông tin ựiều tra ựể xác ựịnh một số ựặc ựiểm dịch tễ học bệnh CRD ở gà bản ựịa theo: giống gà, lứa tuổi, hình thức chăn nuôi, tháng và ựịa bàn chăn nuôi.
2.4.4. Phân lập Mycoplasma gallisepticum từ mẫu bệnh phẩm gà nghi mắc CRD
-Bệnh phẩm: họng, khắ quản, phổi của gà nghi mắc bệnh CRD.
- Cách lấy bệnh phẩm: Trước khi mổ dùng kéo nhọn hoặc dao mổ cắt ựứt phắa sau gáy ựể gà phóng tiết và giết gà tránh dãy dụa, không cắt vào cổ gà vì có thể làm ựứt khắ quản, máu sẽ vào khắ quản và phổi gây khó khăn cho việc quan sát bệnh tắch sau này. Sau ựó ựặt ngửa gà trên bàn mổ, dùng kéo cắt một ựường từ miệng xuống xương ức ựể bộc lộ khắ quản, cắt một ựường thứ hai từ bụng vòng sang hai bên sườn tới ựầu xương ức, dùng tay lật ngược
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
khối cơ ngực, bộc lộ toàn bộ khắ quản, nội tạng bên trong.
Lấy khắ quản: dùng kéo cắt ựầu trên và ựầu dưới khắ quản, nhẹ nhàng tách khắ quản ra khỏi cổ gà.
Lấy phổi ra khỏi lồng ngực: chú ý tránh dập nát, dùng ựầu pink không mấu tách phổi ra khỏi lồng ngực, sau ựó dùng pink kẹp vào hai bên cuống phổi lấy từng bên phổi.
Bệnh phẩm một phần ựược ựem ra xét nghiệm ngay ựể phân lập
Mycoplasma và vi khuẩn kế phát cư trú ở ựường hô hấp. Phần còn lại ựược bảo quản trong tủ lạnh - 200C.
- Nuôi cấy Mycoplasma và giám ựịnh ựặc tắnh sinh vật và hóa học: + Môi trường Frey dành cho phân lập Mycoplasma:
Quan sát tắnh chất mọc của vi khuẩn ở các môi trường MA và MB. Vi khuẩn phát triển làm thay ựổi môi trường MB từ ựỏ sang da cam, và cuối cùng là màu vàng. Trên môi trường MB khuẩn lạc phát triển có dạng trứng ốp lếp. Nhiệt ựộ nuôi cấy thắch hợp là 370C với 5%CO2.
+ Sử dụng môi trường dùng cho các phản ứng sinh hóa
Chia vào các lọ khoảng 3ml môi trường các loại, sau ựó nhỏ vào mỗi lọ 6 giọt canh trùng. Ủ 370C từ 5 ọ 14 ngày. Kết quả phản ứng như sau:
Glucose: Dương tắnh: Môi trường chuyển màu vàng Âm tắnh: Môi trường không chuyển màu
Arginine: Dương tắnh: Môi trường chuyển màu hồng tươi hoặc tắa Âm tắnh: Môi trường không chuyển màu
TTC: Dương tắnh: Môi trường chuyển màu hồng tươi Âm tắnh: Môi trường không chuyển màu
Phương pháp phân lập và giám ựịnh Mycoplasma theo tiêu chuẩn của Tổ chức dịch tễ thế giới OIE (2004) ựược thực hiện tại Bộ môn Vi sinh vật Ờ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
Quy trình phân lập, giám ựịnh Mycoplasma tại bộ môn VSV - TN:
Mẫu bệnh phẩm
Nghiền
(1gr mẫu + 5ml BHI), lọc qua màng lọc 0,45 ộm
Cắt nhỏ (1gr mẫu + 5ml BHI) ựảo ựều ựến khi hỗn dịch sánh
ựều (ựến 15 phút)
Hút 100ộl hỗn dịch vào ống môi trường MB (1 ml) trộn ựều rồi hút 100ộl sang các ống MB tiếp theo ựến ống thứ 5 (pha loãng ựến 10-5)
Sau 1 Ờ 2 ngày môi trường chuyển màu nhiễm khuẩn
Sau 1 Ờ 2 ngày môi trường không chuyển màu nuôi tiếp ựến 5 Ờ 7 ngày
Cấy chuyển sang môi trường MB và MA
Sau 5 Ờ 7 ngày, lọc qua màng lọc
0,45 ộm Môi trường chuyển màu vàng
Khuẩn lạc ựiển hình giống
Mycoplasma
Chuyển vào nước thịt PPLO 3 Ờ 5 ngày mọc
Chia vào các lọ nhỏ + 50% Glycerol giữ ở -800C Tiến hành các
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
2.4.5. Giám ựịnh Mycoplasma gallisepticum bằng phản ứng PCR
Tách chiết ADN
ADN của vi khuẩn Mycoplasma gallisepticum ựược tách chiết theo Kắt ỘQIAamp ADN Kit mini prepsỢ của hãng QIAGEN. Các bước ựược tiến hành theo sự chỉ dẫn của Kắt. Cụ thể:
100ộl mẫu ựược bổ sung thêm 260ộl dung dịch ATL, trộn ựều mẫu và sau ựó bổ sung thêm 30ộl protease K, ủ 56ỨC trong 3 giờ. Sau khi ủ mẫu, bổ sung tiếp 200ộl dung dịch AL, trộn ựều mẫu và sau ựó tiếp tục ủ mẫu ở 70ỨC trong 10 phút.
