mỏng
3.2.2.1. Chiết xuất phân đoạn từ dịch chiết cồn toàn phần rễ, thân, lá Đơn châu chấu
Cân 15g dược liệu đã tán nhỏ vào bình nón dung tích 250ml, cho thêm 100ml ethanol 900, chiết siêu âm trong 20 phút ở 600C, lọc qua giấy lọc thu được dịch chiết. Bốc hơi cách thủy, được cắn ethanol toàn phần.
Hòa tan cắn ethanol toàn phần vào một lượng nước vừa đủ, thu được dịch chiết nước. Đem dịch chiết nước lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethylacetat và n-butanol. Với mỗi loại dung môi lắc chiết ba lần, gộp các dịch chiết lại thu được ba phân đoạn. Loại nước bằng natri sulfat khan, cô cách thủy thu được các cắn tương ứng. Quy trình chiết xuất các phân đoạn được tóm tắt theo sơ đồ ở hình 3.10.
Bột dược liệu (15g)
+ Chiết siêu âm với ethanol 900
+to: 60oC, lọc.
Cất thu hồi dung môi Cắn EtOH toàn phần
+Nước (20ml).
+n-hexan (20ml×3lần).
Lớp nước Lớp n-hexan
Cất thu hồi dung môi + EtOAc
(20ml×3lần)
Lớp nước Lớp EtOAc
+n-butanol (20ml×3 lần) Cất thu hồi dung môi
Cô cách thủy Cất thu hồi dung môi
Hình 3.10. Sơ đồ quy trình chiết xuất phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần.
Dịch chiết EtOH toàn phần
Cắn n- hexan
Cắn EtOAc
Lớp nước Lớp n-butanol
Cắn n-butanol Cắn nước
3.2.2.2. Định tính cắn các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng
- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Các cắn phân đoạn được hòa tan trong methanol, thu được dịch chấm sắc ký.
- Bản mỏng Silicagel GF254 (MERCK) tráng sẵn, được hoạt hóa ở 1100
C trong 1h. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.
- Quan sát sắc ký đồ thu được sau khi khai triển với hệ dung môi thích hợp dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng λ= 366nm và λ= 254nm và sau khi phun thuốc thử (TT) hiện màu vaninlin 1% trong H2SO4 đặc.
- Ghi chú:
L: mẫu lá; T: mẫu thân; R: mẫu rễ
A: Sắc ký đồ (SKĐ) quan sát ở ánh sáng tử ngoại bước sóng λ=366nm B: SKĐ quan sát ở ánh sáng tử ngoại bước sóng λ=254nm
C: SKĐ quan sát ở ánh sáng trắng (AST) sau khi phun thuốc thử hiện màu bằng dd vanilin 1% trong H2SO4 đặc.
Mờ: (+); hơi đậm (++); đậm (+++).
Phân đoạn n-hexan
Các hệ dung môi:
Hệ 1: Chloroform – Ethylacetat –Acid formic (9: 1: 0,5) Hệ 2: Chloroform – Methanol – Acid formic (9: 1: 0,1) Hệ 3: Chloroform – Methanol – Acid formic ( 9,5 : 0,5: 0,1) Hệ 4: Toluen- Ethylacetat – Acid formic (7 : 6 : 1)
Sau nhiều lần khai triển, kết quả cho thấy hệ dung môi 3 tách tốt nhất, thu được hình ảnh SKĐ như hình 3.10.
A B C
Hình 3.11. SKĐ phân đoạn n-hexan với hệ dung môi khai triển Chloroform– Methanol–Acid formic (9,5 : 0,5: 0,1)
Kết quả định tính cắn phân đoạn n-hexan với hệ dung môi 3
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại tại bước sóng λ=366nm, thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả định tính cắn phân đoạn n-hexan với hệ dung môi 3 quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ=366nm.
STT Lá Thân Rễ Rf Màu Độ đậm Rf Màu đậm Độ Rf Màu Độ đậm 1 0,122 Xanh lá ++ 0,113 Xanh lá ++ 0,105 Xanh lá ++ 2 0,168 Đỏ ++ 0,171 Đỏ ++ 0,578 Xanh da trời + 3 0,253 Đỏ ++ 0,667 Xanh
4 0,331 Đỏ + 0,742 Xanh lá +++ 0,745 Xanh lá + 5 0,673 Đỏ + 0,765 Đỏ + 6 0,740 Đỏ +++ 0,843 Đỏ + 7 0,772 Đỏ +++ 8 0,848 Đỏ +++ Nhận xét:
- Khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại λ=366nm, SKĐ cắn phân đoạn n- hexan của lá hiện nhiều vết phát quang nhất, sơ bộ có 8 vết, trong đó có 3 vết màu đỏ đậm rõ. Thân và rễ số lượng các vết ít hơn.
