phản ứng hóa học
Tất cả các phản ứng định tính các nhóm chất hữu cơ đều được tiến hành lặp lại 3 lần.
Định tính saponin
Cho vào ống nghiệm dung tích 20ml khoảng 1g bột dược liệu, thêm vào 5ml nước, đun sôi nhẹ, lọc dịch lọc vào một ống nghiệm to và lắc mạnh theo chiều dọc ống trong 5 phút, để yên quan sát.
Kết quả: cột bọt xuất hiện và bền trong 15 phút ở cả ba mẫu rễ, thân, lá Đơn châu chấu (phản ứng dương tính).
Phản ứng Salkowski
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn. Để nghiêng ống nghiệm 450
, cho từ từ theo thành ống nghiệm 1ml acid sulfuric đặc.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá Đơn châu chấu đều xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng (phản ứng dương tính).
Phản ứng phân biệt saponin
Lấy 2 ống nghiệm 10ml, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1 N (pH=1) vào ống thứ hai 5ml NaOH 0,1 N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dịch chiết cồn rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 3 phút. Ðể yên sau 15 phút.
Kết quả: sau 15 phút thấy cột bọt ở hai ống nghiệm đều cao ngang nhau ở cả ba mẫu rễ, thân, lá.
Kết luận sơ bộ: rễ, thân, lá Đơn châu chấu đều có saponin triterpenoid.
Định tính flavonoid
Cho 5g bột dược liệu vào bình nón, thêm 50ml cồn 900, đun cách thủy đến sôi trong 10 phút, lọc nóng. Dịch lọc thu được đem làm phản ứng định tính flavonoid.
Phản ứng Cyanidin
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết cồn, thêm một ít bột magie và nhỏ từ từ 4-5 giọt dung dịch HCl đặc. Đun cách thủy trong 5 phút.
Kết quả: Dịch chiết không chuyển sang màu đỏ ở cả ba mẫu rễ, thân, lá (phản ứng âm tính).
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết cồn, sau đó cho thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%.
Kết quả: dung dịch chuyển sang màu xanh đen rõ ở cả ba mẫu rễ, thân, lá (phản ứng dương tính).
Phản ứng với dung dịch kiềm
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết cồn, sau đó thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%. Ở cả ba mẫu rễ, thân, lá đều xuất hiện kết tủa vàng. Tiếp tục thêm 1ml nước cất, lắc đều lên.
Kết quả: tủa tan hết và màu vàng của dung dịch đậm lên (phản ứng dương tính).
Phản ứng với hơi NH3
Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết cồn lên hai miếng giấy lọc, sấy nhẹ đến khô. Quan sát dưới ánh sáng thường thấy màu vàng. Đem hơ một miếng giấy lọc lên miệng lọ amoniac đặc đã mở nút.
Kết quả: ở cả ba mẫu rễ, thân, lá, màu vàng của dịch chiết trên tấm giấy lọc đem hơ đều đậm hơn so với vết dịch chiết trên tờ giấy lọc còn lại (phản ứng dương tính).
Phản ứng diazo hóa
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vào đó khoảng 2ml dung dịch natri hydroxyd 10%, thêm vài giọt thuốc thử diazoni mới pha, lắc đều, đun nóng cách thủy trong 5 phút.
Kết quả: dịch chiết rễ, thân, lá đều xuất hiện màu đỏ gạch (phản ứng dương tính).
Định tính coumarin
Lấy 10g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 250ml, thêm 100ml cồn 900
,đun cách thủy đến sôi trong 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc. Các dịch chiết thu được đem làm các phản ứng sau:
Phản ứng mở và đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml dịch lọc + Ống nghiệm 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% + Ống nghiệm 2: để nguyên
Đun cả hai ống nghiệm trên nồi cách thủy đến sôi. Quan sát thấy:
+ Ống nghiệm 1: xuất hiện tủa đục vàng + Ống nghiệm 2: trong suốt
Thêm vào cả 2 ống, mỗi ống 1ml nước cất, lắc đều
+ Ống 1: tủa tan, dung dịch trong suốt, màu vàng của dung dịch đậm lên.
+ Ống 2: không xuất hiện tủa đục
Thêm vào ống 1 vài giọt dung dịch HCl đặc
Kết quả: không thấy xuất hiện tủa đục ở cả ba mẫu rễ, thân, lá (phản ứng âm tính).
Phản ứng diazo hóa
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết ethanol, thêm 2ml NaOH 10%. Đun cách thủy sôi trong 5 phút, để nguội, nhỏ vài giọt thuốc thử diazo mới pha.
Kết quả: dịch chiết rễ, thân, lá đều xuất hiện màu đỏ gạch (phản ứng dương tính).
Nhỏ dịch chiết ethanol lên giấy lọc, sau đó nhỏ chồng lên 1 giọt NaOH 10%. Để khô, che nửa vết chất thử bằng 1 mảnh kim loại rồi đem soi dưới ánh sáng tử ngoại ở λ = 366 nm trong một phút, sau đó bỏ vật che ra, quan sát.
