2.3.2.1. Phương pháp định lượng DEA bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Điều kiện chạy sắc kí:
Qua tham khảo tài liệu [29], điều kiện chạy sắc ký như sau:
− Thiết bị: Máy HPLC Agilent
− Cột sắc kí Zorbax SB – C18 với kích thước cột 150 x 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5 µm
− Pha động là hỗn hợp methanol : nước cất (70 : 30), siêu âm 20 phút
− Tốc độ dòng 1 ml/phút
− Nhiệt đô: 250C
− Thể tích tiêm 20 µl hoặc 100 µl
Để đảm bảo độ tin cậy của phương pháp HPLC trong định lượng DEA. Phương pháp xử lý và điều kiện chạy sắc ký được đánh giá thông qua các tiêu chí sau:
Tính tương thích
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần một dung dịch chuẩn DEA 10 µg/ml với điều kiện sắc ký ở trên. Ghi lại các giá trị về thời gian lưu và diện tích pic. Độ lặp lại của phương pháp được biểu thi bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic.
Độ chính xác
Cân 6 mẫu thử có khối lượng DEA chính xác khoảng 0,11g. Xác định sự lặp lại hàm lượng DEA trong 6 mẫu bằng cách tiến hành chạy sắc ký trong điều kiện đã chọn, so sánh với mẫu chuẩn có hàm lượng 10 µg/ml.
Độ đúng
Thêm chính xác 20% khối lượng chất chuẩn vào 6 mẫu thử ở trên.
Xác định sự lặp lại hàm lượng DEA trong 6 mẫu bằng cách tiến hành chạy sắc ký trong điều kiện đã chọn, so sánh với dung dịch chuẩn 10 µg//ml.
Độ tuyến tính
Pha các dung dịch chuẩn DEA trong pha động với các nồng độ 1; 2; 5; 10; 50 µg/ml. Lọc qua màng 0,45 µm. Tiến hành chạy sắc ký trong điều kiện đã chọn.
Xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối liên hệ giữa diện tích pic và nồng độ DEA.
2.3.2.2. Đánh giá kích thước và phân bố kích thước tiểu phân bằng máy Zetasizer Nano ZS90
Sử dụng máy phân tích kích thước hạt Zetasizer Nano ZS90. Mẫu được pha
loãng 100 lần bằng nước cất, đo ở điều kiện hệ số khúc xạ ánh sáng bằng 1,330, nhiệt độ 250
2.3.2.3. Đánh giá hình thái và kích thước hệ tiểu phân nano bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Hình thái và kích thước của các hệ tiểu phân trong hệ nano lipid được quan sát qua kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1010 có độ phóng đại M = x50 – x600.000, độ phân giải δ = 3Aº, điện áp gia tốc U = 40 – 100 kV.
Xử lí mẫu: Pha loãng hệ nano lipid 100 lần, nhỏ trên lưới đồng. Để khô bề mặt lưới đồng ở nhiệt độ phòng. Sau đó quan sát mẫu bằng kính hiển vi điện tử truyền qua.
2.3.2.4. Phân tích phổ nhiễu xạ tia X
Mẫu NLC sau khi được bào chế đem tiến hành đông khô trên thiết bị đông khô Labocono Freezone Triad 740030. Tiến hành chạy chương trình đông khô với các thông số: giai đoạn đông lạnh làm đông đặc mẫu ở nhiệt độ -650C trong 3 giờ. Giai đoạn làm khô sơ cấp: tăng dần nhiệt độ của mẫu lên -150
C với tốc độ 0,250
C/ phút, duy trì 24 giờ ở áp suất 0,15 mBar. Giai đoạn làm khô thứ cấp: tăng dần nhiệt độ của mẫu lên 250C với tốc độ 0,150C/phút, duy trì 24 giờ ở áp suất 0,15 mBar.
Nghiên cứu phổ nhiễu xạ tia X của nguyên liệu compritol, dexamethason (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
acetat và NLC-DEA đông khô được thực hiện trên máy nhiễu xạ tia X: SIEMENS
D5000 của phòng Nhiễu xạ tia X của Viện khoa học vật liệu thuộc Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia.
2.3.2.5. Đánh giá độ ổn định của các công thức nano lipid sau thời gian bảo quản
Độ ổn định KTTP được đánh giá ở 2 điều kiện sau:
− Điều kiện A: độ ổn định kích thước của các công thức NLC được đánh giá ở điều kiện 80C và 400C trong vòng 8 tuần.
− Điều kiện B: độ ổn định kích thước của công thức NLC được đánh giá sau 3 chu trình nhiệt lạnh (24 giờ ở 80
C và 24 giờ ở 400 C).
2.3.2.6. Xác định khả năng mang dexamethason acetat trong các tiểu phân nano lipid bằng phương pháp HPLC
Theo phương pháp tham khảo trong tài liệu [14], xác định lượng dexamethason acetat mang trong nano lipid bằng cách loại bỏ dexamethason acetat tự do và tính hiệu quả mang dược chất.
− Định lượng dexamethason acetat toàn phần:
Hút chính xác 1 ml nano lipid. Phân tán trong 5 ml Triton X100 (1%). Siêu âm bể trong 15 phút. Bổ sung thêm methanol vừa đủ 25 ml, tiếp tục siêu âm 15 phút. Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/ phút ở 40
C trong 30 phút. Lấy 1 ml dịch ở trên pha loãng 10 lần bằng dung dịch pha động, lọc qua màng 0,45µm và phân tích bằng
HPLC. Dung dịch chuẩn DEA có nồng độ 10 µg/ml.