Ly tâm nhanh và bổ sung 200ộl cồn tuyệt ựối, trộn ựều mẫu trong 15 giây và ly tâm nhanh cho dịch không còn bám trên nắp và thành ống.
Tiếp theo huyễn dịch ựược chuyển lên cột (column) (ựược cung cấp kèm theo kit), ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút.
Chuyển cột sang ống tube mới, bổ sung 500ộl dung dịch AW1, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút.
Sau khi ly tâm, chuyển cột sang ống tube mới khác, bổ sung thêm 500ộl dung dịch AW2, ly tâm 13.500 vòng/phút trong 3 phút. Tiếp tục chuyển cột sang ống tube mới, ly tâm với tốc ựộ tối ựa của máy trong 1 phút ựể loại bỏ hoàn toàn dịch còn lại trên cột. Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml, bổ sung 30ộl ựệm AE, ựể nhiệt ựộ phòng 1 phút, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút ựể thu dung dịch ADN.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
* Phản ứng PCR
Cặp mồi ựặc hiệu ựược sử dụng trong phản ứng PCR có trình tự như sau: Mồi xuôi MG14F: 5′-GAGCTAATCTGTAAAGTTGGTC-3′: mồi ngược MG13R: 5′-GCTTCCTTGCGGTTAGCAAC-3′. Cặp mồi này ựược thiết kế trên trình tự gene 16S rRNA ựặc hiệu cho Mycoplasma gallisepticum
(OIE., 2008).
Thành phần phản ứng PCR gồm có 2,5 ộl dung dịch ựệm 10x; 1,5 ộl MgCl2 (50 mM); 0,5 ộl dNTPs (10mM); 0,25 ộl Taq ADN polymerase 5UI/ộl; 14,75 ộl nước; 1,5 ộl mồi xuôi và 1,5 ộl mồi ngược (15 pmol); 2,5 ộl ADN sợi khuôn.
Phản ứng PCR ựược thực hiện theo chương trình: 94ồC/5 phút; 35 chu kỳ (94ồC/1 phút; 52ồC/1 phút; 68ồC/1 phút); 68ồC/10 phút.
đọc kết quả
10 ộl sản phẩm PCR ựược chạy ựiện di trên gel 1.5% agarose (ABgene, UK) ựược chuẩn bị trong dung dịch ựệm 1x TAE (10 mM Tris, 5 mM acetate, 0.1 mM EDTA).
Kết quả ựiện di ựược ghi nhận bằng máy ựọc GelDoc (BioRad, Mỹ). Marker ADN chuẩn (ADN MW MARKER, 100 BP LADDER, AMRESCO LLC, USA) ựược chạy chung với mẫu ựể xác ựịnh kắch thước sản phẩm PCR.
Mẫu cho kết quả dương tắnh khi sản phẩm PCR có kắch thước là 185 bp.
2.4.6. Phương pháp phân lập vi khuẩn kế phát ở bệnh phẩm gà mắc CRD
Sử dụng phương pháp phân lập vi khuẩn trên các môi trường phổ thông và môi trường ựặc hiệu: nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch MacConkey, Briliant Green, EMB...
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
Vi khuẩn hình cầu hoặc hình bầu dục, xếp thành chuỗi, ựường kắnh 0,5 ọ 1ộm bắt màu gram dương.