Kết quả: không có sự khác biệt về cường độ màu giữa hai nửa vết chất thử ở cả ba mẫu rễ, thân, lá (phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: rễ, thân, láĐơn châu chấu không có coumarin.
Định tính glycosid tim
Cho khoảng 10g bột dược liệu vào bình nón 250ml, thêm 50ml cồn 25o
, ngâm trong 24h. Lọc dịch chiết vào cốc có mỏ, đem loại tạp bằng dung dịch chì acetat 30% đến dư, khuấy đều, lọc lấy dịch lọc vào bình gạn, chiết lấy glycosid tim bằng cách lắc với chloroform (hai lần, 8ml/ lần), lắc kỹ, để tách lớp. Gạn lớp chloroform vào một cốc có mỏ đã sấy khô, loại nước bằng Na2SO4 khan, lọc. Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô, bốc hơi dung môi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu được làm các phản ứng sau:
Phản ứng Liebermann- Bouchard
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Đặt nghiêng ống nghiệm 450, cho từ từ theo thành ống 1ml dung dịch acid H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Kết quả: ba mẫu rễ, thân, lá đều xuất hiện vòng tím đỏ ở bề mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng (phản ứng dương tính).
Phản ứng Baljet
Pha thuốc thử Baljet: cho vào ống nghiệm dung dịch acid picric 1%: NaOH 10% (1: 9) lắc đều.
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml dung dịch EtOH 900, lắc đều cho tan hết cắn.Thêm khoảng 0,5ml dung dịch thuốc thử Baljet mới pha. So với ống chứng (không có cắn).
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá dung dịch đều có màu vàng chanh, hơi đục, không có màu đỏ cam (phản ứng âm tính).
Phản ứng Legal
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml dung dịch ethanol 900, lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch natrinitroprusiat 0,5% và hai giọt dung dịch NaOH 10%.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá các dung dịch đều có màu vàng, không có màu đỏ cam đậm hơn so với ống chứng (phản ứng âm tính).
Phản ứng Killer- Killiani ( phản ứng của phần đường 2,6- desoxy)
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml dung dịch EtOH 900, lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% trong acid acetic. Lắc đều, để nghiêng ống nghiệm 450. Thêm từ từ 0,5ml dung dịch H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống nghiệm.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá đều thấy xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng, lắc nhẹ lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá (phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ: rễ, thân, lá Đơn châu chấu không có glycosid tim.
Định tính alcaloid
Chiết xuất: ở mỗi mẫu cân 5g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 250 ml. Thêm 20ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun đến sôi, để nguội, lọc. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac đặc (dùng chỉ thị màu vạn năng) đến pH= 9-10. Sau đó cho dịch lọc đã kiềm hóa vào bình gạn, lắc với Chloroform 3 lần, mỗi lần 10ml, gạn lấy lớp dung môi hữu cơ. Gộp dịch chiết chloroform lại, loại nước bằng natrisufat khan, sau đó lắc với dung dịch acid sulfuric 1N ba lần, mỗi lần 5ml. Lấy dịch chiết acid cho vào 4 ống nghiệm, mỗi ống 2ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
Kết quả: không có tủa trắng ở cả 3 mẫu rễ, thân, lá (phản ứng âm tính).
- Ống 2: Thuốc thử Bouchardat
Kết quả: không có tủa nâu ở cả 3 mẫu rễ, thân, lá (phản ứng âm tính). - Ống 3: Thuốc thử Dragendorff
Kết quả: không có tủa vàng ở cả 3 mẫu rễ, thân, lá (phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: rễ, thân, lá Đơn châu chấu không có alcaloid.
Định tính Anthranoid
Phản ứng Borntraeger
Cho 5g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml dung dich acid sulfuric 1N, đun sôi cách thủy trong 15 phút. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp, lấy dịch lọc cho vào bình gạn dung tích 125ml. Chiết bằng 5ml chloroform, gạn lấy lớp chloroform cho vào ống nghiệm, bốc hơi dung môi còn khoảng 1ml, thêm 1ml amoniac 10%, lắc đều, không thấy xuất hiện màu hồng ở lớp trên, tiếp tục thêm vài giọt natri hydroxyd 10%.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá lớp nước không xuất hiện màu hồng (phản ứng âm tính).
Vi thăng hoa
Cho 1g dược liệu vào một nắp chai bằng nhôm, đậy bằng một phiến kính, trên có để một miếng bông tẩm nước lạnh. Hơ nắp nhôm trên bếp điện trong 10 phút. Để nguội, lấy phiến kính ra soi dưới kính hiển vi.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá đều không xuất hiện tinh thể hình kim (phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: rễ, thân, láĐơn châu chấu không có anthranoid.
* Định tính các thành phần trong dịch chiết nước
Lấy khoảng 10g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 5 phút. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp. Dịch lọc để làm các phản ứng sau.
Định tính tanin
Ống 1: 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt FeCl3 5% (TT).
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá đều xuất hiện tủa xanh đen (phản ứng dương tính).