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại tại bước sóng λ=254 nm
- SKĐ phân đoạn n-hexan của lá cho thấy 3 vết, trong đó có 1 vết đậm nhất với Rf bằng 0,865, và hai vết mờ hơn với Rf bằng 0,201; 0,767.
- SKĐ phân đoạn n-hexan của thân cũng hiện 3 vết với giá trị Rf lần lượt là 0,200; 0,777; 0,857. Các vết này có giá trị Rf tương đối trùng với Rf của các vết ở mẫu lá. Vết có Rf bằng 0,777 đậm nhất.
- SKĐ phân đoạn n-hexan của rễ cho hình ảnh hiện vết không rõ.
Bảng 3.3. Kết quả định tính cắn phân đoạn n-hexan với hệ dung môi 3 quan sát ở AST sau khi hiện màu bằng TT vanilin 1%/ H2SO4 đặc.
STT Lá Thân Rễ Rf Màu Độ đậm Rf Màu đậm Độ Rf Màu đậm Độ 1 0,106 Tím ++ 0,114 tím ++ 0,118 tím + 2 0,205 xám +++ 0,202 xám +++ 0,203 xám + 3 0,256 xám + 0,258 xám +++ 0,253 xám + 4 0,297 tím + 0,294 xám + 0,418 tím + 5 0,465 xám ++ 0,421 xám + 0,471 tím + 6 0,572 tím +++ 0,487 xám +++ 0,573 tím + 7 0,677 xám + 0,574 tím +++ 0,646 xám + 8 0,755 xám + 0,642 xám + 0,683 xám + 9 0,842 xám +++ 0,681 xám + 0,841 xám + 10 0,899 xanh ++ 0,840 xám +++ 0,897 xám + Nhận xét:
Sau khi hiện màu bằng TT vanilin 1%/ H2SO4 đặc và quan sát dưới AST, SKĐ phân đoạn n-hexan của cả 3 mẫu rễ, thân, lá đều hiện nhiều vết hơn và giá trị Rf của các vết ở 3 mẫu này gần tương đương nhau.
Định tính cắn phân đoạn ethyl acetat bằng sắc ký lớp mỏng
Các hệ dung môi thăm dò:
Hệ 5: Chloroform – Ethylacetat –Acid formic (5 : 4 : 1) Hệ 6: Chloroform – Methanol – Acid formic (9 : 1: 0,5)
Hệ 7: Chloroform – Methanol – Acid formic (9: 1: 0,1) Hệ 8: Toluen- Ethylacetat – acid formic (7: 6 : 1)
Hệ 9: Toluen- Ethylacetat – acid formic (5: 4 : 1)
Sau nhiều lần khai triển cho thấy hệ 7 tách tốt nhất, SKĐ như hình
Hình 3.12. SKĐ phân đoạn ethylacetat khai triển với hệ dung môi Chloroform – Methanol – Acid formic (9: 1: 0,1)
Kết quả định tính cắn phân đoạn ethylacetat với hệ dung môi 7
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại tại bước sóng λ = 366nm thể hiện trong bảng 3.4
Bảng 3.4. Kết quả định tính cắn phân đoạn ethylacetat với hệ dung môi 7 quan sát ở ánh sáng tử ngoại tại bước sóng λ=366 nm.
STT
Lá Thân Rễ
Rf Màu Độ
đậm Rf Màu đậm Độ Rf Màu đậm Độ 1 0,266 xanh
da trời + 0,266 xanh da trời + 0,356 xanh da trời + 2 0,362 xanh
3 0,454 đỏ + 0,786 xanh da
trời +++ 0,568 xanh da trời + 4 0,501 đỏ ++ 0,849 xanh lá + 0,787 xanh da trời +++ 5 0,575 xanh da trời + 0,846 xanh lá ++ 6 0,620 đỏ ++ 7 0,908 đỏ +++ Nhận xét:
- Khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại λ=366nm, SKĐ cắn phân đoạn EtOAc của lá xuất hiện nhiều vết phát quang màu đỏ, có thể thấy rõ ít nhất 6 vết, trong đó có 3 vết phát quang rõ.