− Định lượng lượng DEA trong nano lipid sau khi đã loại bỏ lượng tự do Loại bỏ lượng dexamethason acetat tự do bằng phương pháp thẩm tích.
Hút chính xác 1ml mẫu NLC, cho vào túi thẩm tích (12 – 14 kDa) rồi đặt vào trong môi trường 100 ml nước cất (pH = 7) giữ ở 80C và khuấy từ liên tục. Tại mỗi khoảng thời gian 30 phút hút ra 5 ml, sau đó lại bù lại bằng 5 ml nước cất (nhiệt độ 80C, pH = 7). Các mẫu được tiến hành đo quang ở bước sóng 240 nm. Tiếp tục thử như vậy, sau 3h thì thay 100 ml môi trường cũ bằng 100 ml môi trường mới tương tự, thử cho tới khi mật độ quang của dung dịch không tăng lên nữa.
Định lượng lượng DEA còn lại trong nano lipid sau khi thẩm tích loại bỏ lượng tự do.
Lấy lượng mẫu trong túi thẩm tích, tiến hành định lượng tương tự như định lượng DEA toàn phần.
• Công thức tính hiệu suất mang thuốc: HS mang thuốc (%) = Stt
Stp 100 Trong đó:
- Stt và Stp lần lượt là diện tích pic của dexamethason trong mẫu sau khi thẩm tích và trong mẫu toàn phần.
2.3.2.7. Đánh giá tính thấm của dexamethason acetat từ hệ tiểu phân nano lipid
• Điều kiện thử
Qua tham khảo tài liệu [16], [19], [21], thực hiện các thí nghiệm khảo sát sơ bộ và xét các điều kiện cơ sở vật chất hiện có, hàm lượng dexamethason acetat giải phóng từ hệ tiểu phân nano lipid được đánh giá qua màng Hanson Research với các điều kiện cụ thể như sau:
− Thiết bị: bình Franz
− Bình khuếch tán có thể tích V = 7 ml và diện tích thử 1,767 cm2
− Môi trường khuếch tán: hỗn hợp ethanol tuyệt đối : dung dịch đệm phosphat pH 7,4 theo tỷ lệ 1 : 1
− Màng khuếch tán: da vùng lưng chuột nhắt đực (khối lượng từ 20 – 25g), đã được xử lý loại lông và lớp mỡ dưới da bằng dao kéo phẫu thuật
− Tốc độ khuấy 400 vòng/phút, nhiệt độ thử 32,50C
− Khối lượng mẫu thử 1,0 g
• Cách thức tiến hành (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mang chính xác khoảng 1,0 g NLC-DEA vào ngăn cho của bình khuếch tán
Franz. Lấy mẫu ở các thời điểm t = 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7 và 8 giờ. Thể tích mỗi lần lấy mẫu là 0,25 ml. Quá trình lấy mẫu đồng thời cũng bổ sung một thể tích dung dịch môi trường mới bằng đúng thể tích môi trường đã lấy ra. Xác định lượng DEA bằng phương pháp HPLC rồi so sánh với mẫu chuẩn DEA nồng độ 10 µg/ml.
• Xác định hàm lượng DEA thấm qua một đơn vị diện tích da:
Lượng DEA thấm từ hệ nano sau khoảng thời gian t giờ (t = 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7 và 8 giờ) tính theo công thức: Xt = Cc Sc 1 Sm (V1 Sk + V2 ∑𝑘 𝑆 𝑡=2 Rt-1) Trong đó:
− Sc, Sk (k = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) lần lượt là diện tích pic của dung dịch chuẩn và dung dịch thử tại các thời điểm là 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7 và 8 giờ (mAU.s)
− Cc là nồng độ dung dịch chuẩn (µg/ml)
− V1 là thể tích môi trường có trong ngăn nhận (ml)
− V2 là thể tích môi trường lấy ra tại các thời điểm t (ml)
− Sm là diện tích da thử tính thấm (cm2 )
2.3.2.8. Định lượng hàm lượng DEA lưu giữ trên da sau 24 giờ
Theo tài liệu tham khảo [10], định lượng DEA lưu giữ trên da sau 24 giờ được tiến hành như sau:
Lấy diện tích da sau khi thử giải phóng thuốc ở trên, dùng bông tẩm dung dịch đệm phosphat pH = 7,4 rửa sạch 3 lần để loại bỏ lượng thuốc còn lưu lại trên bề mặt da. Sau đó cắt nhỏ da đem ngâm trong vừa đủ 10 ml methanol trong 24 giờ, siêu âm bể trong vòng 30 phút. Lấy dung dịch ở trên lọc qua màng 0,45µm và đem định lượng bằng HPLC, mẫu chuẩn DEA có nồng độ 10 µg/ml.
• Hàm lượng DEA lưu giữ trên 1 đơn vị diện tích da được tính theo công thức: Xd = Cc
Sc St 1
Sm10 Trong đó:
− Xd là hàm lượng dexamethason acetat còn lưu giữ trên 1 đơn vị diện tích da sau quá trình giải phóng thuốc (µg/cm2
)
− Sc, St lần lượt là diện tích pic của dung dịch chuẩn và dung dịch thử (mAU.s)
− Cc là nồng độ của dung dịch chuẩn (µg/ml)
− Sm là diện tích da (cm2)