2.2.3.1. Phương pháp chiết pha rắn [5]
a. Khái niệm
Chiết pha rắn (SPE) là một phương pháp chuẩn bị mẫu để làm giàu và làm sạch mẫu phân tích từ dung dịch thông qua khả năng hấp phụ và tách chất cần phân tích trên chất hấp phụ chứa trong cột tách pha rắn; chất phân tích được tách và rửa giải ra khỏi cột tách bằng dung môi thích hợp. Cơ chế tách chất khác nhau dựa trên quá trình lưu giữ và tách chất trên các pha đảo, pha thường hoặc trao đổi ion.
Ưu điểm của phương pháp SPE là khả năng làm giàu mẫu cao, giúp loại bỏ ảnh hưởng của các chất gây nhiễu, quy trình thực hiện dễ tựđộng hoá, phù hợp với phân tích sắc ký và giảm lượng dung môi sử dụng so với phương pháp chiết lỏng - lỏng thông thường.
Cột SPE có nhiều dạng nhưng loại thường sử dụng là những cột nhỏ có dạng thân ống tiêm, bên trong nhồi các pha tĩnh. Pha tĩnh nhồi vào cột chiếm bề dày cột khoảng 0,5 - 2cm, lượng sử dụng từ 100mg đến 1g, trong một số trường hợp có thể
lên đến vài gram. Trong cột có 2 đĩa thuỷ tinh xốp giúp giữ pha tĩnh để không cho chúng đi ra khỏi cột theo dung môi và giữ cho cột ổn định.
Cột SPE có 3 loại:
- Loại chứa các pha tĩnh như C18, C8, C4, C2, cyclophenyl... được gắn trên hạt silic oxit tạo thành các mạch không phân cực. Các mạch gắn trên SiO2 thực hiện chức năng tách các chất không phân cực hay ít phân cực.
- Loại chứa các chất tách như silica, florisil, amino alumina,... có gắn các nhóm chức như -OH, -NH2, -CN dùng chủ yếu để tách các chất tương đối phân cực. Phần lớn được sử dụng để tách chiết trong điều kiện pha thường (cột ghép –CN có thể sử dụng trong pha đảo).
- Loại chứa nhựa trao đổi ion để tách các hợp chất ion (cột SAX tách anion, cột SCX tách cation).
c. Các bước tiến hành trong quá trình chiết pha rắn:
Bước 1: Hoạt hoá pha tĩnh
Cho dung môi thích hợp chảy qua pha tĩnh để thấm ướt vật liệu nhồi và để
solvat hoá các nhóm chức của chất hấp phụ, đồng thời loại bỏ không khí và các chất bẩn trong cột.
Để hoạt hoá cột có thể sử dụng hai dung môi có khả năng chiết tách mạnh: - Dung môi 1: có khả năng chiết tách mạnh hơn hoặc bằng khả năng chiết tách của dung môi sẽ được sử dụng cuối cùng để rửa giải hết các chất phân tích ra khỏi cột.
- Dung môi 2: có khả năng tách chiết yếu hơn, hoà tan dễ dàng trong dung môi 1. Dung môi 2 này có khả năng chiết tách chất gần bằng dung môi 3 (dung môi
để hoà tan hỗn hợp chất cần phân tích).
Trong quá trình hoạt hoá cột không được để cột bị khô dung môi. Bước 2: Cho mẫu chảy qua cột.
Hoà tan mẫu phân tích vào dung môi 3 (dung môi 3 phải có khả năng chiết tách yếu đối với chất phân tích được giữ lại trên cột SPE) rồi dội mẫu qua cột. Trong quá trình này chất phân tích được giữ lại trên cột. Dung môi và phần lớn tạp chất được rút từ từ ra khỏi cột dưới tác dụng của áp suất thấp tạo bởi bơm chân không.