- SKĐ cắn phân đoạn EtOAc của thân và rễ chỉ thấy rõ một vết phát quang màu xanh da trời.
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại tại bước sóng λ=254 nm
Cắn phân đoạn ethylacetat của rễ, thân, lá cho hình ảnh hiện vết không rõ.
Sau khi phun thuốc thử hiện màu, quan sát ở AST
Bảng 3.5. Kết quả định tính cắn phân đoạn ethylacetat với hệ dung môi 7 quan sát ở AST sau khi phun TT vaninlin 1% / H2SO4đ.
STT Rễ Thân Lá Rf Màu Độ đậm Rf Màu đậm Độ Rf Màu đậm Độ 1 0,109 Tím ++ 0,176 Tím + 0,298 tím + 2 0,131 Tím ++ 0,297 tím + 0,425 tím +++ 3 0,168 Tím +++ 0,417 tím + 0,911 tím +
4 0,296 Tím + 0,639 tím + 5 0,386 Tím + 0,735 tím + 6 0,439 Tím ++ 7 0,489 Tím + 8 0,645 Tím +++ 9 0,733 Tím ++ 10 0,891 Tím + 11 0,953 Tím + Nhận xét:
- SKĐ cắn phân đoạn ethylacetat của rễ xuất hiện nhiều vết nhất, các vết phần lớn hiện màu tím sau khi phun TT.
- SKĐ cắn phân đoạn ethylacetat của lá hiện màu không rõ, quan sát bằng mắt thường chỉ cho thấy rõ nhất một vết màu hồng tím có Rf bằng 0,425.
Phân đoạn dịch chiết n-butanol
Hệ dung môi khai triển:
Hệ 10: Ethyl acetat: acid acetic: H2O (8:2:1)
Hệ 11: Chloroform – Ethylacetat –Acid formic (5 : 4 : 1) Hệ 12: Chloroform – acid acetic - Methanol (6 : 1 : 2) Hệ 13: Chloroform – Methanol – Acid formic (5 : 2 : 1) Hệ 14: Chloroform – Methanol – Acid formic (4 : 1 : 0,1) Hệ 15: n-butanol : Metanol : H2O (7 : 3 : 1)
Sau nhiều lần khai triển với các hệ dung môi, kết quả cho thấy hệ dung môi 14 tách tốt nhất, thu được hình ảnh SKĐ như hình 3.13.
A B C
Hình 3.13. SKĐ phân đoạn n-butanol khai triển với hệ dung môi Chloroform – Methanol – Acid formic (4: 1: 0,1)
Kết quả định tính các cắn phân đoạn n-butanol khai triển với hệ dung môi 14
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại tại bước sóng λ=366nm, thể hiện trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả định tính cắn phân đoạn n-butanol với hệ dung môi 14 quan sát ở ánh sáng tử ngoại tại bước sóng λ=366 nm
STT
Lá Thân Rễ
Rf Màu Độ
đậm Rf Màu đậm Độ Rf Màu đậm Độ 1 0,111 xanh da
trời + 0,112 da trời xanh + 0,110 da trời xanh + 2 0,219 xanh da
trời +++ 0,304 da trời xanh + 0,302 da trời xanh + 3 0,300 xanh da trời ++ 0,545 xanh lá + 0,544 xanh lá ++ 4 0,551 xanh lá + 0,623 xanh lá + 0,623 xanh lá + 5 0,630 xanh lá + 0,804 xanh
da trời ++ 0,804 da trời xanh ++
6 0,709 đỏ + 0,855 xanh lá + 7 0,802 đỏ + 8 0,856 xanh da trời + 9 0,900 đỏ +++ Nhận xét:
- Khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ= 366nm, dịch chiết phân đoạn n-butanol của mẫu lá cho nhiều vết nhất, 9 vết với 3 vết rõ. Ở mẫu thân và rễ, các vết xuất hiện tương đối ít và huỳnh quang không rõ.
- Hình ảnh trên SKĐ và giá trị Rf trong bảng cho thấy ở ba mẫu rễ, thân, lá xuất hiện khá nhiều vết trùng nhau.
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ=254 nm
Sau khi phun thuốc thử hiện màu, quan sát ở AST
- SKĐ cắn phân đoạn n- butanol của rễ xuất hiện nhiều vết nhất, các vết hầu như hiện màu tím sau khi phun TT hiện màu.
- SKĐ cắn phân đoạn n- butanol của lá, thân hiện màu không rõ.