Ống 2: 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt Pb(CH3COO)2 10% (TT).
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá đều xuất hiện tủa bông trắng (phản ứng dương tính).
Ống 3: 2ml dịch lọc, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá đều không xuất hiện tủa trắng (phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: rễ, thân, láĐơn châu chấu không có tanin.
Định tính acid hữu cơ
Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2ml dịch lọc, thêm 1 ít tinh thể Na2CO3.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá đều không thấy xuất hiện bọt khí bay lên (phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: rễ, thân, lá Đơn châu chấu không có acid hữu cơ.
Định tính acid amin
Thêm vài gọt thuốc thử ninhydrin 3% vào ống nghiệm chứa 2ml dịch lọc, đun cách thủy vài phút.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá đều thấy xuất hiện màu xanh tím (phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ: rễ, thân, lá Đơn châu chấu có acid amin.
Định tính đường khử
Thêm 1ml dung dịch thuốc thử Fehling A + 1ml dung dịch thuốc thử Fehling B vào ống nghiệm chứa 2ml dịch chiết nước dược liệu. Đun cách thủy sôi vài phút.
Kết quả: + Ống nghiệm chứa dịch chiết lá và thân đều xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch (phản ứng dương tính).
+ Ống nghiệm chứa dịch chiết rễ: không xuất hiện kết tủa đỏ gạch (phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: + Lá và thân Đơn châu chấu có đường khử. + Rễ Đơn châu chấu không có đường khử.
Định tính polysaccharid
Ống 1: 4ml dịch lọc + 5 giọt thuốc thử Lugol Ống 2: 4ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol
Kết quả: + Mẫu rễ: màu ống 1 đậm hơn ống 2 (phản ứng dương tính). + Mẫu thân, lá: màu ống 1 không đậm hơn ống 2 (phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: + Rễ Đơn châu chấu có polysaccharid.
+ Lá, thân Đơn châu chấu không có polysaccharid.
*Định tính các thành phần tan trong ether dầu hỏa
Lấy 10g dược liệu cho vào bình nút mài, đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm, lọc, lấy dịch lọc để làm phản ứng.
Định tính caroten
Cho vào ống nghiệm 5ml dịch lọc, cô cách thủy tới cắn, thêm 1-2 giọt H2SO4 đặc.
Kết quả: + Ống nghiệm chứa dịch chiết lá thấy xuất hiện màu xanh.
(phản ứng dương tính).
+ Ống nghiệm chứa dịch chiết thân, rễ không thấy xuất hiện màu xanh (phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: + Lá Đơn châu chấu có caroten.
+ Thân, rễ Đơn châu chấu không có caroten.
Nhỏ 1 giọt dịch lên giấy lọc, hơ khô.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá đều không thấy để lại vết mỡ trên giấy lọc (phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: trong Đơn châu chấu không có chất béo.
Định tính sterol
Cho vào ống nghiệm 5ml dịch lọc, đem cô cách thủy tới cắn, thêm vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic. Lắc kỹ rồi để nghiêng ống nghiệm 450, nhỏ từ từ 0,5ml dung dịch acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá đều xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng (phản ứng dương tính).
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong rễ, thân, lá Đơn châu chấu bằng phương pháp hóa học
Số TT Nhóm chất Phản ứng định tính Rễ Thân Lá Kết quả Kết luận sơ bộ
1 Saponin
Tạo bọt Salkowski Phân biệt saponin
+ + + + + + Có Rễ, thân, lá- saponin triterpenoid 2 Flavonoid Cyanidin NaOH NH3 FeCl3 5% Diazo - + + + + - + + + + - + + + + Có thể có 3 Coumarin Mở, đóng vòng lacton Huỳnh quang Diazo - - + - - + - - + Không có 4 Glycosid tim Liebermann-Bouchard Legal Baljet Keller- Killiani + - - + + - - + + - - + Không có 5 Alcaloid Mayer Dragendorff Bouchardat - - - - - - - - - Không có 6 Anthranoid Vi thăng hoa Borntraeger - -
- - - - Không có 7 Tannin FeCl3 5% Chì acetat 10% Gelatin 1% + + - + + - + + - Không có
8 Chất béo Thử trên giấy lọc - - - Không có
9 Carotenoid H2SO4 đặc - - + Thân, rễ: không có Lá: có
10 Sterol Liebermann + + + Có
11 Đường khử Fehling - + + Rễ: không có Lá, thân: có
12 Acid hữu cơ Na2CO3 - - - Không có
13 Acid amin TT Ninhydrin 3% + + + Có
14 Polysaccharid TT Lugol + - - Rễ: có
Chú thích: (-) phản ứng âm tính; (+) phản ứng dương tính
Nhận xét:
Từ kết quả định tính có thể sơ bộ kết luận trong cả ba mẫu rễ, thân, lá Đơn châu chấu đều chứa saponin, flavonoid, sterol, acid amin.
Ngoài ra, trong lá còn chứa carotenoid, lá và thân đều chứa đường khử, rễ chứa polysaccharid.