Bước 3: Rửa các tạp chất gây ảnh hưởng ra khỏi cột
Quá trình này sẽ loại bỏ tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại chất phân tích. Nếu mẫu hoà tan trong nước thì nên sử dụng dung dịch đệm hoặc hỗn hợp nước- dung môi hữu cơ. Nếu mẫu hoà tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa các tạp chất ra khỏi cột cần sử dụng chính dung môi hữu cơ này.
Bước 4: Giải hấp chất phân tích khỏi cột
Tách từ từ cấu tử các chất phân tích ra khỏi cột bằng dung môi 1 hoặc những dung môi thích hợp có khả năng chiết tách chất theo hướng tăng dần. Trường hợp dung môi dùng để giải hấp không tan trong dung môi đã sử dụng để rửa tạp thì phải rút chân không nhẹđể làm khô cột trước khi cho dung môi giải hấp vào.
Về nguyên tắc không nên sử dụng dung môi có khả năng chiết tách quá mạnh vì có thể lôi kéo theo cả những tạp chất không mong muốn trong quá trình giải hấp. Ngược lại nếu khả năng chiết tách của dung môi quá yếu thì sẽ phải sử
dụng một lượng dung môi lớn thì mới có thể giải hấp hết các chất phân tích trên cột. Do thuốc bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ là những chất không phân cực hoặc ít phân cực nên trong đề tài này sẽ sử dụng cột chiết pha rắn là cột C18.
2.2.3.2. Phương pháp sắc ký cột
Để phân tích thuốc BVTV bằng phương pháp sắc ký khí trong các đối tượng mẫu mật ong khác nhau (có thành phần cấu tử trong mẫu phân tích rất phức tạp) thì cần phải được tiến hành bước làm sạch nhằm loại bỏ các cấu tử gây cản trở phân tích (phần lớn lượng tạp chất đi kèm theo thuốc BVTV cần phân tích). Tạp chất trong mẫu có thể gồm các amin, phenol, axit hữu cơ, đường, dầu thực vật, chất màu, diệp lục… các chất này gây ảnh hưởng đến khả năng phát hiện của detectơ ECD. Vì vậy quá trình làm sạch các cấu tử gây cản trở có trong dịch chiết mẫu là giai đoạn
bắt buộc khi phân tích hóa chất BVTV bằng phương pháp GC sử dụng detectơ
ECD. Quá trình làm sạch dịch chiết được thực hiện trên sắc ký cột.
Để loại bỏ tiếp tục các tạp chất trong dịch chiết mẫu đã tách trên cột chiết pha rắn cần sử dụng cột sắc ký hấp phụ. Những cột này chứa chất hấp phụ ổn định về tính chất, kích thước hạt đồng nhất, hoạt độ phù hợp với tách chất.
Các chất hấp phụ dùng cho giai đoạn làm sạch thường là nhôm oxit, magie silicat biến tính (florisil), silicagel không biến tính (silicagel thường), các polime,… Các vật liệu hấp phụ này có khả năng loại trừ các chất gây ảnh hưởng tới quá trình phân tích, đó là hợp chất béo, các hydrocacbon thơm, các hợp chất hữu cơ chứa Nitơ. Các chất hấp phụ được nhồi vào cột sắc ký có khóa điều chỉnh tốc độ dòng dung môi rửa giải. Các chất sau khi hấp phụ trên cột sắc ký sẽ được rửa giải bằng dung môi thích hợp.
Trong nghiên cứu này sử dụng cả 2 phương pháp để làm sạch trên để làm sạch mẫu: phương pháp chiết pha rắn và phương pháp sắc ký cột.
2.2.3.3. Làm giàu mẫu
Trong quá trình phân tích lượng vết các loại thuốc BVTV, do lượng chất quá nhỏ nên cần làm giàu chất cần xác định để tăng nồng độ chất bằng cách làm bay hơi dung môi tới thể tích phù hợp nhờ dòng khí N2 hoặc bằng cách chưng cất quay chân không.
2.2.3.4. Phương pháp phân tích sắc ký khí a. Nguyên lý
Đây là kĩ thuật tách chất từ hỗn hợp các cấu tử ở dạng hơi nhờ vào sự di chuyển khác nhau của chúng thông qua cột chứa pha tĩnh là chất lỏng hoặc rắn. Các chất cần tách di chuyển qua cột nhờ pha động ở dạng khí và chúng sẽ được phát hiện từ pha khí sau khi được rửa giải ra ở cuối cột. Bộ phận phát hiện tín hiệu sẽ
sinh ra một tín hiệu điện, được khuếch đại và được ghi lại dưới dạng sắc đồ biểu diễn nồng độ các cấu tử cần tách theo thời gian [17].
Hình 2.1. Sơđồ khối của máy sắc ký khí[7]
Khối I: khối này gồm các thiết bị dùng để tách các cấu tử trong hỗn hợp cần phân tích ra khỏi nhau, gồm hệ sắc ký và các bộ phận vận hành sắc ký.
Hệ sắc ký gồm: 1- Cột sắc ký
2- Bom chứa pha động (khí mang) Các bộ phận vận hành sắc ký:
3- Bộ phận điều chỉnh tốc độ pha động 4- Bộ phận bơm mẫu và buồng bơm mẫu 5- Bộ phận điều nhiệt
Khối II: bao gồm các thiết bị và bộ phận nhận biết cấu tử ra khỏi cột và nhận biết kết quả. Trong đó:
D: Detectơ (bộ phận nhận biết chất), là một máy phân tích hoàn chỉnh, cho biết từng chất hoặc nhóm chất ra khỏi cột với tín hiệu tỉ lệ với hàm lượng tương
ứng.
6- Bộ phận phân tích sắc đồ 7- Bộ phận ghi sắc đồ
c. Nguyên tắc vận hành của sắc ký khí
Bộ phận quan trọng nhất của máy phân tích sắc ký là hệ thống cột tách và detectơ. Nhờ có khí mang chứa trong bom mà mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký diễn ra tại đây, sau khi các cấu tử rời bỏ cột tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detectơ, tại
khuếch đại rồi chuyển sang bộ phận ghi hoặc chuyển sang phân tích kế có máy tính, tín hiệu được xử lý ở đó và chuyển sang bộ phận ghi kết quả. Trên sắc đồ nhận
được từ bộ phận ghi, ta có các tín hiệu ứng với các cấu tử cần tách ra gọi là píc [7]. Thời gian lưu là đại lượng đặc trưng cho các cấu tử cần tách, được dùng để định tính, còn diện tích píc là thước đo định lượng cho từng cấu tử trong hỗn hợp nghiên cứu. Trong sắc ký khí, người ta cần dạng píc không bị biến dạng nhiều nhằm xác định chính xác đỉnh píc, đối với phân tích định lượng, yêu cầu đặt ra cao hơn:
độ lặp lại, độ so sánh tốt, độ chính xác cao [7].
Hiện nay, phương pháp phân tích sắc ký khí được sử dụng rộng rãi bởi vì khả
năng tách cao và tính sẵn có của detectơ chọn lọc như detectơ cộng kết điện tử
(ECD), detectơ dẫn nhiệt (TCD), detectơ ion hóa ngọn lửa (FID), detectơ nitơ phốt pho (NPD), và detectơ ghép khối phổ (MSD) [12]. Để xác định các thuốc BVTV cơ
clo, phương pháp phân tích phù hợp nhất và được lựa chọn trong nghiên cứu này là phương pháp sắc ký khí detectơ cộng kết điện tử.
Detectơ cộng kết điện tử (ECD) hoạt động dựa trên đặc tính các chất có khả
năng cộng kết điện tử trong pha khí. ECD là một dạng của detectơ ion hoá, các ion
được tạo ra bởi một nguồn phóng xạ như 3H hoặc 63Ni, chúng phá ra các hạt β, các hạt này ion hoá các chất (chẳng hạn như khí mang N2 + β → N2+ + 2 e) và tạo ra một dòng điện nền. Khi các chất có khả năng bắt điện tử đi qua, chúng sẽ bắt giữ điện tử làm giảm đường nền và gây ra các tín hiệu tương ứng. ECD rất chọn lọc với các nguyên tố có độ âm điện cao như halogen, sulfua và những chất có cấu trúc chưa no [17].
d. Định tính và định lượng
- Định tính: trên sắc đồ nhận được sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tửđược tách gọi là píc. Người ta sử dụng yếu tốđặc trưng là thời gian lưu của các cấu tửđể
nhận diện chúng, bằng cách so sánh thời gian lưu của cấu tử cần xác định với thời gian lưu của chất chuẩn. Việc nhận diện một cấu tử chính xác hay không phụ thuộc vào sự giống nhau của mẫu phân tích so với mẫu chuẩn và chỉđược khẳng định khi thời gian lưu của chất cần phân tích trùng với giá trị thời gian lưu của chất chuẩn.
Trong nghiên cứu này, thời gian lưu của từng cấu tử trong chất chuẩn được xác định dựa vào tín hiệu ghi nhận bởi detectơ ECD.
- Định lượng: diện tích píc là thước đo định lượng các chất trong hỗn hợp nghiên cứu. Dựa vào mối tương quan giữa số đếm diện tích píc và nồng độ chất chuẩn sẽ dựng được đường ngoại chuẩn thể hiện mối tương quan này. Từ số đếm diện tích píc thu được của các mẫu phân tích và đường ngoại chuẩn sẽ xác định
được nồng độ chất cần nghiên cứu trong mẫu.
2.2.3.5. Tiến hành thực nghiệm a. Hóa chất
- Dung môi: Diclometan, n-Hexan, Etyl axetat, Metanol,… loại tinh khiết dùng cho sắc ký của các hãng Merck (Đức).
- H2SO4 98%, C2O3.
- Pha rắn C18, đường kính hạt khoảng 0,5 μm và đường kính lỗ rỗng 60 Å (Tomelloso, Tây Ban Nha), cột chiết pha rắn có dung tích 500 mg.
- Khí N2 có độ tinh khiết 99,9% và 99,999%.
- Nhôm oxit (Al2O3) trung tính pH = 6,5-7,5 có kích thước hạt 320 - 630 mesh của hãng Merck (Đức), diện tích bề mặt 155 m2/g, Al2O3 được sấy khô và hoạt hoá ở nhiệt độ 130oC trong 5 giờ.
- Các chất chuẩn và nồng độ của từng chất chuẩn: α-BHC (1,05 ppm); β- BHC (1,03 ppm); γ-BHC (1,033 ppm); δ-BHC (0,97 ppm); Hexachlorbenzen (1,053 ppm); Heptachlor (0,505 ppm); α-Chlordene (1,005 ppm); β-Chlordene (1,005 ppm); Oxychlordane (1,055 ppm); trans-Chlordane (1,025 ppm); cis-Chlordane (1,005 ppm); trans-Nonachlor (1,000 ppm); cis-Nonachlor (1,015 ppm); o,p’-DDE (1,038 ppm); p,p’-DDE (1,02 ppm); o,p’-DDD (1,033 ppm), p,p’-DDD (1,053 ppm); o,p’-DDT (1,04 ppm); p,p’-DDT (1,063 ppm). Các chất chuẩn được cung cấp từ Nhật Bản.
b. Thiết bị và dụng cụ
• Dụng cụ:
- Cốc thủy tinh thể tích 10 mL, 30 mL. - Các loại pipet 1 mL, 5 mL, 10 mL. - Ống nghiệm 10 mL.
- Lọ thủy tinh dung tích 30 mL có nút silicon.
- Cột sắc ký bằng thủy tinh có kích thước dài 30 cm, đường kính trong 0,6 cm có gắn van điều chỉnh tốc độ dòng.
Tất cả các dụng cụ thủy tinh sử dụng trong các thí nghiệm đều được làm sạch bằng cách ngâm trong dung dịch rửa (H2SO4đặc + Cr2O3) khoảng 24h. Sau đó tráng lại bằng nước cất hai lần và axeton, n-Hexan. Dụng cụ đã rửa được sấy ở nhiệt độ
2000C trong 2 giờ. Trước khi sử dụng được tráng 2 lần bằng n-Hexan.
• Thiết bị:
- Tủ sấy 300oC.
- Cân phân tích có độ chính xác ± 0,001 mg. - Máy cô cất quay chân không.
- Máy hút chân không. - Thiết bị chiết pha rắn.
- Syranh bơm mẫu Hamilton các loại: 10 µL;100 µL; 500 µL.
- Máy sắc ký khí HP 5890 của Mỹ với detectơ cộng kết điện tử (ECD), cột sắc ký mao quản HP5_MS dài 60 m, đường kính trong 0,25 mm, lớp phin pha tĩnh dầy 0,25 µm.
Điều kiện làm việc của máy sắc ký khí:
Trên cơ sở tham khảo tài liệu, quá trình thực nghiệm và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn chếđộ phân tích dư lượng thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trên máy GC/ECD như sau:
+ Nhiệt độ ban đầu là 900C giữ trong 1 phút; tăng đến 2500C với tốc
độ gia nhiệt là 150C/phút, giữ trong 10 phút; tăng đến 2700C với tốc độ gia nhiệt 80C/phút, giữ trong 2 phút. + Tổng thời gian chạy máy là 33,8 phút. - Nhiệt độ injectơ: 2700C - Nhiệt độ detectơ: 2600C - Khí mang Nitơ: 99,999% - Áp suất đầu cột: 20 psi - Bơm: Splitless, đóng van 0,3 phút - Bơm mẫu 1 µL
- Cột sắc ký mao quản HP5 MS dài 60 m, đường kính trong 0,25 mm, lớp phin pha tĩnh dầy 0,25 µm.
c. Xây dựng đường ngoại chuẩn
Đường ngoại chuẩn được sử dụng để xác định nồng độ thuốc BVTV trong các mẫu mật ong. Trong phương pháp này dùng chất chuẩn tinh khiết của chất cần xác định pha thành nhiều nồng độ khác nhau, dựng đường chuẩn theo số đếm diện tích píc trên sắc ký đồ và nồng độ chất chuẩn phân tích. Dựa vào đường ngoại chuẩn và số đếm diện tích píc của chất cần phân tích có thể xác định được nồng độ
chất cần phân tích.
• Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp chất chuẩn:
- Dùng syranh Hamilton lấy chính xác 100µL hỗn hợp chất chuẩn gồm 19 chất
đã biết nồng độ của từng chất (gọi là C0): α-BHC; β-BHC; γ-BHC; δ-BHC; Hexachlorbenzen (HCB); Heptachlor; α-Chlordene; β-Chlordene; Oxychlordane; trans-Chlordane; cis-Chlordane; trans-Nonachlor; cis- Nonachlor; o,p’-DDE; p,p’-DDE; o,p’-DDD, p,p’-DDD; o,p’-DDT; p,p’- DDT pha loãng thành 1 mL bằng n-Hexan nhận được dung dịch C1.
- Lấy chính xác 500 µL dung dịch C1 pha loãng thành 1 mL bằng n-Hexan
- Lấy chính xác 500 µL dung dịch C2 pha loãng thành 1 mL n-Hexan được dung dịch C3.
- Cứ tiếp tục làm như trên cho đến khi được dung dịch hỗn hợp chất chuẩn C4, C5, C6, C7. Nồng độ mỗi chất trong dung dịch hỗn hợp chất chuẩn được thể