Trong môi trường nước thịt: pH = 7,6 - 7,8 vi khuẩn mọc tốt, môi trường ựục, sau ựó lắng xuống dưới ựáy làm màu môi trường trong và ựáy ống nghiệm có cặn.
Trên môi trường thạch thường, Streptococcus phát triển hình thành khuẩn lạc dạng S, màu trắng nhạt, trơn, nhẵn, tròn, nhỏ.
Tắnh chất khuẩn lạc trên môi trường thạch máu cừu 5%: khuẩn lạc tròn nhỏ kắch thước 0,5 ọ 1mm, bóng ướt, trắng xám, gây tan huyết dạng α.
Phương pháp nhận biết Pasteurella multocida:
Vi khuẩn có hình trứng hoặc hình bầu dục, hai ựầu tròn, kắch thước từ 0,2 ọ 0,4ộm x 0,4 ọ 1,5ộm. Vi khuẩn bắt màu gram âm.Trên tiêu bản làm ở canh trùng thấy vi khuẩn ựứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi ngắn.
Trên môi trường nước thịt: sau khi nuôi cấy vi khuẩn 24h, môi trường ựục vừa, lắc thấy hiện tượng vẩn sương mù, ựáy ống có cặn nhày, có khi sinh ra một lớp màng mỏng trên bề mặt, môi trường có mùi tanh.
Trên môi trường thạch thường: sinh khuẩn lạc dạng S, nhỏ li ti giống hạt sương.
Môi trường thạch máu: vi khuẩn không gây dung huyết thạch máu.
Phương pháp nhận biết E. coli:
Vi khuẩn hình gậy ngắn, 2 ựầu tròn, kắch thước 0,6 ừ 2 ọ 3ộm, ựứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi ngắn, bắt màu gram âm.
Trong môi trường nước thịt: nuôi cấy vi khuẩn E. coli sau 24h môi trường ựục ựều, có lắng cặn màu tro nhạt, có mùi thối của phân.
Trên môi trường Macconkey: vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc màu hồng cánh sen.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
hơi lồi, tròn, ướt, không trong suốt, có màu tro trắng.
Trên môi trường Kligler: môi trường chuyển thành màu vàng, có sinh hơi ựẩy thạch khỏi ựáy ống nghiệm.
- Kiểm tra ựặc tắnh sinh hóa ựịnh danh vi khuẩn:
Tiến hành giám ựịnh lại các vi khuẩn bằng các phản ứng lên men ựường (glucoza, lactoza, manitol, saccaroza,...), phản ứng sinh indol, H2S,... tùy thuộc vào loại vi khuẩn cần kiểm tra.
2.4.7. Phương pháp xác ựịnh khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn
Thực hiện theo phương pháp của Kirby Bauer (1966):
- Các chủng vi khuẩn phân lập ựược cấy vào môi trường nước thịt BHI, bồi dưỡng ở 370C/ 24h. Lấy 2 ọ 3 khuẩn lạc, hòa vào 1,5 ml nước sinh lý ựể ựạt ựộ ựục 0,5 trong dãy so màu McFarland.
- Chuẩn bị thạch ựĩa Mủller - Hinton, ựể tủ ấm 10 ọ 20 phút trước khi dùng. Lấy 0,1 ml canh khuẩn cần kiểm tra, nhỏ vào ựĩa thạch, láng ựều, rồi ựể ựĩa thạch từ 3 ọ 5 phút cho khô nhưng không ựể quá 25 phút.
- đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh cần kiểm tra của hãng Oxoid (Anh) lên mặt thạch.
- đặt ựĩa thạch ở ựiều kiện 370C trong 18 ọ 24 giờ rồi ựọc kết quả bằng cách ựo ựường kắnh vòng vô khuẩn. Kết quả ựược ựánh giá :
+ đường kắnh trung bình của vòng vô khuẩn từ 20 mm trở lên, ựánh giá rất mẫn cảm.
+ đường kắnh trung bình của vòng vô khuẩn từ 15 ọ 19 mm, ựánh giá mẫn cảm trung bình.
+ đường kắnh trung bình của vòng vô khuẩn từ 10 ọ 14 mm, ựánh giá ắt mẫn cảm.
2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê sinh học sử dụng phần mềm Excel 2007, Minitab 16 và WinEpiscope 2.0.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
Phần III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN